分子生物终极版

1、研究生分子生物学授课内容一、病毒基因组、细菌基因组、真核生物基因组特点（三个都是重点）；一、病毒基因组特点 ：病毒是最简单的原核生物，完整的病毒颗粒包括外壳蛋白和内部的基因组DNA或RNA 1、遗传物质：(1)病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成;(2)组成病毒基因组的DNA和RNA可以是单链的，也可以是双链的;（3）可以是闭环分子，也可以是线性分子; （4）大多数DNA病毒的基因组是双链DNA分子，而大多数RNA病毒的基因组是单链RNA分子。2、基因组大小：毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小，如乙肝病毒DNA只有3kb大小 。3、含有重叠基因重叠基因即同一

2、段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子 。4、病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的，只有非常小的一份不被翻译 。5、转录产物为多顺反子。6、噬菌体（细菌病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的， 具有内含子。7、除了逆转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次逆转录病毒基因组有两个拷贝。 二、细菌染色体基因组结构的一般特点：1、遗传物质：通常仅由一条环状双链DNA分子组成。染色体DNA通常与细胞膜相连，连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异。 2、基因组大小：基因组小，但比病毒的大。 3、细菌基因组中编码顺序一般不会重叠，即不会出现基因重叠现

3、象。 4、细菌基因组中结构基因序列连续不断的排列，没有内含子，因此转录后不需要剪切加工。 5、DNA绝大部分是编码蛋白质的 。6、结构基因在细菌染色体基因组中都是单拷贝，但是编码rRNA的基因rDNA往往是多拷贝的。 7、有操纵子结构：操纵子的结构基因为多顺反子，即数个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节。数个操纵子还可以由一个共同的调节基因即调节子所调控.。三、真核生物基因组的一般特点：1、真核生物的基因组一般比较庞大，远远大于原核生物的基因组。不编码蛋白质的DNA序列多于编码区。2、真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内。体细胞内的基因的基因组是双份的（即

4、双倍体），即有两份同源的基因组。3、真核细胞基因转录产物为单顺反子。一个结构基因经过转录和翻译生成一个mRNA分子和一条多肽链。4、存在重复序列，重复次数可达百万次以上。5、基因组中不编码的区域多于编码区域。6、大部分基因含有内含子，因此，基因是不连续的。称为断裂基因。 真核生物基因组、原核生物和真核生物基因组的异同点，DNA序列类型。2、 遗传物质的信息传递原核生物和真核生物的DNA复制、转录、翻译的异同点。（转录是重点，其他自己了解大概思路）原核、真核生物RNA转录的基本过程转录起始：转录起始复合体在启动子部位形成（形成开放转录复合体） 原核生物：RNA聚合酶与启动子相互作用。 真核生物:

5、 RNA聚合酶、反式作用因子与顺式作用元件相互作用。转录延长：RNA链随着转录泡的移动得以延长 原核生物：核心酶催化(2) 真核生物：磷酸化的RNA聚合酶催化，核小体解聚。转录终止：转录终止受DNA模板上终止信号的控制 原核生物：a. 依赖因子：因子与RNA转录产物结合，结合后因子和RNA聚合酶发生构象变化，使RNA聚合酶停顿，转录停止。b. 非依赖因子：DNA模板上靠近终止处有些特殊碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的茎环结构来终止转录。 真核生物：转录终止的修饰点处切离并加尾。(3) 转录方面 1) 真核基因转录涉及核小体结构解聚过程。 2) 原核转录与翻译偶联；真核转录在细胞核

6、中进行。 3) 原核1种RNA聚合酶（2）；真核3种RNA聚合酶（I、II、III）分别负责不同基因的转录。 4) 原核RNA聚合酶直接结合启动子，转录起始的特异性主要取决于因子；真核RNA聚合酶借助基础转录因子结合启动子，转录起始的特异性主要取决于特异转录因子。 5) 原核基因转录的产物是多顺反子RNA；真核基因转录的产物是单顺反子RNA。 6) 原核mRNA不需加工；真核mRNA需加帽、加尾、剪接、编辑。真核生物DNA序列的类型（重点）1、单一序列也称单拷贝序列、拷贝顺序。在基因组中只出现一次或数次，因而复性速度很慢。单拷贝顺序中储存了巨大的遗传信息，但只有一小部份用来编码各种不同功能的蛋

7、白质。人的大多数蛋白质编码是单拷贝，当基因突变会引起遗传病。 2、重复序列重复序列是指这种DNA序列在基因组中有多个拷贝。拷贝数目有几十份、几百份、甚至几十万份。在基因组中出现十几次至106根据DNA序列重复的次数不同分为高度重复序列和中度重复序列（1）高度重复序列重复频率高，可达百万(106)以上，复性速度很快。在人基因组中约占20。1）卫星DNA序列短，一般由2200bp组成，成串排列。属于串联重复序列 重复106次以上 。在人细胞组中卫星DNA约占5-6。典型卫星DNA序列为510bp。大卫星DNA：主要分布与人染色体的着丝粒和异染色质区。按照它们的浮力密度不同，可分为、和、。小卫星DN

8、A：重复顺序为670bp的称为小卫星DNA（minisatellite DNA），在基因组的间隔序列和内含子等非编码区内； 微卫星DNA：16bp的短小重复单位，称为微卫星DNA（microsatellite DNA）如GACA、GATA、TCC、CT、CA等。在基因组中分布广泛而表现出多态性 。端粒 ：端粒是染色体的物理末端，由端粒酶加上去的，也是重复序列。人的端粒是由串联的TTAGGG重复序列组成，对染色体起保护作用，防止染色体从排、断裂等，端粒长则细胞寿命长 。2） 反向重复序列约占人基因组的5，单独或与其它重复序列散在分布于基因组中。每个基因的终止子前方都有一个反向重复序列。 3）高度

9、重复顺序的功能1参与复制水平的调节 2参与基因表达的调控 3转位作用 4同一种属中不同个体的高度重复顺序的重复次数不一样，这可以作为每一个体的特征，DNA指纹图谱。 5维持着丝粒的强度 6参与某些基因重组 7同源染色体之间的联会可能依赖于具有染色体专一性的特定卫星DNA顺序。 （2）中度重复顺序中度重复序列指在真核基因组中重复数十至数万（105）次的重复顺序。其复性速度快于单拷贝顺序，但慢于高度重复顺序。 大多数与单拷贝基因间隔排列。依据重复顺序的长度，中度重复顺序可分为两种类型。 1）短分散片段平均长度约为300bp（500bp） 拷贝数可达10万左右与平均长度约为1000bp的单拷贝顺序间

10、隔排列。 2）长分散片段长度大于1000bp，平均长度为3500-5000bp，与平均长度为13000bp（个别长几万bp）的单拷贝顺序间隔排列。 （3）多基因家族（multi gene family）与假基因：多基因家族是指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。大致可分为两类：一类是基因家族成簇地分布在某一条染色体上，它们可同时发挥作用，合成某些蛋白质。另一类是一个基因家族的不同成员成簇地分布不同染色体上，这些不同成员编码一组功能上紧密相关的蛋白质。在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，这些基因称为假基因1）rRNA基因： 2）tRNA基因的清确重复次数比较难以估计。3）

11、组蛋白基因： 4）珠蛋白基因家族： 三、基因表达调控序列（重点）原核生物（操纵子）和真核生物基因表达调控（主要正调控）的主要方式、调控元件和调控蛋白的作用（一）原核生物的基因表达调控特点1、基因以操纵子为单位进行转录 操纵子（operon）是原核生物基因的转录单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一个或一组结构基因组成。2、基因表达既有正调控，又有负调控3、既有可诱导调节又有可阻遏调节4、基因表达存在应急应答调控机制2、调控序列 原核生物基因的调控序列包括启动子、操纵基因、分解代谢物基因激活蛋白结合位点（CAP）和终止子1、启动子：结合RNA聚合酶，启动转录过程。2、操纵基因：结合阻遏蛋白，阻遏

12、RNA聚合酶的结合、转录3、CAP结合位点：结合激活蛋白，促进RNA聚合酶的结合、转录4、终止子：终止转录过程。3、调节蛋白 原核生物基因的调节蛋白都是DNA结合蛋白，通过与调控序列结合影响转录。 （1）分类：1、特异因子：即转录起始因子，决定RNA 聚合酶与启动子识别和结合的特异性；2、阻遏蛋白：与操纵基因结合，阻遏RNA 聚合酶结合、转录，产生负调控效应；3、激活蛋白 ：与CAP 位点结合，促进RNA聚合酶结合、转录，产生正调控效应。具体有乳糖操纵子、色氨酸操纵子(二)、真核生物基因表达调控特点1、调控环节更多 2、既有瞬时调控又有发育调控 3、染色质结构变化影响转录效率 4、转录调控以正

13、调控为主 5、调节蛋白种类繁多，作用机制复杂 6、转录后加工更复杂 7、转录和翻译分隔进行，存在时空隔离 8、翻译及翻译后修饰更复杂 2、调控序列 1、启动子：结合RNA聚合酶，但结合力弱，需通用转录子与之结合。2、增强子 :类似于原核生物的CAP结合位点，结合激活蛋白，提高转录效率。 3、沉默子 : 类似于原核生物的操纵基因，结合阻遏蛋白，阻遏转录效率。4、终止子：终止转录。3、调节蛋白调控真核生物基因转录的调节蛋白也称为转录因子 、反式作用因子 ，它们通过识别并结合调控序列等调控转录。分类：1、通用转录因子：是与启动子特异结合并启动转录的调节蛋白，是RNA 聚合酶转录各种基因所必需的，分布

14、在各种细胞内。2、转录调节因子：是通过与增强子或沉默子结合来调控转录的调节蛋白，其中促进转录的称为转录激活因子，阻遏转录的称为转录阻遏因子。3、共调节因子：不是直接与DNA 结合，而是通过蛋白质蛋白质相互作用改变通用转录因子或转录调节因子的构象，从而调控转录。其中促进转录的称为共激活因子，阻遏转录的称为共阻遏因子。 四、细胞通讯与信号转导信号分子-受体-细胞效应 胞内受体 膜受体（重点）：离子通道受体、单次跨膜受体、G蛋白偶联受体 作用机制（重点）信号分子-受体-G蛋白-效应酶（腺苷酸环化酶）-第二信使（cAMP）-蛋白激酶（PKA） 细胞通讯、信号转导的概念 细胞通讯：生物体内各种细胞在功能

15、上的协调统一是通过细胞间相互识别和相互作用的机制来实现的，这种机制称为细胞通讯。信号转导：是通过多种分子相互作用的一系列有序反应、将来自细胞外的信息传递到细胞内各种效应分子的过程。化学信号分子的分类化学信号分子可根据物理性质分为脂溶性化学信号和水溶性化学信号两大类。从其作用距离考虑则可分为激素、神经递质和属于旁分泌系统的细胞因子、生长因子等三大类。 受体的概念、分类、作用和特点（1）概念：受体位于细胞膜或细胞内，能特异识别生物活性分子，可与之相互结合，进而引起生物学效应的蛋白质，以及个别糖脂。 （2）分类： 膜受体和胞内受体 1)膜受体分类： 离子通道型受体 与此类受体结合的主要是神经递质，介

16、导离子通道的打开和关闭，改变膜通透性，能迅速、准确地传递神经冲动，作用时间很短。 G蛋白偶联受体 又名七次跨膜受体，胞浆面的第三个环能与鸟苷酸结合蛋白偶联，通过不同的G蛋白影响腺苷酸环化酶或磷脂酶C改变细胞内第二信使浓度，以实现跨膜信号传递。 单次螺旋跨膜受体 结构上具有一个跨膜螺旋，包括受体型酪氨酸蛋白激酶和非酪氨酸蛋白激酶型受体。2)胞内受体：多为反式作用因子，当其与相应配体（例如 类固醇激素、甲状腺素等），能与DNA的顺式作用元件结合，调节基因转录。 （3）受体作用的特点： 高度专一性、高度亲和力、可饱和性、可逆性、特定的作用模式。受体可以根据细胞定位分为细胞膜受体和细胞内受体两大类。（

17、2）细胞膜受体位于细胞膜上，与细胞外的化学信号结合之后，改变构象或活性，进而启动信号转导途径，引起细胞代谢和行为的改变。细胞膜受体包括离子通道受体、G 蛋白偶联受体、单次跨膜受体和蛋白裂解受体等。G蛋白：又叫鸟苷酸结合调节蛋白，是一类GTP结合蛋白。由、三个亚基组成， 和亚基通过共价结合的脂肪酸链尾结合在膜上。G蛋白在信号转导过程中起着分子开关的作用，当亚基与GDP结合时处于关闭状态，与GTP结合时处于开启状态。信号分子-受体-G蛋白-效应酶（腺苷酸环化酶）-第二信使（cAMP）-蛋白激酶（PKA）30、何为生物体内第二信使？主要包括哪些？第二信使：配体与受体结合后，靶细胞内转导膜外激素信号的

18、某些小分子化合物，在信息传递过程中产生放大的作用，称为第二信使。主要包括：环腺苷酸（cAMP）、环鸟甘酸（cGMP）、甘油二酯（DAG）、三磷酸肌醇（IP3）、Ca2+。激素受体G蛋白效应酶 第二信使蛋白激酶酶或功能蛋白生物学效应。值得提及的是G蛋白，为胞内信息传递蛋白，二种形式。无活性G蛋白呈三聚体形式，并与GDP结合。当G蛋白亚基与GTP结合时，亚基与亚基分离，此型为G蛋白活化型。技术复习的总思路：基本原理、基本步骤和在中医药研究中的应用（了解每一个技术的原理，下面说的很多，时间不够用，自己记一下大概的步骤就行，还有记一个例子)七、聚合酶链式反应（PCR） 目的基因获取的方法聚合酶链式反应

19、（PCR）、反转录-PCR（RT-PCR）、文库筛选和人工合成等1、样品制备 基因组DNA是从动物细胞或组织中提取。1）破碎细胞：化学法裂解细胞， 用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞 。2）用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA 。3）用有机溶剂（酚氯仿）抽提的方法除去残余蛋白质。 4）用限制性核酸内切酶消化，将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析。2、电泳分离将制备好的DNA样品在0.8%1.0%琼脂糖凝胶中电泳分离DNA。 3、DNA的变性电泳结束后，对凝胶中的DNA进行碱变性及中和处理。将凝胶置于碱溶液中浸泡，使DNA原位变性解链，形成单链DNA片段，再用中性pH的缓冲液中和凝胶

20、中的缓冲液。4、印迹将变性后的单链DNA转移到固相支持物上的过程称为印迹。5、固定 转移之后的DNA 必须固定于固相膜上。80 烘烤可以将DNA 固定于固相膜上，小剂量紫外线可以使DNA 以共价键与尼龙膜结合。6、预杂交和杂交预杂交：将固定后的DNA样品用变性的鲑鱼精子DNA等非特异性的DNA分子封闭固相膜上未结合DNA的位点，以避免探针的非特异性结合，降低杂交的本底。杂交：加入标记好的探针进行杂交。 用探针杂交液浸泡结合了待测DNA 的固相膜，温育，探针即与待测DNA 片段进行杂交。7、洗膜 用不同离子强度的漂洗液依次漂洗固相膜，除去末杂交探针和形成非特异性杂交体的探针，称为洗膜。非特异性杂

21、交体稳定性差，解链温度低，可以在比特异性杂交体解链温度低5l2 的条件下解链，而特异性杂交体不会解链。8、检测与分析杂交信号的检测方法有两种：一种是放射自显影。用于同位素或发光剂标记的核酸探针与待测DNA杂交洗膜后，将纤维素膜和X光片一起装入暗盒，使X光片曝光，冲洗后，在X光片上可见黑色条带。另一种是化学染色。可直接在膜上显色，显出杂交条带。 七、聚合酶链式反应（PCR）基本原理和基本过程及在中医药研究中的应用35、PCR的主要步骤及引物设计的基本要求PCR的主要步骤：PCR又称聚合酶链式反应，是在体外进行的DNA复制反应过程。其基本过程包括：A、双链DNA模板加热变性成单链(变性),温度95

22、度左右。B、在低温下引物与单链DNA互补配对(退火),85-90度。C、延伸：在四种DNTP底物及Mg2+存在条件下，TaqDNA聚合酶在最适作用温度（7075）下，根据碱基互补配对原则，从特异结合到DNA模板上的引物3-OH端开始掺入单核苷酸，合成新的DNA分子。引物设计的基本要求：A、引物长度一般为1530个核苷酸。B、引物中的碱基组成尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象，尤其在3端避免连续3个G或C。C、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。D、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠。E、引物与非特异扩增区的

23、序列的同源性不要超过70%，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列。F、引物与模板结合时，引物的5端可以修饰。一、基本原理PCR是在试管中进行体外DNA复制，基本原理与细胞内DNA复制相似。PCR反应是重复进行DNA复制过程，因而需要重复进行DNA模板解链、引物与模板结合、DNA聚合酶催化新生DNA合成（引物延伸），这些过程是通过控制温度来实现的，即通过改变温度引起DNA变性（denature）、退火（annealing）、和延伸（extension）过程使DNA得以复制 。二、基本步骤1、变 性PCR 过程中的解链是根据DNA 高温变性的原理，加热到9498 ，使双链目的DN

24、A 发生变性、氢键断裂解离成单链，以便作为模板与引物结合。2、退 火如果适当降低温度，序列互补的单链DNA 可以结合形成双链结构，PCR 技术中的这一步骤称为退火。当反应体系温度降到5065 时，目的DNA 模板与引物的退火（杂交）。通过控制退火条件，引物可以与目的DNA 模板准确结合，为下一步延伸做好准备。3、延 伸将反应体系温度升到7075 ，DNA 聚合酶遵循碱基配对原则在引物3端按53方向催化合成目的DNA 模板新的互补链。三、应用：逆转录PCR可以检测低拷贝RNA，常用于基因表达研究、cDNA克隆、cDNA探针制备、RNA高效转录体系构建、遗传病诊断、RNA病毒检测。逆转录PCR 可

25、以与DNA 印迹法联合，定量分析扩增产物，从而分析样品中的RNA 含量，研究基因表达。不过，逆转录PCR 灵敏度较低，属于半定量分析。八、核酸杂交技术Southern blotting、基因芯片的基本原理和在中医药研究中的应用44、核酸分子杂交的基本方法包括：Southern印迹杂交（鉴别DNA靶分子的杂交、待测核酸是DNA片段）、Northern印迹杂交（鉴别RNA靶分子、待测核酸是RNA）、斑点杂交、原位杂交和液相杂交。33、核酸分子杂交在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件下，就

26、可以在不同的分子间形成杂化双链。这种杂化双链可以再不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成，这种现象称为核酸分子杂交。Southern印迹：是DNA定性及定量分析的方法之一，过程为 提取细胞中的总DNA，用限制性内切酶水解后进行电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，用DNA探针与结合在膜上的DNA分子退火形成双链，检测靶DNA的含量。Southern印迹杂交是将电泳分离的待测DNA片段转印并结合到一定固相支持物上与探针杂交，用标记过的探针检测待测DNA的一种方法。Southern杂交技术主要用于：1组建DNA物理图谱。2.研究基因重排，变异以及基因的限制性

27、内切酶酶切片段长度多态性分析。3.用于对疾病的诊断。基因芯片技术是以斑点杂交为基础建立的高通量检测DNA 的技术。基本原理：先将大量已知序列的DNA 或cDNA 片段作为探针按照一定的阵列高密度固定于基片表面，这样阵列中的每一个点实际上代表了一种特定基因，然后与经过荧光标记的待测核酸进行杂交。用专门仪器检测芯片上的杂交信号，经过计算机分析处理，获得待测核酸的各种信息。应用：1.DNA 测序 应用基因芯片进行的DNA 测序属于杂交测序（SBH）2.基因表达研究 。3.基因诊断。4.中药研究。 九、DNA序列测定DNA序列测定就是检测DNA一级结构。DNA序列测定的主要方法有两种：双脱氧核苷酸末端

28、终止法（酶促法）和化学裂解法。两种方法都依赖于高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳能分离长达300500个环苷酸的单链寡核苷酸片段，并能分辨相互间长度仅差1个核苷酸的单链寡核苷酸链。十、重组DNA技术用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等，是基因工程技术的核心。十一、转基因技术与基因打靶技术转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的。转基因技术就是把一个生物体的基因转移到另一个生物体DNA中的生物

29、技术。常用的方法包括显微注射、基因枪、电破法、脂质体等。转基因最初用于研究基因的功能，即把外源基因导入受体生物体基因组内（一般为模式生物，如拟南芥或斑马鱼等），观察生物体表现出的性状，达到揭示基因功能的目的。基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。十二、分子生物学技术在中医药研究中的应用分子生物学技术虽然发展较晚，但已经在分子生物学、医学、药学领域得到广泛应用。在分子生物学研究中用于基因组DNA 扩增、基因分离、基因克隆、克隆鉴定、定点诱变、突变鉴定、探针制备、DNA 测序等；在医学中用于病原体检测、遗传病基因诊断、恶性肿瘤基因诊断；在法医学中用于个体识别、亲子鉴定、性别鉴定等；在中药研究中用于中药材鉴定。常用的分子生物学技术的原理、过程及特点核酸分子杂交技术：基本原理是：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中各分子间