抗糖尿病并发症醛糖还原酶抑制剂的虚拟筛选（基于SPECS分子库）

1、抗糖尿病并发症醛糖复原酶抑制剂的虚拟筛选基于 SPECS 分子库#张建羽，李哲，罗海彬*51015中山大学药学院，广州 510006摘要：醛糖复原酶抑制剂ARI通过抑制醛糖复原酶的活性，使得葡萄糖代谢途径恢复良性进而控制或治疗并发症，而成为当今治疗糖尿病并发症的新药研发热点，并相继有多种药物进入临床试验以及上市。醛糖复原酶ALR2属于醛-酮复原酶超家族中的一员，由于与体内的醛复原酶ALR1有着高度的同源性，活性口袋相似，因而目前的 ARI，一方面普遍疗效较低，缺乏良好的动力学参数，另一方面也会抑制体内 ALR1 的正常活性而产生毒副作用。因而寻找高效、对 ALR2 有高选择性的抑制剂成为 AR

2、I 研发的关键。相对于传统筛选模型，利用计算机药物辅助设计技术虚拟筛选寻找活性化合物，再进一步进行生物学实验，可大大缩短药物发现的时程。本文采用 Accelrys Discovery Studio 中的 LigandFit 和CODCKER 对接方法对小分子 SPECS 数据库中的 400,000 多个分子，基于 ALR2 的 3 个靶标分子1US0、2FZD 和 2PDK的活性结合口袋进行虚拟筛选，并采用 3H4G 代表 ALR1作为活性筛选的对照蛋白，得到了 13 个具备较好预测活性与选择性的目标小分子。本研究为基于靶标结构的药物分子设计提供了指导思想。关键词：计算机药物辅助设计；糖尿病及

3、其并发症；醛糖复原酶；虚拟筛选中图分类号：R914.220Virtual Screening of Aldose Reductase Inhibitors forDiabetic Complications on SPECSZHANG Jianyu, LI Zhe, LUO Haibin(School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, GuangZhou 510006)25303540Abstract: Aldose reductase inhibitors (ARI) can decrease the activity o

4、f aldose reductase (ALR2)and thus can be used for the treatment of diabetic complications. A variety of ARIs have beenapproved in clinical trials or in the market. ALR2 belongs to the aldo-keto reductase (AKR)superfamily of enzymes, while aldehyde reductase (ALR1), the homologous enzyme, shares ahig

5、h degree of sequence identity and similar binding-site pocket as ALR2. As a result, the existingARIs generally have side effects due to their low selectivity towards ALR1. Therefore, thescreening of new leads for ALR2 with high selectivity is the key for the development of ARI. Inthe present work, w

6、e describe a virtual screening experiment on SPECS (a database of 400, 000molecules) by using the molecular docking methods, LigandFit and CDOCKER in AccelrysDiscovery Studio 2.5.5 based on three crystal structures (1US0, 2FZD, and 2PDK), and finallyachieve a result of 13 hit molecules which exhibit

7、 strong binding affinities with ALR2theoretically and high selectivity towards ALR1.Keywords: Aldose reductase; virtual screening; CADD; Complications of diabetes0 引言近年来糖尿病的患病率呈逐渐上升的趋势。据 2021 年的一份统计报告指出，我国糖尿病患者已突破了 9 000 万，同时其治疗费用每年达 1 734 亿元人民币约 250 亿美元，糖尿病所致的直接医疗开支已经占到中国医疗总开支的 13%1。糖尿病本身可以通过胰岛素和降血

8、糖药得以治疗，但由于高血糖能够引发诸如心脑血管并发症、神经系统并发症，肾病，基金工程：高等学校博士学科点专项科研基金20210171120057、广东省自然科学基金S2021030003190作者简介：张建羽，1991-，男，学生，主要研究方向：计算机辅助药物设计。通信联系人：罗海彬，1977-，男，教授，主要研究方向：药物分子设计。E-mail: -1-眼病等，大大增加了因糖尿病并发症而导致死亡的概率。有研究说明，醛糖复原酶ALR24550在糖尿病并发症的发病机制中起到一个关键的作用，其受高血糖刺激而异常活泼并导致多种并发症。因此，醛糖复原酶抑制剂A

9、RI成为当前治疗糖尿病并发症的一个重要方向；但目前市场上该类药物较少，选择性低，且都存在较大副作用，不具备良好的药动学参数，因此需要研发新的 ARI。因此，本研究旨在通过计算机辅助药物分子设计技术2，针对 SEPCS小分子数据库，筛选出对 ALR2 具有较高选择性的和较高活性的 ARI，用于治疗、控制或减缓糖尿病并发症，进而降低由糖尿病及其并发症引起的死亡率。1 相关概念1.1药物的虚拟筛选药物的虚拟筛选 (Virtual screening for drug discovery)，是指基于药物设计理论，借助计算机技术和应用软件，采用分子对接或药效基团模型方法，从大量化合物中筛选出具有较高55

10、理论结合能力的化合物，从而快速进入药理药效实验，这样可以明显地缩短苗头化合物的发现时间，提高药物研发的效率；其阳性率一般在 5%20%，远远高于传统的高通量筛选2。1.2糖尿病并发症及醛糖复原酶ALR2葡萄糖代谢机制在目前的研究中，被认为是诱发糖尿病并发症的主要途径3-4。在人体中葡萄糖存在一个多元醇代谢途径如图 1 所示：606570图 1. 葡萄糖多元醇代谢途径Figure 1. The polyol pathway of glucose metabolism在图 1 所展示的多元醇代谢途径中, 可以看到, ALR2 是一个非常关键的催化酶-限速酶3原酶超家族，由 316 个氨基酸残基构成

11、，是一个分子质量为 35858 D 的多肽，其中含有 38%的螺旋结构和 14%的桶状结构。通过蛋白晶体研究及与配体相互作用研究，发现其活性口袋位于链的 C-末端，是一个由芳香族氨基酸、非极性氨基酸和极性氨基酸组成的疏水口袋。其中的 48 位酪氨酸 Tyr 和 110 位组氨酸 His 参与酸碱催化作用5，并且在与底物的结合过程中起到非常重要的作用，也是竞争性抑制剂重要的作用位点。其蛋白晶体如下列图 2所示。图 2. 醛糖复原酶 ALR2 的晶体结构1US0: 0.66Figure 2. The crystal structure of ALR21US0: 0.66 -2-。研究说明：醛糖复原

12、酶 ALR2 是一种复原型辅酶NADPH-依赖型复原酶，属于醛-酮还752 研究对象及方法2.1实验对象有研究说明，配体对 ALR2 的活性口袋具有较强的诱导效应，存在着较多的活性口袋构象。其中的三种蛋白晶体1US0：0.66 ；2FZD：1.08 ；2PDK：1.55 在诸多实验中，被证实可以用来代表 ALR2 因诱导效应而产生变化的活性口袋构象6，因而在实验中也采用80了这三种蛋白晶体作为靶标分子的结构。另一方面，实验中采用了醛复原酶ALR1蛋白晶体 3H4G1.85 作为对照蛋白。用以筛选出对醛糖复原酶ALR2具备较高选择性的化合物7。2.2实验方法本实验中采用对照蛋白阳性筛选法，通过设

13、立相关阈值，逐步缩小筛选范围，最终确定85对 ALR2 具备较高理论结合能力，对 ALR1 有较低理论结合能力的小分子。2.2.1虚拟筛选方法确实定目前我们已有的对接筛选程序有 Accelrys Discover Studio 2.5.5 的 LigandFit 和CDOCKER, Tripos Sybyl 7.3 的 Surflex-dock, 和 MOE2021.10 的 Dock。不同的筛选方法对不同的靶蛋白有不同的系统适应性，需采用 RMSDroot-mean-square deviation值来选择合90适的筛选程序。筛选程序结果如表 1 所示。表 1 所列的数据，红色标记的数据多为

14、 1.0 附近，说明此种筛选方法对相应的蛋白晶体具备较好的筛选系统适应性，可以较为准确地预测晶体结构中的原有小分子配体。分析表 1 的数据，发现 Accelrys Discover Studio 中的两种对接方法对于本实验的蛋白晶体具备较好的系统适应性。因而，本实验采用 LigandFit 和CDOCKER 进行虚拟筛选。95表 1. 四种对接方法 surflex-dock、MOE、Ligandfit、CDOCKER 的 RMSD 值Table 1. RMSDs of the four docking methods (surflex-dock、MOE、Ligandfit、CDOCKERMet

15、hodologysurflex-dock MOE LigandFit CDOCKERAverage RSD Average RSD Average RSD Average RSD1US0 1.34 0.55 5.10 2.45 3.65 1.36 1.10 0.212FZD 2.99 1.84 3.01 1.77 1.04 0.38 0.454 0.102PDK 4.94 2.16 4.87 1.68 1.34 1.50 3.90 1.263H4G 4.84 0.3 5.26 2.00 4.64 0.05 3.80 1.612.2.2筛选阈值确实立100本实验采用来自 DUD 数据库中 26

16、个 ALR2 配体小分子、BindingDB 中 165 个 ALR2配体小分子，7 个 ALR1 晶体蛋白原配体小分子进行相关阈值确实立。结果如表 2 所示。105110115-3-表 2. LigandFit 和 CDOCKER 的筛选阈值Table 2. The selected scores for LigandFit and CDOCKER in our virtual screening筛选阈值1US0数值2FZD 2PDK3H4G所采用的数据库应用的对象LigandFit结果筛选阈值Ligscore-PLP1-PLP2Dockscore2.45106.69105.22101.09

17、1.7790.5388.4186.582.6095.0093.3890.82DUD用于 ALR1&ALR2LifgandFit 对接结果的筛选CDOCKER 结果筛选阈值37.05 32.61 34.79 BindingDB用于 ALR1&ALR2CDOCKER 对接结果的筛选LigandFitLigscore2.19DUD用于判断分子是否对阳性筛选阈值-PLP1 86.45-PLP2 82.82Dock 82.60scoreALR1 显示阳性；CDOCKER 阳性筛选阈值 35.60PDB 上的 ALR1 所包含的配体小分子用于判断分子是否对ALR1 显示阳性2.2.3对照蛋白的阳性筛选及抑

18、制剂的选择性120人体内 ALR1 与 ALR2 同属醛-酮复原酶超家族AKR, 两者具有约 65%的氨基酸序列同源性7了 ALR2 的同时，也抑制了 ALR1 的正常活性，由于选择性低而产生毒副作用。为了使得筛选出来的活性化合物对 ALR2 具备较高选择性，本次实验采用 ALR1 的蛋白晶体 3H4G 作为对照，利用小分子对 3H4G 产生具有预测活性的打分结果作为阳性值，在命125中小分子中去除显阳性的结果，从而保证实验所得的小分子对 ALR2 具有较高的预测选择性。2.2.4热点残基分析根据文献报道8，ALR2 活性口袋的重要残基主要为 Trp20、Tyr48、His110、Trp111

19、、Phe122、CYS298 和 Leu300 等。为了进一步确定本次实验中需要重点研究及分析的结合位130135点，本文从 PDB 蛋白数据库中下载 116 个 ALR2 晶体蛋白进行热点残基分析。在 MOE 的 PILF 中导入 116 个晶体蛋白，以 1US0 氨基酸序列为基准，去除序列与 1US0不同的蛋白晶体，进一步去除无内源性小分子的蛋白晶体；每个蛋白晶体保存 1 个内源性小分子配体，经此筛选共有 59 个蛋白晶体结构进行热点残基分析。经分析得知，ALR2 的主要结合位点在于 Tyr48、His110 和 Trp111，同时 Leu300 及 B 链 C 端的氨基酸残基如 CYS2

20、98也具有重要的奉献；经文献7得知，Leu300 及链 C 端的氨基酸残基对 ARI 的选择性有重要奉献，可以认为是 ARI 作用于 ALR2 的特异性位点。3 研究过程3.1蛋白晶体预处理对从 PDB 数据库中下载得到的蛋白晶体进行水分子去除、多像异构体去除和酸分子去140除8子进行质子化处理，使得在 -N 形成 1 氢键供体；除此之外，对辅酶 NADP 中所存在的烟酰胺的芳香环添加+1 电荷，以保证对接软件最大限度模拟真实环境。-4-，且两者的活性口袋具有非常高的相似度。对于一般的 ARI 而言，往往在抑制等三项预处理；进一步对蛋白晶体活性口袋重要氨基酸残基 His110 咪唑环上的 -氮

21、原LigandFit 及 CDOKCER 的筛选LigandFit 的虚拟对接筛选145将经过预处理的晶体蛋白导入 LigandFit 程序，设置打分函数为 LigScore1、PLP1、PLP2，设定每个小分子保存对接结果打分最高的构象。运行结果如表 3 所示。表 3. LigandFit 筛选结果Table 3. Result from the LigandFit method分子库名字SPECS 数据库经阈值筛选的结果经阳性对照蛋白筛选的结果所含小分子数400 0004 0683 1201503.2.2经 ADMET 类药性分析的结果CDOCKER 的虚拟对接筛选1 95

22、5将 以 上LigandFit的 对 接 结 果 导 入 到CDOCKER程 序 ， 采 用-CDOCKER_INTERACTION_ENERGY 进行对接打分，每个小分子保存对接结果打分最高的构象9，运行 CDOCKER。运行结果如表 4 所示。155表 4. CDOCKER 筛选对接结果Table 4. Result from the CDOCKER methods筛选项 经阈值筛选的结果 经阳性对照蛋白阈值筛选结果 筛选结果 427 67 4 讨论分析本文经过以上虚拟筛选，得到了 67 个小分子化合物，而后进行结合模式分析、与已上市药物或临床研究中药物比照分析。1604.1结合模式分析根

23、据已有文献的报道以及本文的热点残基分析，具备较好预测活性的命中小分子与ALR2 蛋白晶体需满足一下条件：与 Tyr48、His110、Trp111 三个氨基酸残基至少形成一个氢键作用力；与 Trp111 存在-共轭作用。基于以上条件，对 67 个 CDOCKER 筛选结果进行结合模式的分析，得到 13 个符合此条件的命中小分子，其与 3 种 ALR2 蛋白晶体的结合165情况如表 5 所示。表 5. 13 个命中小分子与 3 种 ALR2 蛋白晶体的结合模式Table 5. Binding modes between thirteen hits and three A LR2 structur

24、es分子 ID 号相互作用情况1US02FZD2PDKH-Bonds-H-Bonds-H-Bonds-InteractionInteractionInteractionTyr48His110Trp111Trp111Trp20Tyr48His110Trp111Trp111Trp20Tyr48His110Trp111Trp111Trp20AG-690/12373383AG-690/12373386AG-690/12472597AG-690/40752021AH-487/42197325AK-918/12272134AK-968/15360839AK-968/41845152AK-968/41925

25、125AM-807/14147550AN-329/13481005AG-690/15431187AG-690/15436375-5-13 个小分子的 CDOCKER 打分结果如表 6 所示。170SPECS ID表 6. 13 个命中小分子的 CDOCKER 打分结果Table 6. The CDOCKER scores (kcal/mol) from of 13 compoundsCDOCKER_INTERACTION_ENETGY Molecular WeightAG-690/12373383 41.27 353.36AG-690/12373386 39.67 373.78AG-690/1

26、2472597 39.43 303.24AG-690/40752021 41.59 333.41AH-487/42197325 39.58 365.33AK-918/12272134 45.17 335.35AK-968/15360839 43.31 301.77AK-968/41845152 39.00 346.16AK-968/41925125 41.38 320.73AM-807/14147550 38.91 364.29AN-329/13481005 39.47 258.27AG-690/15431187 43.87 369.78AG-690/15436375 38.25 265.26

27、4.2与已上市药物或临床研究药物的比照分析目前已上市的药物包括 sorbini、minalrestat、ranirestat(AS-3201)和 fidarestat。将这些上175市的药物的分子结构包含在一个新建的分子库中，使用 CDOCKER 对三种靶标蛋白进行对接打分，并将结果与 13 个命中化合物作比照，评价这四化合物的预测活性表 7。表 7. Sorbini, Minalrestat, Ranirestat (AS-3201) 和 Fidarestat 的 CDOCKER 打分Table 7. The CDOCKER scores of Sorbini, Minalrestat, R

28、anirestat (AS-3201) and Fidarestat-CDOCKER_INTERATION_ENERGY (kcal/mol)上市药物1US0 2FZD 2PDK平均打分sorbini 30.75 26.18 31.36minalrestat 46.50 38.37 42.31ranirestat 44.91 40.01 39.69fidarestat 42.90 29.84 37.5529.4342.3941.5436.76打分均值37.53180本文中，所命中的 13 小分子的对接打分均值为 37.88，大于以上四种药物的 CDOCKER打分均值，因而所命中的局部小分子的预

29、测活性高于或偏高于已有上市药物。5 结论从 SPECS 数据库筛选得到 13 个小分子表 6，它们对 ALR2 具有较好的预测活性，185190195且与 ALR2 的结合模式符合现有研究的预测模型和 ALR2 晶体结构中的 Tyr48，His110 和Trp111 均显示出相互作用，其-CDOCKER INTERACTION ENERGY 均处于较为理想的打分区间 34.49 42.93 kcal/mol。本实验采用了对照蛋白阳性筛选的实验方法，利用 ALR1 的3H4G 晶体蛋白作为对照，从对 ALR2 的筛选结果中剔除对 3H4G 显示阳性的小分子，以确保所命中的小分子对 ALR2 具备

30、较高的选择性。所命中的小分子对 3H4G 的对接打分已低于所设阈值，仅有局部小分子与 3H4G 的 His113 存在氢键作用，因而所命中的小分子理论上对 ALR2 有较高的选择性。参考文献 (References)1 中 华 医 学 会 糖 尿 病 学 分 会 CDS 和 IDF. 糖 尿 病 知 识 - 中 国 糖 尿 病 患 者 数 居 全 球 之 首OL.2021-07-18. :/ tnbzy /html/540-56/56626.html2 李贞双,李超林.计算机辅助药物设计在新药研究中的应用J. Computer Knowledge and Technology 电脑-6-知识与

31、技术，2021， 531：8812-8813.3 黄伟, 唐灿.黄酮类醛糖复原酶抑制剂的研究进展J. 时珍国医国药,2021， 206：1470-1471.4 朱长进.抗糖尿病并发症药物-醛糖复原酶抑制剂J. Chin. J. New Drugs,2021,18,(4),303-306.2002052102155 谷娟 ,严谨 ,吴卫华 , 黄琪 , 欧阳冬生 . 醛糖复原酶的研究进展 J. 中南大学学报 (医学版 ) 2021,35( 4 ),395-400.6 Sandro Cosconati, Luciana Marinelli, Concettina LaMotta, Stefania Sartini, Federico Da Settimo, Arthur J.Olson, and Ettore Novellino. Pursuing