北京大学《药物毒理学》15 生物药物的临床前安全性评价-中文版

1、Confidential and internal use only. All content in this message is subject to works council and/or union consultations and other legal requirements.1生物药物生物药物 一般把通过基因工程、细胞工程、蛋白质一般把通过基因工程、细胞工程、蛋白质工程、工程、DNA 重组技术或其他生物技术生产重组技术或其他生物技术生产出来的药物叫做生物药物出来的药物叫做生物药物 利用微生物、细胞组织、动物毒素、寄生利用微生物、细胞组织、动物毒素、寄生虫等一些生物体作为原始

2、材料，通过生物虫等一些生物体作为原始材料，通过生物化学技术和生物工程工艺获得的具有生物化学技术和生物工程工艺获得的具有生物活性的中间产物或制剂活性的中间产物或制剂生物药物的分类生物药物的分类Protein derived Recombinant and fusion proteins Enzyme replacement therapies Cytokines Monoclonal antibodies and derivatives Peptides (hormone and other) Nucleic acid derived siRNA Oligonucleotides Gene th

3、erapies Other Cell-based therapies Vaccines Blood and tissue productsYeastCHO cellsE. ColiStructural Complexity of BiopharmaceuticalsAttributeIntervention PointBiopharmaceuticalsSmall moleculesIntracellular+Ligand-Receptor+Cell-Cell+Cell-Matrix+Biopharmaceuticals Complement Small Molecules in Access

4、ing Target Repertoires生物药物的特点（区别于化药）生物药物的特点（区别于化药） ( 1) 空间结构很复杂致使结构确定存在不完整性空间结构很复杂致使结构确定存在不完整性 ( 2) 生理结构差异导致生物活性差异生理结构差异导致生物活性差异 ( 3) 生物药物受体广泛决定其具有多功能性生物药物受体广泛决定其具有多功能性 ( 4) 生物药物是异源性大分子，具有免疫原性生物药物是异源性大分子，具有免疫原性生物药物的安全性评价特殊性生物药物的安全性评价特殊性药物研发的安全性评价药物研发的安全性评价- 循序渐进循序渐进 安全评估试验安全评估试验 基本试验基本试验 生物药物与小分子化药的

5、安全性评价策生物药物与小分子化药的安全性评价策略有何不同？略有何不同？总的基本框架是一致的v 特别需要考虑的问题特别需要考虑的问题 选择最相近的动物物种进行研究组织交叉反应性细胞因子释放免疫原性表遗传（非遗传毒性）致癌新的用药技术的安全性问题v根据根据ICH指导原则，如指导原则，如S6, M3, S9，实验应当包括，实验应当包括剂量的选择确定潜在的毒性靶器官及可复性研究确定预测毒性的指标在临床上是可以监测的风险性交流 Vaccines Gene therapy Lipoproteins Recombinant proteins Peptides Monoclonal antibodies Ti

6、ssue engineering Stem cell therapy Antisense therapy RNAi Aptamers生物药物的特别关注点：生物药物的特别关注点： 安全药理学： ICH S6: “在合适的动物模型观察可能的非预期药理活性是非常重要的。 一般用猴子作为动物模型进行研究 ICH S7A ： “对于到达高度特异性受体靶点的生物药物，在毒理学研究中评价安全药理学终点是重要的 生殖毒性 如果药理活性只有在非人的灵长类动物出现： 1. 可以在一般毒性研究中观察生育力终点和生殖器官毒性，如生殖周期和病理组织学检查。 2. 如果需要进行围生期和出生后毒性研究，则可以在猴子观察胚体

7、-胎体发育毒性，一般考虑将这两个阶段合并起来进行观察。生物药物的特别关注点：生物药物的特别关注点： 致癌性致癌性 ICH S6 对于生物药物，标准的致癌试验不适用于其评价，但是有关致癌可能性的产品特异性的评估还是需要根据以下方面来考虑进行的。临床用药时间病人的特征产品的生物学活性生物药物的特别关注点：生物药物的特别关注点： 生物药物致癌性试验生物药物致癌性试验 潜在的致癌性表遗传机制：增强细胞增殖、器官增生、干扰激素分泌、减少细胞凋亡和免疫抑制 目前登记的80个生物药物中有29个评估了致癌性或者体内/体外试验观察的生长促进效应 在这29个药物中，有10个进行了转基因动物模型或者2年的啮齿类致癌

8、试验。主要是多肽激素和生长因子致癌试验模式致癌试验模式特征特征 小分子化药小分子化药生物药物生物药物模式标准试验2-年大鼠 & 小鼠实验个案原则 啮齿类动物试验 体外/体内细胞增殖试验策略法规需求, ICH S1 科学需求, ICH S6 观察效应遗传毒性和表遗传毒性作用非遗传毒性（表遗传）作用与人类风险的关联有争议的需要更多的数据/经验 组织交叉反应性组织交叉反应性 抗体及相关产品对于人和动物组织的免疫组化标记模式 主要是针对单克隆抗体和一些相产品进行检测，目的是为了了解靶分布或者可能的靶器官目前针对这些研究的价值性还存在一定的争议会出现非特异性阳性的染色染色与体内观察到的效应或者预

9、期效应的关联度不高 细胞因子释放细胞因子释放 对于某些产品推荐使用体外实验，确定引起细胞因子释放或者细胞因子风暴的可能性 如果产品与细胞表面的受体结合并且具有激动剂活性时，该实验很重要挑战实验条件的一致性或者稳定性 结果的解释以及与人的相关性生物药物的特别关注点：生物药物的特别关注点： 免疫原性 许多生物药物在动物和人类具有免疫原性的风险 刺激产生抗药抗体（ADA）和抗人抗体 刺激其他效应功能如细胞因子，补体，溶血 免疫系统识别药物为异物，从而产生针对药物的抗体 结合性ADA几乎没有影响 清除抗体增加药物清除，减少组织的分布 中和ADA降低药物的药理活性 维持性ADA降低药物清除，延长半减期

10、与内源性蛋白的交叉反应性ADA抑制或者改变药物的功能 动物的免疫原性不能很恰当的预测人的免疫原性 动物产生的ADA有助于解释毒理学研究的结果，但是不能预测在人体的免疫原性。 在不同器官免疫复合物沉积及相关的病理学变化生物药物的特别关注点：生物药物的特别关注点：安全评估试验安全评估试验 - 生物药物与化学药物生物药物与化学药物 毒性模式毒性模式- 生物药物与化学药物生物药物与化学药物毒性研究类型毒性研究类型靶器官特性靶器官特性Small Molecule脱靶毒性由于分子小易于进入细胞可能在任何组织和细胞引起毒性常规的肾脏、肝脏、肺、骨髓、免疫器官、消化道Protein免疫复合物沉积只能进入有限的

11、细胞和组织主要影响表达作用靶的器官免疫复合物病如：肾小球肾病、血管炎，Oligonucleotide局部靶器官毒性只能进入有限的细胞和组织给药的靶器官：肾脏、肝脏、肺、骨髓影响免疫和稳态系统，如补体活化Stem Cell异常基因整合异位细胞增生和致癌性免疫原性和宿主/移植物排斥异位基因整合或者异常细胞生长畸胎瘤Vaccine过强的免疫效应局部反应影响免疫系统和稳态系统，如：过敏、补体活化、细胞因子释放给药部位局部的变化（静脉、肌肉和皮下）Troponin Levels60mg/kg靶器官和物种特异性的安全性问题靶器官和物种特异性的安全性问题 mAb 肿瘤治疗 靶安全性综述怀疑心脏，但是在重复暴

12、露毒性啮齿类研究未发现心脏毒性 无交叉反应（啮齿类） 猴子研究证实损伤效应Heart: 乳头肌纤维变性乳头肌纤维变性(H&E). 电镜显示肌间盘的损伤电镜显示肌间盘的损伤Control随着时间延长ADA可能减少药物的暴露和药理活性-可能导致长期毒性和药效研究的结果在动物试验中难以解释蛋白类药物的关注问题: 免疫原性21Anti-drug antibody(ADA)Drug mAbDrug mAbADA neutralizes drug antibody and decrease drug exposureTime (day)071421Serum Concentration ( ng/

13、mL1101001000100001stDoseADA Negative3rd DoseADA PositiveClearance ADA - Increases drug clearance and decreases exposure and tissue distributionFrom “Preclinical Development Handbook: Toxicology” - Safety Assessment of Biotechnology-Derived Biopharmaceuticals, Shane Gad Ed., 2008蛋白类药物的关注问题: 急性血清病样反应

14、重复暴露毒性研究中系统性的III型超敏反应 最初是在病人接受大剂量的外源性动物/人血清（治疗感染性疾病）出现的反应。 一般在暴露于外源血清/抗原10天后开始出现（常常是一次给药）：持续的产生抗体、抗原抗体复合物及其沉积。 发热、皮疹、出血 急性系统性炎症反应（包括较低程度的凝集性病变） 药物和ADA形成同时迅速清除 尸检缺乏内生性的疾病 免疫原性/过敏性往往在非自身蛋白的动物研究中会出现，但是不能代表在人类就会出现。(Tom Brown)23治疗性的单克隆抗体治疗性的单克隆抗体免疫复合物疾病免疫复合物疾病ControlTreated膜性肾小球肾病中免疫复合物的相关性膜性肾小球肾病中免疫复合物的

15、相关性Trend for CIC in treated groups and an association with glomerulonephropathy与人的相关性与人的相关性?动物研究的免疫原性不能用来动物研究的免疫原性不能用来预测人的情况预测人的情况 第一步第一步血液中是不是有血液中是不是有ADA药理活性减弱？药理活性减弱？受试物清除？受试物清除？第二步第二步肾小球中是不是有肾小球中是不是有IgM, IgG, 或或 C3?给药后血液中补体活给药后血液中补体活化的证据化的证据?第三步第三步在肾小球的免疫组在肾小球的免疫组化检测中能否观察到化检测中能否观察到受试物受试物? 第四步第四步v

16、肾脏或肾小球检测到肾脏或肾小球检测到受试物片段受试物片段 v免疫沉淀观察什么物免疫沉淀观察什么物质与受试物结合在一质与受试物结合在一起起(确定与确定与ADA无关无关)Yes!推测可能是推测可能是ADA免疫复合物免疫复合物介导的肾小球病变介导的肾小球病变Yes肾小球病变的探索肾小球病变的探索YesYesYesNoNoNoNoNo!ADA不参与这个病变过程不参与这个病变过程蛋白类药物的安全性关注蛋白类药物的安全性关注: 潜在的放大的药理作用潜在的放大的药理作用 mAb 肿瘤治疗肿瘤治疗 多器官的慢性结缔组织炎症影响的心脏瓣膜、非瓣膜心内膜多器官的慢性结缔组织炎症影响的心脏瓣膜、非瓣膜心内膜心肌、巩

17、膜、肌腱、韧心肌、巩膜、肌腱、韧带、骨膜和带、骨膜和 膝关节滑膜膝关节滑膜 免疫介导的，但是与免疫介导的，但是与ADA沉积相关性不高沉积相关性不高 随着剂量和时间的增加严重程度增加随着剂量和时间的增加严重程度增加Controlmitral v.Aortic v.aortaLVmitral v.High DoseHeart: Valvular EndocarditisEye: Scleritis, posterior sclera/choroidLymphoid proliferation in monkey spleens associated with a anti-CD28 monoclo

18、nal antibodyControl monkey spleen, IHC stain with CD79a for B cells Normal germinal center (GC)Control monkey spleen, HE stain. Normal-sized germinal centers (GC) and red pulp (RP)GCGCCGGCCGCGGCGCRPRPRPRPRPRPRPRPTreated monkey spleen, IHC stain with CD79a for B cells enlarged germinal center (GC) du

19、e to B cell proliferation (circle)Treated monkey spleen, HE stain Enlarged germinal center (GC) due to B cell proliferation (circle)26蛋白类药物的安全性关注问题蛋白类药物的安全性关注问题: 免疫激活免疫激活免疫激活-抗-CD28单克隆抗体在 猴子的脾脏中引起的淋巴细胞增生 Nanoparticles accumulates in macrophages and may affect macrophage functionsRat treated with a P

20、EGylated monoclonal antibody drug, HE stain. Intrahepatocyte vacuoles (arrows)Rat treated with a PEGylated monoclonal antibody drug, HE stain. Vacuoles in tubular epithelial cells (arrows)Rat treated with a nanoparticles drug, HE stain. Vacuoles or granules in Kupffer cells were nanobody conjugate (

21、arrows)Rat treated with a nanoparticles drug, HE stain. Vacuoles or granules in macrophages were nanobody conjugate (arrows)肾小管上皮细胞内空泡中的聚乙二醇结合物 27蛋白类药物的安全性关注问题蛋白类药物的安全性关注问题: 载体或者结载体或者结合物毒性合物毒性 安全性的问题： 药理效应过大 非-药理学（脱靶）毒性聚阴离子效应 在高剂量的时候通过替代途径活化补体；抑制凝集链反应（寡核苷酸适配子）免疫激活：依赖于序列信息，基元/TLR介导的免疫活化；刺激细胞因子和趋化因子产生

22、靶器官和组织蓄积-肝脏毒性、肾脏毒性和骨髓抑制血液稀释 聚乙二醇连接的寡核苷酸寡核苷酸的安全性关注问题寡核苷酸的安全性关注问题28寡核苷酸药物是较短的单链或者双链寡核苷酸药物是较短的单链或者双链DNA或者或者RNA分子分子作用机制不同10-50 核苷酸, 有时候有结合物支持(e.g. PEG)调节基因的表达/蛋白质翻译/功能Kidney Proximal tubule, oligonucleotide stainned brown (Doug Kornbrust)Rat kidney: Bluish oligonucleotide material in the cytoplasm of ep

23、ithelial cells (arrow) (John Kruger)靶器官靶器官主要是肝脏、肾脏毒性和骨髓抑制 肝毒性小鼠更为敏感 大鼠对肾脏毒性更为敏感组织蓄积组织蓄积在不同组织广泛分布常见于肝脏、肾脏和骨髓 嗜碱性粒细胞和/或空泡化寡核苷酸物质肝脏、脾脏、淋巴结和其他器官的单个核吞噬细胞肾小管上皮细胞寡核苷酸药物的安全性关注问题寡核苷酸药物的安全性关注问题: 组织蓄积组织蓄积29 Distribution of an antisense oligonucleotide多能干细胞能够无目的性的自我更新和分裂多能干细胞能够无目的性的自我更新和分裂 胚胎干细胞胚胎干细胞 胚胎源性内细胞团胚胎

24、源性内细胞团 成年干细胞成年干细胞 血液、骨髓、脂肪、脐带等血液、骨髓、脂肪、脐带等 可诱导干细胞可诱导干细胞- 在体外可以诱导分化成成年在体外可以诱导分化成成年细胞细胞 干细胞可以分化成许多不同的细胞类型：内胚干细胞可以分化成许多不同的细胞类型：内胚层、中胚层和外胚层层、中胚层和外胚层 生物药物研究的重要工具生物药物研究的重要工具共同的安全性问题：共同的安全性问题： 免疫原性免疫原性 细胞迁移和移植细胞迁移和移植 畸胎瘤和异位性组织形成畸胎瘤和异位性组织形成干细胞治疗药物的安全性问题：干细胞治疗药物的安全性问题：Embryonic stem cells Adult stem cells In

25、ducible stem cells 30体内畸胎瘤实验体内畸胎瘤实验一个物种即可一个物种即可标准组织的组织病理学检查，注射部位和靶器官标准组织的组织病理学检查，注射部位和靶器官 干细胞的生物学分布，其它毒理学和病理学终点干细胞的生物学分布，其它毒理学和病理学终点生物学分布生物学分布-测定异常分化细胞的组织病理学检查中干细胞的存在测定异常分化细胞的组织病理学检查中干细胞的存在情况情况在组织中标记干细胞在组织中标记干细胞人特异性抗原的免疫组化人特异性抗原的免疫组化利用原位杂交观察人特异性的利用原位杂交观察人特异性的Alu DNA序列序列利用原位杂交观察全着丝粒利用原位杂交观察全着丝粒DNA序列序列聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）利用整体动物生物荧光技术利用整体动物生物荧光技术 干细胞治疗药物的安全性问题