methuosis是一种新的蛋白酶独立细胞死亡的形式

1、对吲哚类查耳酮作为新型非细胞凋亡形式Methuosis的诱导剂的合成和评价methuosis是一种新的蛋白酶独立细胞死亡的形式，从胞吞胞吐派生的空泡的大量积累，最终导致细胞脱离底层和裂开。最近，我们描述了1查耳酮化合物，3 - 2 - 甲基-1H-吲哚-3 - 基-1 - 4 - 吡啶基-2-丙烯-1-即，MIPP，它可以诱导methuosis在神经母细胞瘤和其他类型的癌细胞发生。在此，我们描述了直接相关化合物库的合成及构效关系，供应了深化了解两个芳环系统的奉献，并强调了一个强有力的衍生物，3 - 5 - 甲氧基-2 - 甲基-1H-吲哚-3 - 基-1 - 4 - 吡啶基-2-丙烯-1-即，

2、MOMIPP在微摩尔浓度这样低的浓度下可诱导methuosis。我们也分析了叠氮衍生物的生物活性，可能有助于旨在用光亲和标记技术鉴定蛋白质目标MOMIPP的将来商量。这些商量的潜在意义通过发现MOMIPP有效地降低了替莫唑胺耐药性胶质母细胞瘤和阿霉素耐药乳腺癌细胞的生长活性而不断被重视。因此，它可能可以作为一种能够在癌症中通过methuosis形式来促进细胞凋零的药物原型，这种原理与传统细胞死亡如细胞凋亡的机理不同。介绍尽管在开展中国家针对特有的某些类型的癌症细胞的调控途径的治疗药物有了最新进展，很多肿瘤术后帮助治疗的重要支柱仍然是辐射和DNA烷化剂。一个例子是高度恶性脑肿瘤，胶质母细胞瘤GB

3、M，在现行标准的护理是手术，在可能的情况下，也会有辐射和口服替莫唑胺TMZ网站的帮助治疗。1后者方法的一个限制是，他们以通过破坏DNA而引发内在的凋亡途径的形式工作。2由于GBM细胞通常在海港抑癌基因的突变例如，PTEN，P53，PRB，他们是相对不敏感的凋亡刺激。3，4此外，胶质母细胞瘤细胞通过提高他们修复DNA损伤的能力而获得对烷化剂的抗药性。5我们信任，有可能开发新的方法通过诱导可替代的非细胞凋亡的细胞死亡形式来治疗这类有抗药性的癌症，这种细胞死亡形式不以DNA损伤作为触发。为此，我们定义了一个独特的细胞死亡的形式称为“methuosis6,7methuosis的特点是大局部细胞的细胞质

4、空间以从macropinosomes派生空泡形式产生位移。6后者当膜皱褶伪足附上很多口袋状细胞外液，并内化时形成。在methuosis8，9，回收的减值和溶酶体导向贩运macropinocytotic囊泡的作用把他们锁定在中间阶段，在此他们融合而逐步形成较大的液泡。这最终导致代谢活动削减，细胞膜裂开。6这种死亡被认为是非细胞凋亡形式，由于其并非伴随着核染色质浓缩，细胞出泡，或核小体DNA片段。methuosis也是caspase独立的，由于它不能被广谱蛋白酶抑制剂如ZVAD-FMK阻止。Methuosis本质特点在于GBM细胞，它是被激活的Ras和Rac GTP酶异位表达而触发这种形式的细胞死

5、亡的场所。然而，利用这种特别规的细胞死亡途径杀死那些不易细胞凋亡的癌细胞的潜力取决于分子是否可以诱导methuosis druglike属性识别。最近，我们描述了一个原型查耳酮相关化合物，它能在抗TMZ和非抗GBM细胞以及来自乳腺癌，结肠癌，胰腺的其他癌症细胞系以带有methuosis的特征形式来诱导细胞死亡10。在此，我们报告了相关化合物库合成及构效关系SAR的商量从而导出1定义的主要特点，为诱导methuosis活动，2确定改进生物活性的衍生物以及开展一个可能适合在将来目标识别工作中用作光亲探测器的叠状类似物做筹备。结果SARs由于我们开头寻求可能引发methuosis的 druglike

6、小分子，我们注意到Kirchhausen和同事11写的一个报告，他们描述了被称为vacuolin-1的分子及一些其他三嗪类化合物，这些化合物能够抑制Ca2+依靠溶酶体胞吐。虽然这些化合物能诱导标记的细胞空泡化，他们并没有引起细胞死亡。然而，在本报告中包含的信息中，一种结构独特的诱导液泡的化合物我们的注意，由于它相像的一类分子称为查耳酮。这种化合物的结构被描绘在图1化合物1。查耳酮由一个1,3 - 二苯基-2 - 丙烯-1框架组成，这种框架是黄酮类天然产物的前体组成。然而，查耳酮已长期被广泛应用于描述很多在此框架内建立的合成衍生物。几种查耳酮12已发现有显着的抗癌活性，但尚未被报道能诱导细胞空泡

7、化。12-14 这促使我们疑心化合物1可能代表了一种新型的查耳酮，它可以通过诱导methuosis杀死癌细胞。我们发现，化合物1几个小时内在胶质瘤细胞引起广泛空泡，48小时内造成细胞活力的重大损失。10化学数据库的检索发现了相像性 75的其他化合物。其中，化合物2图1被选定做进一步商量。它引起的空泡比化合物1引起的更大、更多。化合物2被安排的缩写是MIPP，即3 - 2 - 甲基-1H-吲哚-3 - 基-1 - 4 - 吡啶基-2-丙烯1。 MIPP的生物效应的简略评价说明，这种化合物诱导细胞死亡的形式与methuosis的数据图表相匹配。10此外，MIPP在抑制对TMZ有高抗的GBM细胞的生

8、长和活力方面也特别有效。 10Figure 1. Structures of compounds 1 and 2, initially found to be active inducers of methuosis(10) as compared with commercially available analogues 38, which failed to induce the hallmarks of methuosis in culture U251 GBM cells.由于需要MIPP的浓度10M才能有效诱导methuosis，所以我们开头组装MIPP相关化合物库，并与经效能提高确

9、实定的目标类似物进行初步特区的比拟。我们首先从比拟MIPP和市售的几个相关化合物图1化合物3-8诱导methuosis的活性开头。当在U251 GBM细胞中添加浓度为10m时，后者没有触发细胞空泡化。1-8化合物图1的检验说明，吲哚和吡啶环之间的特有关系很可能在一些特定活动中起到重要作用。简略来说，化合物1有效与化合物7无效的比拟说明吡啶环的重要性，由于当用段 - 甲氧基苯基环化合物来代替它时呈现无效。因此，一种类似物的初始构成被合成，以用来商量调查吡啶氮的位置对生物活性的影响。，-不饱和酮的核心根底类似物可以由吲哚-3 - carboxaldehydes和芳酮的Claisen-Schmidt

10、缩合制备。15苯乙酮或各种乙酰吡啶，吲哚-3 - 甲醛的缩合反响产生化合物9-12图1A。这些化合物依据三个标准与浓度为10M的MIPP进行了活性比拟：1在24和48 h借助相差显微镜进行活细胞的形态空泡评估; 248小时时结束用3 - 4,5 - 二甲基-2 - 基-2,5 - 二苯基溴化四唑MTT法对细胞存活率评估，并在第一个24小时;后添加新奇化合物。348小时暴露在这些化合物中的细胞上显示细胞集落形成方式2周为限。这一分析结果见表1说明，第一个吡啶环的氮取向是其是否具有活性的一个关键特征。元和正射类似物10和11，以及苯乙酮类似物9，均在诱导methuosis方面与MIPP相比相对无效

11、。相比之下，去除MIPP吲哚环化合物122 - 甲基，虽削减但并未消除活性。Scheme 1. Synthesis of Analogues of MIPP (Compound 2)aaThe specific substituents at R1, R2, R3, and Ar for each numbered compound are listed in the chart. For AD, the specific conditions and reagents were as follows: (A) piperidine, CH3OH, reflux, 1989%. (B) BBr

12、3, CH2Cl2, 78 C, 61 and 95% for 15 and 21, respectively. (C) POCl3, DMF, 0 C, 90%; piperidine, CH3OH, reflux, 89%. (D) NaH, CH3I, DMF, RT, 82%.Table 1. Summary of SAR Studies Performed on MIPP (Compound 2) and Related Compounds Generated in Schemes 1 and 2Table * Results are expressed as percent of

13、controls that received vehicle alone (DMSO). Values are the mean SD of quadruplicate (MTT) or triplicate (colony formation) determinations.接下来，我们分别用市售5 - 甲氧基和5 - 苄氧基吲哚-3 甲醛筹备化合物13和14来探究吲哚环的5位上基团的官能团作用。5 - 甲氧基化合物13，反过来用BBr3甲基化形成5-OH的化合物15图1B。如表1所示，尽管他们在短期的增长/可行性实验中细胞毒性不全都。但当在集落形成实验和细胞形态方面比拟时,化合物13和14

14、的活性类似MIPP。相比之下，5 - 羟基取代化合物15在全部的检测中表现出的生物活性却大大降低。为了确认吡啶氮的位置仍然是5 - 甲氧基取代的化合物活性的关键，类似物16和17被分析。假设其失去活性那么证实吡啶氮见表1的必要性。由于比拟化合物12-15与MIPP说明吲哚环5位和2位的转变都会影响活性，我们从市售2 - 甲基-5 - 甲氧基吲哚动身合成了2 - 甲基-5 - 甲氧基类似物。我们通过Vilsmeier-哈克甲酰化2 - 甲基-5 - 甲氧基吲哚合成了关键中间体18，接着与4 - 乙酰吡啶耦合出化合物19图1C。无论是在MTT法的可行性分析还是在克隆形成实验中，这种化合物的抑制活性

15、超过MIPP见表1。此外，甲基吲哚氮的化合物13与NaH/CH3I在二甲基甲酰胺DMF方案1D制造20时产生了一种化合物，它能诱发一些胞质空泡化，但只有温和影响细胞活力见表1。因此，比拟化合物13，19和20后，我们明白当吲哚1、2位分别被H和甲基占用时，其取得最正确的活性。5-OH的化合物21，由BBr3去甲基化的191B方案形成，与5 - 甲氧基化合物19见表1相比，其表现出在活性上的显着降低与先前观察到的5-OH在化合物15的不利效果全都。在生理条件下使用MIPP的局限性之一是其在水溶液中始终有肯定溶解度。因此，我们做了一组在生理PH时增加极性的实验，用来探讨转变过的吲哚5位基团所带来的

16、影响。由于我们以前的SAR商量说明，吲哚环的5位基团有肯定随机性比拟化合物13和14，所以我们设计了一个14的类似物，增加了电荷和吲哚2位上的一个甲基。我们设想，OH类似物21可被甲基4 - 溴甲基苯甲酸烷基化，然后被其酸水解，从而产生一种在pH=7.4时的高水溶性类似物。然而，我们有些吃惊，没有明显的产品，可以由21直接烷基化生产。我们在不同pKa值的多个基地进行了筛选，从K2CO3到Cs2CO3，以及乙胺，tetramethylguanidine，1,8 - 二氮杂双环5.4.0-螺-7烯DBU，氢化钠。我们在全部的反响中对在吡啶氮发生的烷基化反响进行了观察。强如TMG和NaH的，即使使用

17、1当量，也产生可观的吲哚的N-烷基化以及吡啶，吲哚羟基烷基化等反响。单被烷基化产品的产量在5-吲哚的地位是微缺乏道的。因此，一个新的路线即在引入吡啶基团方案2前官能化吡啶就产生了。市售的2 - 甲基-5 - 甲氧基吲哚被BBr3甲基化产生22。 4 - 甲基-溴甲基苯甲酸烷基化产物在相转移条件下用于合成单 - O-被烷基化产品23。16经过POCl3/DMF的甲酰化处理，中间体24和25被独立制备。相关反响在温和条件根底下碳酸氢钠生产了酯24，而在5 N的氢氧化钠条件下产生酸25。4 - 乙酰吡啶的缩合产生了相应的产物26、27。然而，在神经母细胞瘤的实验测试发现，既不是26也不是27诱导me

18、thuosis见表1。Scheme 2. Analogues with 5 Modifications of the Indole Ring Generated by Functionalizing the Indole Prior to Introduction of the Pyridine MoietyaaConditions and reagents: Compound 22: BBr3, CH2Cl2, 78 C, 93%. Compound 23: methyl-4-(bromomethyl)benzoate, NaOH, TBAB, CH2Cl2, RT, 63%. Compou

19、nd 24: (1) POCl3, DMF, 0 C; (2) NaHCO3, 90%. Compound 25: (1) POCl3, DMF, 0 C; (2) 5 N NaOH, 99%. Compound 26: 4-acetyl-pyridine, piperidine, MeOH, reflux, 34%. Compound 27: 4-acetyl-pyridine, piperidine, MeOH, reflux, 21%.化合物19MOMIPP与化合物2MIPP生物活性比拟上述商量确定化合物19是最有力诱导methuosis的化合物。此后，我们将3 - 5 - 甲氧基-2

20、- 甲基-1H-吲哚-3 - 基-1 - 4 - 吡啶基-2-丙烯-1这种化合物缩写为“MOMIPP。 MOMIPP与化合物2MIPP高生物活性在商量U251胶质瘤细胞中被证实，商量中我们接受MTT法的可行性分析，细胞生长实验，形态评估，和集落形成实验来比拟MOMIPP和MIPP。图2A显示的是药物对细胞活力的影响的剂量反响曲线。分别添加每个化合物到指定的浓度，保持2天，并且在第一天后要补充原料。MOMIPP与MIPP的IC50分别为1.9微米与4.8微米。为了获得对每个化合物的活性持续比拟的方法，我们通过连续三天对在2.5，5，或10M的化合物处理下培育的细胞数量图2B进行计数的方法来评估它

21、们对细胞的生长和生存的影响。与可行性商量不同的是，在这些实验中，该化合物在商量开头时被添加，并没有持续的补充。在这些条件下，MOMIPP显然在削减细胞的生长和降低细胞活性方面比MIPP更有效。在用MOMIPP处理的组中细胞数量的削减以大规模早期细胞空泡的消失和底层非活性细胞的损伤的形式表现。与此相反，用MIPP处理的细胞最初在第1天和第2天经历过空泡阶段，却表现出恢复趋势，尤其是在2.5M浓度下图3A。这些商量说明，单独作用时，MOMIPP比MIPP对细胞形态和细胞活力的影响更持久。当用集落形成实验来评估细胞增殖能力和长期活力时，MOMIPP和MIPP的区分就表现特别明显图4。当细胞处理2天时

22、，MOMIPP显然在削减细胞集落形成方面比MIPP有效图4A。如果处理被缩短到4小时，MOMIPP还是较MIPP有效，但都需要更高的浓度以削减集落形成图4B。Figure 2. Comparison of the effects of MOMIPP (compound 19) and MIPP (compound 2) on growth and viability of U251 GBM cells. (A). One day after plating the cells in 96-well dishes, MOMIPP () or MIPP () was added at the in

23、dicated concentrations. Controls consisted of cells in parallel wells treated with an equivalent volume of vehicle (DMSO). Medium containing fresh compound was added after 24 h, and MTT assays were performed after a total 48 h of treatment. Each point represents the mean (SD) from four separate well

24、s, with the results expressed as percent of the mean of the parallel control wells. (B) U251 cells seeded in parallel 35 mm dishes were treated with MOMIPP (), MIPP (), or an equivalent volume of DMSO (), and cells were harvested for counting on each of three consecutive days. Each point is a mean S

25、D from three separate cultures.Figure 3. Comparison of the abilities of MOMIPP and MIPP to induce the morphological hallmarks of methuosis. One day after plating, U251 GBM cells were treated with MOMIPP or MIPP at final concentrations of 2.5 (A) or 10 M (B). Controls received an equivalent volume of

26、 vehicle (DMSO). Cells were observed by phase contrast microscopy on three sequential days after addition of the compounds, without changing the medium or replenishing the compounds. Methuosis is characterized by extensive accumulation of phase-lucent cytoplasmic vacuoles, with eventual cell roundin

27、g and detachment from the substratum as viability Figure 4. Comparison of the abilities of MOMIPP and MIPP to inhibit survival of U251 GBM cells in colony-forming assays. (A) Cells were plated for colony-forming assays as described in the Experimental Section. One day after plating the cells, MOMIPP

28、 () or MIPP () was added to the medium at the indicated concentrations, and cells were maintained in the presence of the compounds for 48 h. Thereafter, the compounds were removed, and colonies 50 cells were counted after 2 weeks. Each point represents the mean (SD) from three separate dishes, with

29、the results expressed as percent of the mean of the parallel control dishes containing DMSO. (B) The effects MOMIPP () and MIPP () on colony formation were compared as in panel A, except that cells were exposed to the compounds for only 4 h instead of 48 h.为了确定诱导methuosis的化合物针对抗TMZ的神经母细胞瘤是否有效，我们使用以前

30、生成的根本上不受浓度高达100微米TMZ影响的抗TMZ胶质瘤细胞系10图5A如图5b所示，MIPP和MOMIPP能够诱导methuosis和降低抗TMZ细胞的细胞活性，但MOMIPP的效能明显优于MIPP。MOMIPP通过methuosis形式杀死有抗药性的肿瘤细胞的能力并不仅仅局限于胶质母细胞瘤。例如，我们观察到类似情况，MOMIPP在亲代和抗阿霉素的MCF-7乳腺癌细胞图5C，D引起空泡并导致其集落形成能力的降低。为了确定对肿瘤细胞造成最大限度毒性作用的浓度的MOMIPP是否也会对正常细胞产生毒性，我们用10MMOMIPP处理人类乳腺上皮细胞HMEC。图5E所示，在参加MOMIPP后24小

31、时内HMECs进行大范围的细胞质空泡化。到48小时，细胞活力削减约40，而在类似的细胞密度下同期处理的MCF7乳腺癌细胞削减了70图5F。为了进一步评估MOMIPP对正常细胞的影响，我们把化合物应用到人体皮肤成纤维细胞。在全部其他细胞测试实验中，到24小时10MMOMIPP明显诱导成纤维细胞空泡化图5G。与HMECs类似，接种在适宜密度来保持指数增长的正常成纤维细胞在接触到MOMIPP 48小时时，表现出生存能力下降40的特点。然而，当纤维母细胞接种在一个较高的初始密度，使他们在MOMIPP参加时以形成固定相，那么细胞活性根本上不受影响图5H，即使细胞发生空泡未显示。这些观察说明，虽然MOMI

32、PP会对正常细胞产生毒性，但与癌症细胞系，如U251和MCF7相比，正常细胞对这类化合物相对不太敏感。MOMIPP对亚融合与融合的成纤维细胞的影响差异供应了一个可能的解释，这意味着，以空泡为典型的内体贩运的中断可能在不分裂的细胞中比在正常增殖的细胞中具有相对较好的耐受性。 Figure 5. MOMIPP effectively inhibits the viability of drug-resistant GBM and breast cancer cells. (A) TMZ-resistant U251 glioblastoma cells (U251-TR) were derived

33、 as described previously.(10) The graph, reprinted from ref 10 with permission, shows that in contrast to the parental U251 cells, the viability of U251-TR cells is not reduced by treatment with TMZ. (B) The U251-TR cells were treated with the indicated concentrations of MIPP or MOMIPP for 48 h and

34、then subjected to colony-forming assays as described in the Experimental Section. Each point is based on colony counts from three dishes (mean SD), with the results expressed as percent of the mean from parallel control dishes treated with an equivalent volume of vehicle alone (DMSO). (C) Parental a

35、nd doxorubicin-resistant (DoxR) MCF-7 breast cancer cells(56) were treated with 10 M MOMIPP for 24 h and then examined by phase-contrast microscopy. (D) Long-term viability of parental or DoxR MCF-7 cells was assessed by colony-forming assay after a 48 h of treatment with the indicated concentration

36、s of MOMIPP. The results are the mean SD of determinations performed on three parallel dishes. (E) Normal HMECs were treated with 10 M MOMIPP or an equivalent volume of DMSO (control) and examined by phase-contrast microscopy after 24 h. (F) MCF-7 cells or HMECs were plated in 96-well plates. After

37、48 h, while the cells were still subconfluent, fresh medium containing 10 M MOMIPP or an equal volume of vehicle (DMSO) was added. MTT viability assays were performed at a 48 h end point. Values are the means (SD) from four separate wells. (G) Normal human skin fibroblasts were treated with 10 M MOM

38、IPP or an equivalent volume of DMSO (control) and examined by phase-contrast microscopy after 24 h. (H) Normal human fibroblasts were seeded in 96-well plates at subconfluent density (1000 cells/well) or confluent density (10000 cells/well). After 24 h, fresh medium containing 10 M MOMIPP or an equa

39、l volume of vehicle (DMSO) was added. MTT viability assays were performed at a 48 h end point. Values are the means (SD) from four separate wells.潜在的光亲探针的合成及生物活性我们SAR的商量说明，MIPP或MOMIPP例如，修改吡啶环结构的特别微小的变化可以消除他们诱导methuosis的能力。虽然查耳酮被普遍认可为亲电试剂，诱导methuosis所需的结构特异性的严格要求说明，MIPP和MOMIPP的直接影响最有可能源于它们与一个或多个不同的靶分

40、子之间的相互作用。几个关于通过亲电化合物进行特定蛋白质修改的例子已有报道见商量。因此，今后的一个重要目标是确定能诱导methuosis的查耳酮的靶目标。确定药物靶点的一个常用的方法是亲和层析。然而，在这一点上，我们的SAR商量还没有发现任何非本质的数据库，可以链接到一个庞大的亲和标签库例如，生物素或拴了没有失去活性的坚实基体。因此，我们致力于制备用活性基团微小改进的具有生物活性的类似物，这可能对亲光性的药物靶标发现工作有肯定意义。18最初，我们设计了一个MIPP的苯甲类似物作为潜在的光亲和探针。苯甲酮是常常被纳入靶目标识别商量的活泼分子。在化合物14的结构的根底上，我们假定5苯甲酰类似物可能保

41、存了作为光亲和探针的活性和功能。二苯甲酮类似物化合物，苯甲酰MIPP30用两个步骤制备，首先从2 - 甲基吲哚的VilsmeierHaack中间体图3A酰化开头。该系统已被证明能用甲基化的吲哚直接酰化5 - 6位。在我们的实验中，2 - 甲基吲哚的VilsmeierHaack中间体经酰化后产生比例分别为1:3的5- 和6 - 苯甲酰基2 - 甲基吲哚-3 - 甲醛混合物28和29。这个区域选择性的特点是一维的Overhauser核效应NOE，这在试验阶段也有陈述。该方案的其次个步骤，最后30和31两个化合物，由4 - 乙酰吡啶在哌啶条件下耦合醛形成。随后的形态和可行性商量显示，与苄衍生物化合物

42、14不同的是，当在U251细胞数据未显示测试时，没有一个苯甲酮类似物30日和31日能诱导methuosis。Scheme 3. Synthesis of 5 and 6 Azido Derivatives of MIPPaa(A) Conditions and reagents: Compounds 28 and 29: (1) COCl2, DMF, 1,2-DCE, 0 C; (2) AlCl3, benzoyl chloride, 0 C RT, 13 and 41% for 28 and 29, respectively. Compound 30: 4-acetyl-pyridine,

43、 piperidine, MeOH, reflux, 13%. Compound 31: 4-acetyl-pyridine, piperidine, MeOH, reflux, 74%. (B) Conditions and reagents: Compound 32: NaNO3, H2SO4, 0 C, 95%. Compound 33: H2, 10% Pd/C, EtOH, RT, 97%. Compound 34: (1) NaNO2; (2) NaN3, 75% AcOH, 0 C, 66%. Compound 35: POCl3, DMF, 0 C, 88%. Compound

44、 36: 4-acetyl-pyridine, piperidine, MeOH, reflux, 39%. Compound 37: NaNO3, H2SO4, 0 C, 62%. Compound 38: H2, 10% Pd/C, EtOH, RT, 99%. Compound 39: (1) NaNO2; (2) NaN3, 75% AcOH, 0 C, 53%. Compound 40: POCl3, DMF, 0 C, 69%. Compound 41: 4-acetyl-pyridine, piperidine, MeOH, reflux, 39%.芳香叠氮化合物含有常被用在光亲

45、和标记的另一种光活性基团。因此在MOMIPP的叠氮部位的结构变化较苯甲酰组化合物30叠氮部位的要小前提下，我们接下来探究叠氮化合物是否可以被添加到吲哚环的5 - 或6位而没有失去诱导methuosis活性。化合物365-叠氮MIPP的合成基于2-烷基吲哚5位的直接硝化和进一步的叠氮结构重氮化转换26见方案3B。2 - 甲基吲哚在浓硫酸条件下被选择性硝化生成产物32见试验阶段验证regiospecificity的细节，然后加氢生成胺33。温和重氮化条件下，氨基吲哚转化为芳香叠氮化合物34。叠氮化物通过甲酰化得到35，35与4 - 乙酰吡啶的浓缩产生365叠氮MIPP。此外，对 2 - 甲基-5

46、- 甲氧基吲哚进行相同反响步骤，其中硝化反响主要生成6-硝化产品37。依据相同的序列完成以上所述的反响步骤就得到416叠氮MOMIPP。365-叠氮MIPP和416 - 叠氮MOMIPP的生物活性评价说明通过判别U251细胞中细胞空泡图6a形成和集落形成的抑制作用图6B，C，这两种化合物保存了诱导methuosis的活性。虽然比不上MOMIPP，5-叠氮化合物在其生物活性方面明显优于6叠氮化合物。Figure 6. Comparison of the effects of MOMIPP (compound 19), 5-azido-MIPP (compound 36), and 6-azido

47、-MOMIPP (compound 41) on morphology and viability of U251 glioblastoma cells. (A) The indicated compounds were added to the cells at concentrations of 2.5 or 10 M, and the cells were observed by phase-contrast microscopy after 48 h. (B and C) U251 cells were treated with varying concentrations of th

48、e indicated compounds for 48 h, and long-term cell viability was assessed by colony-forming assays. Each represents the counts from three dishes (mean SD), with the results expressed as percent of the mean from parallel control dishes treated with an equivalent volume of vehicle alone (DMSO).商量- -me

49、thuosis是一种新发现的非细胞凋亡的形式，由胞吞胞吐贩运形式的转变引发，进而导致大量细胞空泡化和细胞代谢的完整性破坏。这里，我们描述了类似查耳酮的小分子MIPP，它能够在GBM和其他肿瘤细胞株中诱导methuosis。在这里，我们呈现了旨在对被称为MOMIPP的5 - 甲氧基类似物鉴定的SAR商量，这种化合物在细胞培育系统展现了更好的效能和稳定性。我们也制造了有活性的叠氮化合物，可能有助于将来旨在识别MOMIPP的蛋白质受体方面的商量。在为SAR商量效劳的化合物库形成过程中，我们进行了各种indole-3-carboxaldehydes和芳香酮在哌啶催化下的Claisen-Schmidt缩

50、合反响，从而能有效供应吲哚查耳酮。由于哌啶作为一种催化剂，我们起初在具有催化作用的大量哌啶的条件下进行了醛缩合。然而，当过量使用哌啶时，我们通常观察到更高的产量。在几乎全部情况中，产品从溶液中析出，然后用简洁冲洗的方法很容易的从多余的催化剂或起始原料中纯化出来。我们的SAR商量在探求这一类具有诱导methuosis活性的化合物需要什么分子特征方面供应了一些有益的启示。首先，关于吲哚环，氮的甲基化化合物20或去除2 - 甲基化合物13降低但并未消除活性。在5位，不同的修改有相反的结果。5 - 甲氧基化合物19岁，MOMIPP的活性大大提高，而5 - 苄化合物14与经取代的MIPP类似。相反，用O

51、H化合物21，P-甲基苄氧基酯化合物26和P-羧基苄氧基化合物27修改5位都造成活性的重大损失。总之，这些商量结果说明，将来尝试进一步提高效能，制造更多的水溶性衍生物，或将这些化合物附在亲和基质，吲哚环上的这些位置存在的敏捷性是用的。关于其次个芳基查耳酮架构系统，我们了解到，吡啶环的对位氮定位对活性是至关重要的。像2 - 吡啶化合物10，3 - 吡啶化合物11和16，吡嗪化合物17，或苯基类似物化合物9这些类似物是无效的。在对MOMIPP以methuosis诱导细胞死亡的潜在机制的思考中，一种可能性是，它可以作为亲电试剂即迈克尔受体。亲电基团使具有亲电基团的内在基质变为细胞亲核试剂，他们在药物

52、设计上不常使用，由于他们可以任意修改很多生物大分子。这可能会导致脱靶效应，包括阳性半抗原的形成。在表1总结的SAR商量显示，虽然在我们的系列中的很多化合物具有，-不饱和酮支架，也公认能作为迈克尔受体，但只有MOMIPP和其他一些化合物能在微摩尔浓度下成为methuosis有效诱导剂。因此，MOMIPP不大可能通过蛋白质的亲电改造诱导细胞死亡。它仍然是有可能的，MOMIPP可作为一个特定目标的迈克尔受体运作，并带有与特定的蛋白质构成的中介结合体分子的某些功能，并且在这里，邻近的，-不饱和酮的亲核残基如半胱氨酸可能促进共价性改造。这种特定蛋白质修改的例子已有过报道，化合物在革兰氏阳性菌中结合到受体

53、蛋白ERBB2，29TRPA1离子通道，核蛋白质KSRP/FUBP2，3130和sortase酶中。这些类型的观测促使了人们对那些通过对其特定受体的共价性改造而起效的药物的爱好的普遍高涨。被广泛归类为查耳酮的化合物已被证明通过多种机制表现出抗癌活性，包括中断p53与MDM2蛋白或HDM2的相互作用，抑制P-糖蛋白13，34，35-37和中断微管聚合。后者的化合物被设计成很多秋水仙碱的和能结合-微管蛋白的天然产品combretastatins的类似物。很多出版物已都出版证实查尔酮及相关分子可以作为抗有丝分裂剂，并且在生疏他们的SAR方面已取得实质性进展。虽然我们的能诱导methuosis的活性化合物例如，MOMIPP可划分为查耳酮类化合物，但其特定的特点与先前所描述的大多数抗有丝分裂的查耳酮类化合物完全不同。，methuosis诱导剂的严格的结构特异性和吲哚和吡啶基团特定取代模式的依靠性，区分了以前报道为抗有丝分裂剂的查耳酮类化合物和MOMIPP。我们观察到有丝分裂阻滞前用这些化合物处理的细胞没有丢失活力未公布的观察。相反，大量类似于我们用MOMIPP处理时观察到的胞内空泡在用抗有丝分裂的查耳酮类化合物处理时并没有消失。在文献中描述的全部具有细胞毒性的查耳酮类化合物中，与MOMIP