细胞治疗实验室工艺流程2

1、细胞治疗实验室工艺流程细胞治疗实验室工艺流程按种类分为 ：、试剂耗材入库记录，试剂耗材使用记录，试剂配制记录，配制的试剂使用记录 入库需 要记录产品的名称、批号、有效期、数量、存放位置、入库时间。 试剂耗材使用记录 包括名称 、批号、用途，时间。 试剂配制记录包括原料的名称 、批号，配制试剂的 时间、有效期、批号 。 配制的试剂使用记录包括使用的时间 、批号、用途。、实验记录，包括采血、分血、细胞接种、补液、质检、回输。采血有 2 个信息实验室需要记录，包括浓缩白细胞体积和血浆体积 。 分血有需要记 录使用的别离液的量和单个核细胞数量 。细胞因子添加的量细胞接种需要记录 DC 、CIK 、CD

2、3AK 、丫 T NK 等细胞接种数量、培养基体积 补液需要记录补液的时间和体积 。质检需要做细菌真菌培养、内毒素检测、革兰氏检测，记录做这些质检的时间 回输需要记录回输的细胞种类、时间、细胞体积、细胞数量。三、细胞检测记录，包括细菌真菌培养 , 内毒素检测，革兰氏检测，流式检测。 记录内容包括样品的来源、检测时间、结果、检测人。四、清洗消毒记录 包括清洗消毒的时间、方式、消毒有效期细胞培养流程图米血分血细胞计数L细胞接种00IDC细也n2小1对丿宵 洗版Z3EZ第5天加成熟剂1ciKri 15r第2天加CIK混合囚子根据细胞生长情况补液回输前3天细菌真菌培第7天收细胞、tfP细胞?：活率、细

3、咆数J 111- ：12Y 0Ii7咆i 1 tj(4* rjTT 2-nAJ jjhIr-rlui孔i前3irifr-*14 H7r回辆14、肘；r-中Vi 12-fah JULjpL *n! _工计算细胞存 活率、细胞数 后给病人 回 输NK细胞JI4J ihI Ill I生K补菽;?ffi咆: 1/* M T 11PI维C jnjF1 a- i* ! IHJTTi前3ihtr-*:“I H7厂_L回喻小闕氏染恤12t革兰 flI ji计算细胞存 活率、细胞数 后给病人 回 输其它细胞计算细胞存汕率、细胞数后给冋输NO :自体细胞制剂制备记录患者根本情况米血日期:姓名年龄性别科室病案号主管

4、医牛床号传染病临床诊断病理切片细胞制备标准操作记录分血数量单位日期操作人复核人备注自体血浆体积ml白细胞体积mlFicol体积ml批号：PBMC总量X 10DC细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、PBMC用量X1082、铺瓶板瓶板3、加DC培养液体积ml4、DC诱导因子100Xml批号：5、第五天加DC成熟剂1100Xml批号：6、第六天补加DC成熟剂2100Xml批号：7、第七八天收集 DCX107CIK细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、添加 IFN-rIU2、PBMC用量X1083、接种体积ml4、添加CIK混合因子100X ml批号：5、补液第1次1ml第2次笫3次第4次第5次

5、第6次CD3AK细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、添加CD3AK混合因子(100X)ml批号：2、PBMC用量X1083、接种体积ml4、补液第1次ml第2次第3次第4次第5次丫注田胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、PBMC用量X1092、接种体积ml3、添加YST混合因子(100X)ml批号：4、补液第1次ml第2次第3次第4次第5次NK细胞制备数量单位日期操作人复核人备注1、PBMC用量X1082、接种体积ml3、添加NK细胞混合因子100Xml批号：4、补液第1次ml第2次第3次第4次第5次细胞冻存及复苏标准操作记录细胞冻存标准操作记录日期编号细胞类型细胞数量冻存数量支冻存液编

6、号存放位置操作人复核人备注细胞复苏标准操作记录日期编号细胞类型细胞数量复苏数量支复苏用途存放位置操作人复核人备注姓名年龄性别科室病案号床号自体细胞制剂回输记录年龄性别科室病案号床号次数日期细胞类型批号体积(ml)回输方式运送人接收人复核人123456789101112131415161718自体细胞制剂检控记录次田每需存 次检:合 -口 口是否性性性性 合不 格合 格口是否性性性性 合不 格合 格口是否性性性性4是否口是否是否是否性性性性 合不 格合 合不 格合 格口性性性性 合不 格合 格口性性性性口性性性性合不 格合 格 匸 合不 格合口性性性性 合不 格合 格9是性 阳 性PE 性_ 合

7、 :格01是 甘阳 性性 口 口 阳合 性格 11是 皙阳 性性n nr合格 阳性21是I 阳性rlIPS性rl合格 阳性31是 阳阳 性性合格. 阳性，CIK 细胞培养标准操作流程溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入 56 摄氏度水浴锅内热灭活40 分钟，取出用 2500 转离心 10 分钟，取出上清备用 。2、IFN-r 母液 1000X ：用无血清培养基配成 100 万 IU/ml 。3、CIK 混合因子 100X : 冰箱 4 度保存。4、CIK 完全培 养基: 无血清培养基加 1%-2% 热灭活自体血浆 。CIK 细胞制备：1、血细胞单采机采集病人浓

8、缩白细胞和血浆 80-100ml 。2、准备 2 支 50ml 离心管 ，每管参加淋巴细胞别离液 20ml 。3、将浓缩白细胞从血袋中取出，直接等量加到上述 2 支 50ml 离心管淋巴细胞别离液上面， 2000 转 离心 25 分钟 ， 升降速调到最低值。4、取出上层的血浆收集到一支 50ml 离心管中 ,余下的局部除红细胞外全部收集到2 支 50ml 离心管中，加生理盐水到 50ml ，1500 转离心 10 分钟，去除上清，合并 2 支管内的细胞到一 支 50ml 离心 管中 ，加 50ml 生理盐水 ，取 20ul 样品用于计数， 1200 转离心 7 分钟 ，去除上 清。5、所有的血

9、浆留出 12 支 5ml 用于回输，其余全部 56 摄氏度灭活 40 分钟，灭活完成后 2500 转离心10 分钟，收集上清备用。6、将细胞用 CIK 完全培养基配成 1X10 6/m l ，参加 IFN-r 母液至 1000IU/ml ，接种 1 个细胞培养 袋， 袋 内加 200ml CIK 完全培 养基。7、24 小时后 ，按 1:100 参加 CIK 混合因子。& 第 5 天，按 4 倍稀释添加含 300IU/ml IL-2 的 CIK 完全培养基9、 第 8 天到第 9天，按 2 倍稀释添加含 300IU/ml IL-2 的 CIK 完全培养基。同时取样做细菌真 菌培养10 、 以后

10、每隔一天按 2 倍稀释补一次液，第一次回输前 1 天取样送检做革兰氏染色检查。11、等拿到细菌真菌培养结果后，检查所有结果是否为阴性。 CIK 培养到第 10 天 -15 天内回 输。12、回输时收集细胞于离心管内， 1200 转离心 7 分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再 离心 2 次， 1200 转离心 7 分钟 。13、将收集到的细胞参加到 150ml 注射用生理盐水中 ，参加 5ml 自体血浆， 2 万 IU IL-2 ，留 1ml 细 胞 悬液到 1.5ml 离心管中， 4 摄氏度存放 3 月备查。14 、 将完成的细胞悬液封好瓶口 ，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无

11、菌结 果、病区及治疗 工程，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：DC 细胞培养标准操作流程将自体血浆装在无菌的离心管内， 放入 56 摄氏度水浴锅内热灭活 40 分钟 ， 取出用 2500 转离心 10 分钟，取出上清备用2、DC 根底培 养基 : 用无血清培养基 +2% 热灭活自体血浆。3、DC 诱导剂 100X ：冰箱 4 度保存。4、DC 培养基： DC 根底培养基参加 DC 诱导剂4、 DC 成熟剂 1100X ：冰箱 4 度保存。5、DC 成熟剂 2 100X ：冰箱 4 度保存。DC 细胞制备：1、取 PBMC , 参加 IMDM 培养基配成

12、5X10 6/ml 细胞悬液，按每孔 3ml 接种到 6 孔板内，放入 培养箱2、2 小时后，取出，晃动去除上层杂细胞，留下贴壁的单核细胞(体积比其它细胞稍大 )，每 孔参加 3mlDC 培养基 。3、第 5 天，按每孔 30ul 参加 DC 成熟剂 1，取样做细菌、真菌培养。4、收集细胞前 12 小时每孔参加 30ul DC 成熟剂 2，同时取样送检做革兰氏染色检查 。5、DC 培养到第 7-8 天，收集细胞，用生理盐水洗 3 次，分成 4 份，其中一份用于当天回输 ， 其余冻 存在 -80 度冰箱中。6、将生理盐水清洗过的 DC 细胞参加到 150ml 注射用生理盐水中 ，参加 5ml 自

13、体血浆，留 1ml 细胞悬 液到 1.5ml 离心管中， 4 摄氏度存放 3 月备查。7、将完成的细胞悬液封好瓶口 ，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病 区及 治疗工程， 确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。CD3AK 细胞培养标准操作流程溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入 56 摄氏度水浴锅内热灭 活 40 分 钟， 取 出用 2500 转离心 10 分钟，取出上清备用。2、CD3AK 混合因子 (100X ) ：冰箱 4 度保存。3、CD3AK 完全培养基：无血清培养基 +1%-2% 热灭活自体血浆 + CD3AK 混合因子。CD3

14、AK 细胞制备：1、PBMC 用 CD3AK 完全培养基配成 1X10 6/ml ，接种培养瓶或培养袋培养。同时取样做细菌真菌培养2、第 5 天，按 4 倍稀释添加 CD3AK 完全培 养基。3、第 8 天到第 9 天，按 2 倍稀释添加 CD3AK 完全培养基6 回输时收集细胞于离心管内， 1200 转离心 7 分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再 离心 2 次， 1200 转离心 7 分钟 。7、 将收集到的细胞参加到 150ml 注射用生理盐水中 ，参加 5ml 自体血浆，2 万 IU IL-2 ，留 1ml 细胞悬 液到 1.5ml 离心管中 ，4 摄氏度存放 3 月备查。8、将完成

15、的细胞悬液封好瓶口 ，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结 果、病区及治 疗项 目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。Y T 细胞培养标准操作流程溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入 56 摄氏度水浴锅内热灭 活 40 分钟 ， 取出用 2500 转离心 10 分钟，取出上清备用 。2、YT 混合因子 (1 00X ): 冰箱 4 度保存。3、完全培 养基: 无血清培养基 1%-2% 热灭活自体血浆 。二、 Y T 细胞制备：1、将PBMC用完全培养基配成2X106/ml，参加混合因子，接种培养瓶或培养袋培养。2、第 5 天，按 2 倍稀释添加

16、含 400IU/ml IL-2 的完全培养基。3、 第 8天到第 9天，按 2 倍稀释添加含 400IU/ml IL-2 的完全培养基。同时取样做细菌真菌培 养。5、 等拿到细菌真菌培养结果后，检查所有结果是否为阴性。丫T 培养到第 10 天 -15 天内回输。6 回输时收集细胞于离心管内， 1200 转离心 7 分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离 心 2 次， 1200 转 离心 7 分钟。7、 将收集到的细胞参加到 150ml 注射用生理盐水中 ， 参加 5ml 自体血浆，留 1ml 细胞悬液到 1.5ml 离心管 中， 4 摄氏度存放 3 月备查。8、将完成的细胞悬液封好瓶口 ，核

17、对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病 区及治疗 工程， 确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。NK 细胞培养标准操作流程、 溶液的配置1、热灭活自体血浆的制备：将自体血浆装在无菌的离心管内，放入 56 摄氏度水浴锅内热灭活40 分钟，取出用 2500 转离心 10 分钟，取出上清备用。2、NK 细胞混合因子 100X :冰箱 4 度保存。3、完全培养基： SCGM 无血清培养基 +1%-2% 热灭活自体血浆。二、 NK 细胞制备：1、将PBMC用完全培养基配成1X10 6/ml，参加NK细胞混合因子，接种培养瓶或培养袋培养。2、第 5 天，添加 2 倍量完全培 养基， 参加 5

18、00IU/ml IL-23、 第 8 天到第 9 天，按 2 倍稀释添加含 500IU/ml IL-2 的完全培养基。同时取样做细菌真菌培 养4 、 以后每隔一天按 2 倍稀释补一次液，第一次回输前 1 天取样送检做革兰氏染色检查。1200 转离5、等拿到细菌真菌培养结果后，检查所有结果是否为阴性。 NK 培养到第 10 天 -15 天内回输。6 回输时收集细胞于离心管内， 1200 转离心 7 分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离 心 2 次，心 7 分钟。1.5ml 离7、 将收集到的细胞参加到 150ml 注射用生理盐水中 ，参加 5ml 自体血浆，留 1ml 细胞悬液到 心管中， 4 摄氏度存