欧洲药典蛋白含量测定方法

1、欧洲药典中蛋白含量的测定方法1. 欧洲药典第7版2.5.33,USP<1057>Biotechnology-derivedarticles-Totalproteinassay。EP2.5.33收录了7种检测方法，即扫描法、Lowry法、Bradford法、BCA法、Biuret法、荧光法和氮分析法。1.1 扫描法：原理：依据蛋白质结构中含有芳香族氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），其在280nm处有吸光值。检测时，如果溶解蛋白质的溶剂也有高吸光度，则采用干扰对照液进行补偿消除。但如果干扰对照液吸光值也很高，则检测结果误差大。此外，低浓度蛋白质溶液会因蛋白质吸附至检测池上而影响浓度，后者可使

2、用高浓度或用去离子去污剂处理样品。待测品：蛋白质溶液浓度一般为0.2mg/mL2mg/mL。对照品：选择合适的对照品，用溶解待测品蛋白质的溶剂配制，浓度与待测品溶液一致。检测：检测过程中，将待测蛋白溶液、对照品溶液和干扰对照液保持在相同温度。使用石英比色皿检测280nm处吸光值，并使用规定的溶液进行补偿。溶液浓度应尽可能保持在适宜范围内以便获取准确结果。光散射影响：样品引起的光散射会导致蛋白质检测结果准确度降低。如果蛋白质溶液中存在颗粒大小与检测波长（250nm到300nm）相当的颗粒，光散射将导致样品的吸光值大大增加。为了校正光散射引起的在280nm处的吸光值，则可检测待测样品在320nm、

3、325nm、330nm、335nm、340nm和350nm处的吸光值，以所得的吸光值对数值为纵坐标，以检测波长对数值为横坐标作图，并通过线性回归确定标准曲线，将曲线延伸到280nm,得到280nm处吸光值的对数，再通过反对数计算获得280nm处由光散射引起的吸光值。从检测的总吸光值中扣除光散射引起的吸光值即为样品吸光值。用0.2滤膜过滤或离心可减少光散射作用，特别是明显浑浊的蛋白溶液。计算：应使用校正过的吸光值进行计算，按下列公式进行计算。Cu=Cs(Au/As)其中，Cs为对照液浓度，Au、As分别为单侧样品和对照液的校正后的吸光值。1.2 Lowry法:原理：此方法是依据蛋白质中的酪氨酸能

4、将磷铝酸-鸨酸混合物还原，还原后物质在750nm处有最大吸收值。室温下，其颜色在2030min内最深，随后将随时间逐渐减弱。这个方法干扰物质较多，因此可使用沉淀法处理蛋白样品。多数的干扰物质产生较低颜色，一些去污剂可明显加深溶液颜色。可使用高盐沉淀法提纯蛋白。由于不同蛋白质的吸光强度不同，因此对照品应与待测品一致。如果有必要除去干扰物质，则应在样品制备前按下述的方法处理。干扰物质的作用也可通过稀释作用降低，前提是应保证样品溶度符合准确测定的浓度要求。pH以1配制溶液和试剂的水至少为蒸储水。待测品：配制适当浓度的待测样品使其浓度处于标准曲线浓度线性范围内。溶液的0.010.5为宜。对照液：用规定

5、的缓冲液溶解适量的对照蛋白，并用同一种缓冲液稀释成不少于5个浓度溶液，其浓度适宜范围为5g/ml100科g/ml。空白液：使用配制待测蛋白液和对照蛋白液的缓冲液。硫酸铜试剂：取100mg硫酸铜和0.2g酒石酸钠，用水溶解并稀释至50ml。取10g无水碳酸钠，用水溶解并稀释至50ml。缓慢将碳酸钠溶液倒入硫酸铜溶液中，混匀。24h内使用。碱性铜试剂：取1体积硫酸铜试剂，2体积50g/L十二烷基硫酸钠溶液和1体积32g/L氢氧化钠溶液混合。室温下储存，2周内使用。稀磷铝酸-鸨酸试剂：取5ml磷铝酸-鸨酸试剂和55ml水，混匀。储存在棕色瓶子中，室温保存。（注：USP中规定取10ml福林酚试剂和50

6、ml水混合。）检测：取1.0ml各对照品溶液、待测品溶液、空白对照液，加入1.0ml碱性铜试剂，混匀，静置10min。加入0.5ml稀磷电目酸-鸨酸试剂，混匀，室温静置30min。检测其750nm处吸光值，并以空白对照液作为补偿。计算：一般情况下，蛋白质浓度与其吸光值关系并不是线性的，但是如果做标准曲线的浓度范围足够小，则其曲线是线性的。以浓度为横坐标，对应的吸光值为纵坐标作图，通过线性回归得出标准曲线。由标准曲线和待测蛋白样品的吸光值即可计算得到待测蛋白样品的浓度。干扰物质：在检测前加入脱氧胆酸-三氯乙酸混合液，沉淀析出蛋白质，除去干扰物质。这种技术也可用于由稀溶液浓缩的蛋白质。具体操作流程

7、如下：加1.5g/L的脱氧胆酸0.1ml值1ml待测样品溶液。漩涡振荡混匀，室温静置10min。加入720g/L三氯乙酸0.1ml并漩涡振荡混匀。3000g离心30min,倾析出上清液并用移液器除去剩余的溶液。用1ml碱性铜试剂复溶蛋白质沉淀。1.3 Bradford法：原理：该法是基于酸性蓝90染料可结合于蛋白质上，并在470nm595nm处具有吸光值。酸性蓝90染料（USP中称为亮蓝G）主要结合蛋白质上得精氨酸和赖氨酸，而不同蛋白质上所含的精氨酸和赖氨酸不同导致对染料的反应差异，因此，对照蛋白应与被测蛋白一致。该方法极少有干扰物质，但待测蛋白溶液中也应避免含有去污剂或两性电解质。强碱性样品

8、可能干扰酸性试剂。配制溶液和试剂的水至少为蒸储水。待测品：配制适当浓度的待测样品使其浓度处于标准曲线浓度线性范围内。对照液：用规定的缓冲液溶解适量的对照蛋白，并用同一种缓冲液稀释成不少于5个浓度溶液，其浓度适宜范围为0.1mg/ml-1mg/ml。空白液：使用配制待测蛋白液和对照蛋白液的缓冲液。酸性蓝90试齐ij:取0.10g酸性蓝90染料，用乙醇（96%）溶解并稀释至50ml。加入100ml磷酸，并用水稀释至1000ml,混匀。溶液过滤（定量滤纸或Whatman1号纸）后，室温下储存与棕色瓶中。储存过程中慢慢出现沉淀，在使用前应过滤。检测：取5ml酸性蓝90试剂，加入到0.100ml各对照蛋

9、白溶液、待测蛋白溶液和空白对照溶液中，混合，翻转混匀。混合时应避免产生泡沫，否则影响实验重复性。检测其595nm处吸光值，并以空白对照液作为补偿。注意不要使用石英（二氧化硅）检测池，避免染料结合到这种材料上。计算：见“Lowry法计算”。1.4 二唾咻二竣酸法（BCA法）：原理：该法是依据蛋白质可将Cu2+还原为Cu+,而二唾咻二竣酸酸可以检测Cu+O该法干扰物质较少，可通过稀释减少干扰物质的影响，前提是保证蛋白质浓度足以满足要求；也可以使用Lowry法中蛋白沉淀法除去干扰物质。因为不同蛋白种类反应颜色强度不同，因此对照蛋白应与待测蛋白一致。配制溶液和试剂的水至少为蒸储水。待测品：配制适当浓度

10、的待测样品使其浓度处于标准曲线浓度线性范围内。对照液：用规定的缓冲液溶解适量的对照蛋白，并用同一种缓冲液稀释成不少于5个浓度溶液，其浓度适宜范围为10wg/ml1200g/ml。空白液：使用配制待测蛋白液和对照蛋白液的缓冲液。BCA试剂：取10g二唾咻二竣酸钠，20g水合碳酸钠，1.6g酒石酸钠，4g氢氧化钠和9.5g碳酸氢钠，用水溶解后，如有必要，用氢氧化钠溶液或碳酸氢钠溶液调节pH至11.25,用水稀释至1000ml并混匀。铜-BCA试齐IJ:取40g/L硫酸铜溶液1ml和50mlBCA试齐混匀。检测：分别取各对照蛋白溶液、待测蛋白溶液和空白对照溶液0.1ml和2ml铜-BCA试齐混匀。于

11、37c孵育30min,记录时间并使混合液冷却到室温。孵育结束后60min内，用石英检测池检测562nm处吸光值，并以空白对照液作为补偿。当溶液冷却到室温后，溶液颜色逐渐加深。计算：见“Lowry法计算”。1.5 双缩月尿法（Biuret法）：原理：该法是依据蛋白质在碱性溶液中可与Cu2+结合并在545nm处有吸光值。用此法检测IgG和白蛋白结果差异很小。将氢氧化钠和双缩月尿试剂一起加入，或加入氢氧化钠后混合不足，或延长氢氧化钠和双缩月尿试剂间隔时间会使IgG样品比白蛋白反应程度更强。当待测蛋白样品中蛋白质含量小于500g/ml时，前面所述的用三氯乙酸降低干扰物质影响的方法此方法中也可以使用。配

12、制溶液和试剂的水至少为蒸储水。待测品：取适量待测蛋白样品，溶于9g/L氯化钠溶液中，使其浓度处于标准曲线浓度线性范围内。9g/L氯化钠溶液稀释成不少于5（USP中规定为：除非另有规定，对照液：用9g/L氯化钠溶液溶解适量的对照蛋白，并用个浓度溶液，其浓度适宜范围为0.5mg/ml10mg/ml采用人血白蛋白为对照蛋白，其氮-蛋白质转换因子为6.25）空白液：9g/L氯化钠溶液。双缩IB剂（Biuret试剂）：取3.46g硫酸铜溶于10ml热水中，冷却（A液）。取34.6g柠檬酸钠和20.0g无水碳酸钠溶于80ml热水中，冷却（B液）。将A液和B液混合并用水稀释至200ml,6个月内使用（室温保存）。如果混合液中出现任何沉淀或浑浊则不可使用。检测：取1体积的待测溶液，加入等量60g/L氢氧化钠溶液，混匀。立即加入0.4体积双缩月尿试剂并快速混匀。于1525c间某个温度下静置15min。在