细胞培养中支原体污染

1、Mycoplasma国内主要有三种译名,医学文献译为支原体分枝原体,枝原体,类菌质体,动物医学文献译为霉形体或支原体,台湾、香港那么译为微浆菌.支原体是目前一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞型微生物.自然界分布广泛,种类多,有80余种,分为两个属：一为支原体属Mycoplasma,有几十个种；另一为月尿原体属Ureaplasma,仅有一种.与人类感染有关的主要是肺炎支原体和解月尿月尿原体.支原体无细胞壁,多呈不规那么球状、长丝状,可分枝,营寄生共生或腐生.一般侵害对象为动植物,可造成多种疾病.细胞培养特别是传代细胞被支原体污染是个世界性问题.国内外研究说明,95%以上是以下四种支原

2、体：口腔支原体M.orale、精氨酸支原体M.arginini、猪鼻支原体M.hyorhinis和菜氏无胆留原体A.laidlawii,为牛源性.国外调查证实,大约有二十多种支原体能污染细胞,有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体.支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染某些支原体在人体是正常菌群、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染、制备细胞的原始组织或器官的污染,等等.体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有反抗水平,因此培养基应到达无化学物质污染、无微生物污染如细菌、真菌、支原体、病毒等、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染如抗体、补体.对于天然培

3、养基,污染主要来源于取材过程及生物材料本身,应当严格选材,严格操作.对于合成培养基,污染主要来源于配制过程,配制所用的水,器皿应十分洁净,配制后应严格过滤除菌.由于体外培养细胞自身没有反抗污染的水平,而且培养基中的抗生素抗污染水平有限,因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回.支原体污染后,由于它们不会使细胞死亡可以与细胞长期共存,培养基一般不发生浑浊,细胞无明显变化,外观上给人以正常感觉,实那么细胞手到多方面潜在影响,如引起细胞变形,影响DNA合成,抑制细胞生长等.组织细胞培养工作中,可以从以下几方面来预防支原体的污染：限制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基冲参加

4、适量的抗生素.抗生素主要用于消毒培养液,是培养过程中预防微生物污染的重要手段,也是微生物污染不严重时的急救方法.不同抗生素杀灭微生物不同,应根据需要选择.在细胞培养过程中如果发现破碎的细胞甚多,培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时,应该疑心支原体污染.支原体污染难以观察特殊的外观变化,培养液也不浑浊.支原体污染细胞后,特别是重要的细胞株,有必要去除支原体,常用方法有：抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理.要注意的是：支原体没有细胞壁,故作用于细胞壁生物合成的抗生素,如内酰胺类、万古霉素等是不敏感的；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐火药.对支原体最有抑制活性抗生素

5、是四环素类、大环内酯类等,氨基糖甘类、氯霉素对支原体有较小的抑制作用.必要时更换所有培养用物.通常,滤过除菌的方法对支原体是没有作用的.由于一些微生物,如支原体,病毒等能通过滤膜,所以过滤药品仍潜在被外源微生物污染的危险,近年来,60Co辐射灭菌技术在医药、食品等领域广泛应用,由于辐射灭菌能够彻底杀灭所有微生物.有试验证实以2Mrad辐射处理的各培养基样品到达了无菌要求,经多批培养试验,辐射灭菌平安可靠；辐射灭菌的培养基营养性能不低于过滤组,证实辐射灭菌对培养基性能无不良影响；对血清的辐射灭菌试验效果也表明60COr射线不影响培养效果.把干粉培养基经无菌操做定量分装于灭菌容器内,辐射后以干粉原

6、型贮藏,不但培养基的纯洁性得到保证,而且营养性能较过滤后以水溶液形式保存更稳定,对谷氨酰胺等这类水溶液不稳定者特别适宜.目前,有专门做支原体检测的试剂盒,可以用细胞滴片检测.市场上已有了新一代支原体抗生素M-PlasmocinInvivoGen公司,能有效的杀灭支原体,又不影响细胞本身的代谢,而且处理过的细胞不会重新感染支原体.另外,配合支原体检测试剂盒市场上有售,如美国ICN公司的产品,可以帮助尽快发现支原体的污染.细胞培养中支原体污染的特点及检验BIOX.CN2005-6-319:47:34来源：生命经纬支原体是一种大小介于细菌和病毒之间最小直径0.2um并独立生活的微生物.约有1%可通过

7、滤菌器.支原体无细胞壁形态呈高度多形性.可为圆形、丝状或梨形.支原体形态多变,在光境下不易看清内部结构.电镜下观察支原体膜为三层结构.其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中央束.支原体多吸附或散在于细胞外表和细胞之间.横断面与细胞微绒毛相似,但微绒毛电子密度比支原体小,且中央无颗粒群或中央束.支原体代谢需固醇类物质、局部种类需要精氨酸、O2或葡萄糖,每一种支原体都有自身持点.多数支原体适合于偏碱条件下生存PH7.68.0,对酸耐受性差.对热比拟敏感,对一般抗生素不敏感.支原体污染细胞后.培养液可不发生混浊.多数情况下细胞病理变化稍微或不显著,细微变化也可由于传代、换液而缓解.因此易被无视.但

8、个别严重者,可致细胞增殖缓慢.甚至从培养器皿脱落.为确定有无支原体污染可做如下检酗：相差显微境检测：将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上,24h后取出,用相差油镜观察.支原体呈暗色微小颗粒位于细胞外表和细胞之间.荧光染色法：荧光染色用能与DNA寺异性结合的荧光染料Hoechst33258,可使支原体内含有的DNAT色,染色后用荧光显微镜观察.具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上,在细胞未长满前取出玻片,用不合酚红的Hanks液漂洗一下,用l:3醋酸甲酵固定10Min,然后用生理盐水漂洗.置于用生理盐水配浓度为50pg/ml的Hoechst33258中染色10min.染色后用蒸溜水洗12mi

9、n.向细胞面滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴,然后置荧光显微镜下观察.镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜外表的亮绿色小点.电镜检查；用扫描电镜方法简便快速.也可以利用透射电镜.DNA分子条文检查或支原体培养等方法：检出率高.但方法较为复杂支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物,大小一般在0.3-0.5um之间,呈高度多形性,有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态.它不同于细胞,也不同于病毒.支原体用普通染色法不易着色,用姬姆萨染色很浅,革兰染色为阴性.支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长,营养要求比细菌高.细胞培养(特别是传代细胞)被支原体污染是个世界性问题.在细胞培养中支原体感染发生率

10、达到63%支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RN微蛋白表达,又不能通过可视法对其进行检测,而且它对细胞的生长率影响较小,不易引起注意.国内外研究说明,95%以上是以下四种支原体：口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)和莱氏无胆管原体(A.laidlawii),为牛源性.以上是最常见的污染细胞培养的支原体菌群,但能够污染细胞的支原体种类是很多的,国外调查证实,大约有二十多种支原体能污染细胞,有的细胞株可以同时污染两种以上的支原体.支原体污染的来源包括工作环境的污染、操作者本身的污染(一些支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、污

11、染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制备细胞的原始组织或器官的污染.组织细胞培养工作中,主要从以下几个方面来预防支原体的污染：限制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中参加适量的抗生素.支原体污染细胞后,特别是重要的细胞株,有必要去除支原体,常用方法有抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理.支原体最突出的结构特征是没有细胞壁,一般来讲,对作用于细胞壁生物合成的抗生素,如-内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺药物普遍耐药.对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生素是四环素类、大环内酯类及

12、一些氟唾诺酮；其他类抗生素如氨基糖昔类、氯霉素对支原体有较小抑制作用,所以常不用来作为支原体感染的化学治疗剂.InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体,不影响细胞本身的代谢,并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞,不会重新感染支原体.对于支原体污染的细胞,可以采取补救举措:1抗生素排除法：可以用5-10倍于常用量的冲击法,参加高浓度抗生素后作用24-48小时,再换入常规培养液,有时可能有效.推荐用量：庆大霉素200ug/ml,四环素10ug/ml,卡那霉素50ug/ml.对于支原体污染抗生素应用,预防性应用比污染后使用好.2加温除菌：根据

13、支原体耐热性能差的特点.将受支原体污染的细胞置于41度中作用5-10小时可以杀灭支原体.但由于41度对培养细胞本身也有较大的影响,故处理前,应先进行预试验,确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间.细胞支原体污染一般情况及预防举措信息来源：本站原创更新时间：2004-10-192:28:00细胞株假设受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时,会严重的影响实验的结果.而细菌、真菌等之微生物污染时,较易自培养基等的外观变化发觉.但是假设受到支原体之污染时,细胞之外观较无明显变化,但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化.各国细胞库支原体污染的统计表,如下：

14、国家受支原体污染()报告年度USA-FDA151993(past30years)USA-ATCC15-201992Japan(IFO,RIKEN,JCR)80302219811987-Germany-DSM361990-1994Argentina651987Israel321986-1993China951990造成支原体高污染率的原由于：1 .支原体size0.10.8um,无细胞壁,可透过一般过滤膜(0.22-0.45um)2 .支原体污染时,没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化3 .过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式4 .细胞流通间缺乏品管,造成实验室间的相互污染5 .研究或

15、操作人员忽略污染问题而支原体污染了来源：1 .已受污染的细胞2 .操作人员的疏失3 .已受污染的培养基、血清4 .操作环境不良、实验器具不洁等由于支原体为人体口腔中之正常菌丛,实验室之操作人员的污染亦可能为污染源,须十分注意.而万一细胞已受支原体污染时,最正确的处理原那么为将细胞高压灭菌后丢弃,以免污染其它洁净的细胞株.但是假设是坚持要作去除支原体污染,有以下几种方法,只不过结果会与原始的细胞特性有差异.去除支原体污染：1. 抗生素处理：BM-cyclin(Roche),MRA(mycoplasmaremovalagent,ICN),Ciprofloxcin(Bayer),Enrofloxac

16、in(Bayer)2. Nucleicacidmetabolites:5-bromouracil,Hoechst33258,bromodeoxyuridine3. Anti-sera预防与限制方面可从以下各点增强注意：G设备方面：1 .使用已作支原体测试ok之细胞株2 .于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞3 .使用不添加抗生素的培养基培养细胞G检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染.G实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求有关支原体污染之问题与答复：o应如何预防细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体.主要的

17、污染原由于无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等.严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法.o如果细胞发生微生物污染时,应如何处理？直接灭菌后丢弃之.o支原体(mycoplasma)污染的细胞,是否能以肉眼观察出异状？不能.除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之.支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数据.故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义.侦测出细胞株有支原体污染时,该如何处理?直接灭菌后丢弃,以预防污

18、染其它细胞株.支原体之检测：*直接培养法*原理：直接培养支原体于培养基中,观察其生长及菌落生成. 特点：是目前最直接与灵敏之步骤,亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤. 缺点：培养时间长,须3-5星期才能判断.有些支原体不能在培养基培养出来(例如M.hyorhinis).需同时培养支原体株作为正反响对照组,可能会造成污染. 材料：dextrose、L-arginineHCl、DifcoPPLObroth(Difco0554-17-1)horseserum、15%yeastextractsolution(autoclaved)>Bactoagar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)&

19、gt;无菌培养皿(60x15mm)、L-玻棒、37c培养箱、厌氧缸(厌氧缸长期培养易有污染,所以厌氧包应用无菌水,每次翻开厌氧缸后,用70%ethanol擦拭内壁.) 培养基制备：根本配方为DifcoPPLObroth(60%),马血清(20%),15%yeastextreatsolution(10%),10xstocksolution(10%).由于培养时间长,可力口入penicillin(50u/ml)至10xstocksolution或参加thalliumacetate(1:2000)至培养基中以预防其它细菌污染. 10xstocksolution(1liter):称取50gdextro

20、se,10gL-arginineHCl,溶于1liter蒸储水中.以0.22无菌过滤膜过滤灭菌.分装100ml至瓶中,保存于-70C. 液体培养基(1liter):称取21g之DifcoPPLObroth,0.02gphenolred于600ml蒸储水中,加热搅拌溶解之.灭菌121C,15分钟.待温度降低至室温后,于无菌操作台内参加200ml马血清,100ml之15%yeastextractsolution,及100ml解濂之10xstocksolution,混合均匀后,分装至已灭菌之有盖螺旋试管中,10ml/管.保存于4C,期限1个月. 固体培养基(1liter):称取21g之DifcoPP

21、LObroth,0.02gphenolred,15gBactoagar于600ml蒸储水中,加热溶解之.灭菌121C,15分钟.放在50c水中浴中,待温度降低至50c时,于无菌操作台内参加200ml马血清,100ml之15%yeastextractsolution及100ml解冻之10xstocksolution,混合均匀后,倒入60x50那么之无菌培养皿中,5ml/培养皿.保存于4C,期限1个月.步骤： 取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液,接种于液体培养基中,置于37c培养二周,观察是否有混浊或是pH值改变之情形.培养一周及二周后,分别取0.1ml液体培养液涂在agarplate

22、77;,将其倒放置于37c厌氧箱培养,培养至少3星期,持续观察是否有支原体之菌落出现. 另取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液,涂抹在agarplate上,37c厌氧培养3星期,持续观察是否支原体菌落出现. 另作正负反响对照组,正反响对照组为Acholeplasmalaidlawii(ATCC23206)与M.arginini(ATCC23838).负反响对照组为待测细胞之新鲜培养基.结果判读： 支原体生长较慢,所以先在液体培养基培养12周增殖后,再培养于agarplate上.需至少培养3星期后,才可断定是否有支原体污染.所以整个测试需5个星期才知正确结果. 典型之支原体菌落类似荷包蛋(f

23、ried-egglike),乃是由于支原体往agar下层生长所致,为圆形无色透明菌落,大小约10-55但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落,有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态(slime). 假设要区分细胞或是气泡造成的类似菌落,可将其自agarplate上切下,重新培养于液体培养基中,培养一星期后再种入agarplate,假设是细胞那么不会生长.DNA萤光染色法 原理：利用萤光染剂(bisbenzimide,Hoechst33258)侦测支原体污染.此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine(A-T)rich区域,由于支原体之DNA中A-T含量占多数(5580%),所以可将其

24、染色而侦测.被支原体污染之细胞经染色后,在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点,即为支原体之DNA,证实有支原体之污染. 测试步骤用间接步骤,将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中(indicatorcell,例如Verocellor3T6cell),然后培养指示细胞再作萤光染色.正负反响对照组亦可以接种于indicatorcell内作为对照. 待测细胞亦可作直接测试,但需为吸附型细胞,培养后直接作萤光染色.有些细胞易有萤光背景,而干扰结果判读,那么建议使用接种于指示细胞之步骤. 特点：简单、经济与灵敏,广泛使用,可作为例行之侦测步骤.可以侦测不易培养之支原体,例如M.h

25、yorhinis,较直接培养法快,约一星期即可知道结果. 缺点：有时仍会有萤光背景,影响判读.材料： Hanks'balancedsaltsolutionwithoutNaHCO3orphenolred(HBSS,GibcoBRL21250-014)、bisbenzimide(HoechstNo.33258,SigmaB-2883)、thimerosol(SigmaT-5125)、0.1Mcitricacid02MdisodiumphosphateglycerolglacialaceticacidmethanolstrerileH2Ochamberslide(Nunc)或chamber

26、slide替代物：35or60mmsterileplate内放置无菌22x22mm盖玻片(浸于酒精内,使用前过火灭菌),一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上.染色后取出盖玻片,细胞面朝下放在玻片上观察. Indicatorcells:Vero(Africangreenmonkeykidney,ATCCCCL-81orCCRC60013)or3T6(mousefibroblast,ATCCCCL-96orCCRC60070),细胞须先测试无污染.aMEMwith10%FBS(mediumforVerocell)配制试剂： 无菌HBSS:配制Hanks'balancedsaltsolution

27、以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌.勿用高压蒸汽灭菌. Hoechst33258stocksolution(100X):称取5.0mgbisbenzimide和10.0mgthimersol溶于100ml无菌HBSS,置于棕色瓶中,室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后,以1ml分装至1.5ml小离心管中,贮存于-20C. Hoechst33258workingreagent：取1mlHoechst33258stocksolution,力口入sterile100mlHBSS中,室温下搅拌45分钟,置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆,预防光照,贮存于4CO mountingsolution:22.2m

28、l0.1Mcitricacid和27.8ml0.2MNa2HPO4参加于50mlglycerol中混合,以1NNaOH调整pH至5.5pH很重要,贮存于4C. 固定溶液fixative:冰醋酸与甲醇以1：3之体积比例混合,使用前才配制.步骤： 培养Vero细胞：Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管,测试前解冻培养.测试前一周培养Vero细胞. 在接种测试样品前一日,以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞,制成细胞悬浮液,以1-2x10A4cells/ml培养于chamberslide中,每个well参加1ml细胞悬浮液,于37C,5%CO2培养.隔日确定生长良好后,即可接种测试

29、样品. 接种测试样品：样品种类：1ml待测之培养基,1ml待测细胞培养液可将细胞稍微刮下,0.050.1ml冷冻管之细胞悬浮液. 将测试样品参加chamberslide内,培养5天后,进行Hoechst33258的萤光染色观察. 以AcholeplasmalaidlawiiATCC23206感染Vero细胞作为正反响对照组或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液,负反响对照组为Verocell之新鲜培养基aMEM+10%FBS.DNA萤光染色检测： 取出培养5日之Vero细胞,吸除培养液.于每个well中参加2ml1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液,静置10min后,吸除固定液.重复上述之步骤,风

30、干10分钟. 于每个well中,参加1mlHoechst33258workingsolution,室温下静置30min. 吸掉Hoechst33258染液后,以无菌水洗涤3次,风干后参加1滴的mountingsolution,并以盖玻片覆盖之. 以100x-400x萤光显微镜观察.翻开水银光源10min后,以UV激发光束330380nm之滤光镜,观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生.结果判读：假设有支原体污染,在Vero细胞核外与细胞外表会出现蓝色萤光小点或是丝状点.其形状一致,与细胞残片染成之不规那么点状物不同.其萤光可维持数星期.图例A为negativeresult:萤光显

31、微镜下,只观察到Vero细胞的细胞核,测试样品没有支原体的污染.为positiveresult:在Vero细胞核外与细胞外表会出现蓝色萤光小点和丝状点,表示测试样品有支原体的污染.支原体感染发生后能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达,又不能通过可视法对其进行检测,而且它对细胞的生长率影响较小,不易引起注意.在细胞培养过程中如果发现破碎的细胞甚多,培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时,应该疑心支原体污染.支原体污染难以观察特殊的外观变化,培养液也不浑浊.由于支原体能够透过滤膜,因此在使用一些通过过滤灭菌的试剂上,如果试剂本身带有支原体污染,那么很容易造成支原体污染的传播.其中细胞培

32、养接触水源是支原体最容易传播和交叉污染的地方,也是实验室消毒最难处理的地方,这里包括细胞培养箱产生的气雾、培养箱内专用水源以及水浴锅等设备,AppliChem独创了专业针对水池抗支原体污染的系列产品.用于容器外表的消毒,以及二氧化碳培养箱蓄水槽,各种水箱,及清洗用水池的消毒.细胞培养中支原体污染的预防培养箱及水源支原体喷雾试剂Incubator-Clean目录号：A5230产品转为细胞恒温培养箱及其他仪器外表支原体消毒,能有效预防真菌及抱子、细菌及杆菌抱子、支原体以及病毒污染包括HIV和乙肝病毒.该试剂活性成分为四节基胺化合物,试剂不含汞、甲醛、苯酚和乙醇等细胞毒物质,更重要的是,该消毒试剂对细胞无毒副作用,并且是生物可