第十二章 细胞增殖极其调控(2)

1、第三节第三节 细胞周期的调控细胞周期的调控一、一、MPFMPF的发现极其作用的发现极其作用 Rao和和Johnson(1970、1972、1974)将将Hela细胞同步于不同阶段，然后与细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)，这种现象叫做早熟染色体凝集，这种现象叫做早熟染色体凝集(premature chromosome

2、condensation)。G1期期PCC为单线状，因为单线状，因DNA未复制。未复制。S期期PCC为粉末状，因为粉末状，因DNA由多个部位开始复制，因此有大量的染色体片段。由多个部位开始复制，因此有大量的染色体片段。G2期期PCC为双线染色体，说明为双线染色体，说明DNA复制已完成。复制已完成。 不同形态的不同形态的PCC1971年，年，Masui和和Markert用非洲爪蟾卵做实验，非洲爪蟾卵细胞发育过程可以用非洲爪蟾卵做实验，非洲爪蟾卵细胞发育过程可以划分为划分为6个阶段，即第个阶段，即第1、V和和期。第期。第1至至期为卵母细胞生成和期为卵母细胞生成和生长阶段。生长阶段。第第期期卵母细胞

3、达到一定体积，停止生长，等待成熟。此时的卵母卵母细胞达到一定体积，停止生长，等待成熟。此时的卵母细胞处于第一次减数分裂前期阶段，含有一个体积较大的细胞核，称为生发泡细胞处于第一次减数分裂前期阶段，含有一个体积较大的细胞核，称为生发泡(germinal vesicle，GV)。卵母细胞成熟需要雌性激素孕酮的刺激。在孕酮作用。卵母细胞成熟需要雌性激素孕酮的刺激。在孕酮作用下，卵母细胞向下，卵母细胞向V和和期转化，生发泡破裂期转化，生发泡破裂(GV broken down，GVBD)，染色，染色体凝集，进行第一次减数分裂；然后立即进行第二次减数分裂，并停留在分裂体凝集，进行第一次减数分裂；然后立即进

4、行第二次减数分裂，并停留在分裂中期中期，即成熟的卵细胞，即成熟的卵细胞(第第期卵细胞期卵细胞)。卵细胞受精后，形成受精卵，很快。卵细胞受精后，形成受精卵，很快便开始卵裂便开始卵裂P423(图图1232)。Masui和和Markert用解剖方法分离第用解剖方法分离第期卵母细胞，并用孕酮进行体外刺激，诱期卵母细胞，并用孕酮进行体外刺激，诱导卵母细胞成熟然后进行细胞质移植实验。他们发现，将孕酮诱导成熟的卵细导卵母细胞成熟然后进行细胞质移植实验。他们发现，将孕酮诱导成熟的卵细胞的细胞质注射到卵母细胞的细胞质注射到卵母细胞中，可以诱导后者成熟；胞中，可以诱导后者成熟；再将后者的细胞质少量注再将后者的细胞

5、质少量注射到一些新的卵母细胞中，射到一些新的卵母细胞中，这些新的卵母细胞仍被诱这些新的卵母细胞仍被诱导成熟；再将刚被诱导成导成熟；再将刚被诱导成熟的卵细胞的细胞质少量熟的卵细胞的细胞质少量注射到另一些新的卵母细注射到另一些新的卵母细胞中，仍然可以诱导卵母胞中，仍然可以诱导卵母细胞成熟细胞成熟(图图1233)。因。因而他们认为，在成熟的卵而他们认为，在成熟的卵细胞的细胞质中：必然有细胞的细胞质中：必然有一种物质，可以诱导卵一种物质，可以诱导卵母细胞成熟。他们将这种母细胞成熟。他们将这种物质称作物质称作促进成熟因子，促进成熟因子，即即MPF。 不仅同类不仅同类M期细胞可以诱导期细胞可以诱导PCC，

6、不同类的，不同类的M期细胞也可以诱导期细胞也可以诱导PCC产生，产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着M期细胞具有某种促进期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)。 早在早在1960s，Yoshio Masui发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂胞破裂(Germinal Vesicle Breakdown，GVBD)，后来，后来Sunkara将不同时期将不同时期Hel

7、a细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中，发现细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中，发现G1和和S期的抽取物不能诱导期的抽取物不能诱导GVBD，而，而G2和和M期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子丝分裂因子(MPF)。后来在。后来在CHO细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的MPF。这类物质被统称为。这类物质被统称为MPF。 MPF被发现以后，不少学者便着手被发现以后，不少学者便着手MPF的纯化工作，但一直进展缓慢，的纯化工作，但一直进展缓慢，直到直到1988年，年，Maller实验室的实验室的L

8、ohka等人以非洲爪蟾卵为材料，分离获得了等人以非洲爪蟾卵为材料，分离获得了微克级的纯化微克级的纯化MPF，并证明其主要含有，并证明其主要含有p32和和p45两种蛋白。两种蛋白。p32和和p45结合后，结合后，表现出蛋白激酶活性，可以使多种蛋白质底物磷酸化。因而证明，表现出蛋白激酶活性，可以使多种蛋白质底物磷酸化。因而证明，MPF是一是一种蛋白激酶。种蛋白激酶。二二. P34cdc2激酶的发现及其与激酶的发现及其与MPF的关系的关系细胞周期的各个时期都需要有各种不同的蛋白质，编码这些蛋白质的基因叫细胞周期的各个时期都需要有各种不同的蛋白质，编码这些蛋白质的基因叫细胞周期基因（细胞周期基因（ce

9、ll-cycle genes），或细胞分裂周期基因（），或细胞分裂周期基因（cell division-cycle genes, cdc），或），或cdc2基因，按发现的先后顺序，被命名为基因，按发现的先后顺序，被命名为cdc2、cdc25、cdc28。 1960s Leland Hartwell以芽殖酵母（图）为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株（在适宜的温度下和野生型一样），分离出了几十个与细胞分裂有关的基因细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene，cdccdc)，被称为，被称为cdc基因基因。如芽殖酵母的cdc2基因，在G2/M转换点发挥重要

10、的功能。Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期检验点）的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停下来。1970s Paul Nurse等人以裂殖酵母（图13-17）为实验材料，同样发现了许多细胞周期调控基因，如：裂殖酵母cdc28、cdc25的突变型和在限制的温度下无法分裂；wee1突变型则提早分裂，而cdc25和wee1都发生突变的个体却会正常地分裂（图13）。进一步的研究发现cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞周期的进行。而weel和cdc25分别表现为抑制和促进CDC2的活性。这也解释了为何cdc25和wee1双

11、重突变的个体可以恢复野生型的表型。Hartwell和和Nurse等人筛选出一些细胞增殖所必须的基因，其中有一个基因在等人筛选出一些细胞增殖所必须的基因，其中有一个基因在G1/S和和G2/M转换处是必不可少的，若使它功能失活，细胞就会停滞在转换处，转换处是必不可少的，若使它功能失活，细胞就会停滞在转换处，不能进入下一个时期，这个基因在裂殖酵母中被称为不能进入下一个时期，这个基因在裂殖酵母中被称为cdc2（在牙殖酵母中的同（在牙殖酵母中的同源基因称为源基因称为cdc28），其表达产物具有激酶的活性。），其表达产物具有激酶的活性。 1983年年Timothy Hunt首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过

12、程中两种蛋白质的首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，G2/M时达到高峰，时达到高峰，M结束后结束后突然消失，下轮间期又重新合成，故命名为突然消失，下轮间期又重新合成，故命名为周期蛋白周期蛋白(cyclin)（ cyclin A，B）。后来在青蛙、爪蟾、海胆、果蝇和酵母中均发现类似的情况，各类动物来源的细后来在青蛙、爪蟾、海胆、果蝇和酵母中均发现类似的情况，各类动物来源的细胞周期蛋白胞周期蛋白mRNA均能诱导蛙卵的成熟。用海洋无脊椎动物和两栖类的卵为实验均能诱导蛙卵的成熟。用海洋无脊椎动物和两

13、栖类的卵为实验材料进行这类实验，好处在于卵的量比较大，而且在胚胎发育的早期，细胞分裂材料进行这类实验，好处在于卵的量比较大，而且在胚胎发育的早期，细胞分裂是同步化的。是同步化的。 1988年M. J. Lohka 纯化了爪蟾的MPF，获得了微克级的MPF，发现它是两种蛋白组成的复合体，经鉴定由32KD和45KD两种蛋白组成，二者结合可使多种蛋白质磷酸化。后来Paul Nurse（1990）进一步的实验证明P32实际上是cdc2的同源物，而P45是cyclin B的同源物，从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。 2001年10月8日美国人LelandHartwell、英国人Paul Nurse

14、、TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖（图）。The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2001for their discoveries of key regulators of the cell cycleLeland H. Hartwell1/3 of the prizeUSAFred Hutchinson Cancer Research Center Seattle, WA, USA b. 1939R. Timothy (Tim) Hunt1/3 of the prizeUnited KingdomImperi

15、al ancerResearch Fund London, nited Kingdom b. 1943Sir Paul M. Nurse1/3 of the prizeUnited KingdomImperial ancerResearch FundLondon, United Kingdom b. 1949三、周期蛋白三、周期蛋白 1983年年Hunt首次报道海胆受精后，在其卵裂过程中有两类蛋白呈现周期性首次报道海胆受精后，在其卵裂过程中有两类蛋白呈现周期性的增长和消失，即蛋白质的水平随细胞周期的进行而剧烈变化，他们在间期合的增长和消失，即蛋白质的水平随细胞周期的进行而剧烈变化，他们在间期合

16、成，成，G2/M转换时达到高峰，转换时达到高峰，M期结束后迅速降解，下一个细胞周期又重现同期结束后迅速降解，下一个细胞周期又重现同样的变化，这类蛋白称为周期蛋白，分为样的变化，这类蛋白称为周期蛋白，分为A、B两型。两型。 在短短的在短短的10年间，人们便从各种生物体中克隆分离了数十种周期蛋白，如年间，人们便从各种生物体中克隆分离了数十种周期蛋白，如酵母的酵母的Clnl、Cln2、Cln3、ClblClb6，高等动物的周期蛋白，高等动物的周期蛋白A1、A2、B1、B2、B3、C、D1、D2、D3、El、E2、F、G、H等等。这些周期蛋白在细胞周等等。这些周期蛋白在细胞周期内表达的时期有所不同，所

17、执行的功能也多种多样。这些周期蛋白有的只在期内表达的时期有所不同，所执行的功能也多种多样。这些周期蛋白有的只在G1期表达并只在期表达并只在G1期和期和S期转化过程中执行调节功能，所以常被称为期转化过程中执行调节功能，所以常被称为G1期周期周期蛋白期蛋白，如，如C、D、E、Clnl、Cln2、Cln3等；有的虽然在间期表达和积累，但等；有的虽然在间期表达和积累，但到到M期时才表现出调节功能，所以常被称为期时才表现出调节功能，所以常被称为M期周期蛋白期周期蛋白，如周期蛋白，如周期蛋白A、B等。等。G1期周期蛋白在细胞周期中存在的时间相对较短。期周期蛋白在细胞周期中存在的时间相对较短。M期周期蛋白在

18、细胞周期中期周期蛋白在细胞周期中则相对稳定。则相对稳定。图：图： 在海胆卵中分裂间在海胆卵中分裂间期与有丝分裂时细胞周期与有丝分裂时细胞周期蛋白上下升降的水平。期蛋白上下升降的水平。 分裂间期上升，有丝分分裂间期上升，有丝分裂时下降。细胞周期蛋裂时下降。细胞周期蛋白是细胞周期中唯一的白是细胞周期中唯一的蛋白质，它能这蛋白质，它能这 样上样上下涨落。下涨落。(自自Murray和和Kirschner，1991)周期蛋白的分子结构：周期蛋白的分子结构： 各种周期蛋白之间有着共同的分子结构特点，但也各有特性。首先，它们均各种周期蛋白之间有着共同的分子结构特点，但也各有特性。首先，它们均含有一段相当保守

19、的氨基酸序列，称为周期蛋白框含有一段相当保守的氨基酸序列，称为周期蛋白框(cyclin box)(P339如图如图1133)。周期蛋白框约含有周期蛋白框约含有100个左右的氨基酸残基。周期蛋白框介导周期蛋白与个左右的氨基酸残基。周期蛋白框介导周期蛋白与CDK结结合。合。不同的周期蛋白框识别不同的不同的周期蛋白框识别不同的CDK，组成不同的周期蛋白，组成不同的周期蛋白CDK复合体，复合体，表现出不同的表现出不同的CDK激酶活性。激酶活性。M期周期蛋白的分子结构含有另一个特点期周期蛋白的分子结构含有另一个特点，在这，在这些蛋白质分子的近些蛋白质分子的近N端含有一段由端含有一段由9个氨基酸组成的特殊

20、的序列，称为破坏框个氨基酸组成的特殊的序列，称为破坏框（destruction box，RXXLGXIXN)(X代表可变性氨基酸代表可变性氨基酸)。在破坏框之后，为一。在破坏框之后，为一段约段约40个氨基酸组成的赖氨酸富集区。破坏框主要参与由泛素个氨基酸组成的赖氨酸富集区。破坏框主要参与由泛素(ubiquitin)介导的介导的周期蛋白周期蛋白A和和B降解。降解。Gl期周期蛋白分子中不含期周期蛋白分子中不含破坏框，破坏框，但其但其C端含有一段特端含有一段特殊的殊的PEST序列。据认为序列。据认为PEST序列与序列与Gl期周期蛋白更新有关。期周期蛋白更新有关。图中显示的，除C1n3外，均为人类的周

21、期蛋白分子。所有这些分子均含有一个周期蛋白框。M期周期蛋白(A2，B1)分子的N端含有一个破坏框。G1期周期蛋白分子的C端含有一个PEST序列Cyclin的周期性变化在中期当在中期当MPF活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期促进因子活性达到最高时，通过一种未知的途径，激活后期促进因子APC，将泛素连接在将泛素连接在cyclinB上，导致上，导致cyclinB被蛋白酶体（被蛋白酶体（proteasome）降解，完成）降解，完成一个细胞周期（图）。一个细胞周期（图）。P175P175蛋白酶体图蛋白酶体图7-37-3（26S26S）。）。Cyclin B的降解途径Metaphase中期Pro

22、phase早期Interphase间期Anaphase后期Telophase末期细胞周期蛋白的降解盒与降解途径The Nobel Prize in Chemistry 2004for the discovery of ubiquitin-mediated protein degradationAaron Ciechanover1/3 of the prizeIsraelTechnion Israel Institute of Technology Haifa, Israel b. 1947Avram Hershko1/3 of the prize IsraelTechnion Israel I

23、nstitute of Technology Haifa, Israel b. 1937(in Karcag, Hungary)Irwin Rose1/3 of the prizeUSAUniversity of California Irvine, CA, USAb. 1926不同的周期蛋白在细胞周期中表达的时期不同，并与不同的不同的周期蛋白在细胞周期中表达的时期不同，并与不同的CDK结合，调节结合，调节不同的不同的CDK激酶活性。激酶活性。P427图图12-35（1）在哺乳动物细胞中，周期蛋白）在哺乳动物细胞中，周期蛋白A在在G1期的早期即开始表达并逐渐积累，期的早期即开始表达并逐渐积累，

24、到达到达G1S交界处，其含量达到最大值并一直维持到交界处，其含量达到最大值并一直维持到G2M期。周期蛋白期。周期蛋白B则则从从G1期晚期开始表达并逐渐积累，到期晚期开始表达并逐渐积累，到G2期后期阶段达到最大值并一直维持到期后期阶段达到最大值并一直维持到M期的中期阶段，然后迅速降解。作为期的中期阶段，然后迅速降解。作为G1期周期蛋白的周期蛋白期周期蛋白的周期蛋白D在细胞周期在细胞周期中持续表达，而周期蛋白中持续表达，而周期蛋白E则在则在M期的晚期和期的晚期和G1期早期开始表达并逐渐积累，期早期开始表达并逐渐积累，到达到达G1期的晚期，其含量达到最大值，然后逐渐下降，到达期的晚期，其含量达到最大

25、值，然后逐渐下降，到达G2期的晚期，其期的晚期，其含量降到最低值。含量降到最低值。（2）在裂殖酵母和芽殖酵母中，周期蛋白含量的消长情况与哺乳动物细胞中）在裂殖酵母和芽殖酵母中，周期蛋白含量的消长情况与哺乳动物细胞中的有许多相似之处。作为的有许多相似之处。作为M期周期蛋白，芽殖酵母中的期周期蛋白，芽殖酵母中的Clbl、Clb2和裂殖酵母和裂殖酵母中的中的Cdcl3、Cigl均在均在G1期的后期开始表达，到期的后期开始表达，到G2期达到最大值，到达期达到最大值，到达M期中期中期后则迅速消失。作为期后则迅速消失。作为G1期周期蛋白，芽生酵母中的期周期蛋白，芽生酵母中的Clnl、Cln2和裂殖酵母中和

26、裂殖酵母中的的Cig2则在则在M期的后期开始表达，到达期的后期开始表达，到达Gl期后期的期后期的“起始点起始点”前，其含量达到前，其含量达到最大值，然后逐渐降低，到达最大值，然后逐渐降低，到达G2期时降到最低值。另外，在裂殖酵母中还发现期时降到最低值。另外，在裂殖酵母中还发现其他两种其他两种B类周期蛋白类周期蛋白Clb3、Clb4。两者的表达早于。两者的表达早于Clbl和和Clb2。但对其功能。但对其功能尚了解不多。有人推测它们可能在尚了解不多。有人推测它们可能在G1S转化和转化和S期中起调节作用。期中起调节作用。四四. CDK激酶和激酶和CDK激酶抑制物激酶抑制物 当酵母当酵母cdc2和和c

27、dc28基因被分离出来后，几个实验室便首先通过基因被分离出来后，几个实验室便首先通过PCR技术构技术构建了人类、非洲爪蟾和果蝇的建了人类、非洲爪蟾和果蝇的cDNA文库；然后对文库；然后对cDNA文库进行筛选。结果成文库进行筛选。结果成功分离到了功分离到了10多个多个cdc2相关基因。它们又含有两个共同的特点：相关基因。它们又含有两个共同的特点：P428图图12-36（1）一个是它们含有一段类似的氨基酸序列；一个是它们含有一段类似的氨基酸序列；（2）它们都可以与周期蛋白结合，并将周期蛋白作为其调节亚单位，进而表现）它们都可以与周期蛋白结合，并将周期蛋白作为其调节亚单位，进而表现出蛋白激酶活性。出

28、蛋白激酶活性。因而，它们被统称为因而，它们被统称为周期蛋白依赖性蛋白激酶周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclindependent kinase)，简称，简称CDK激酶激酶。目前已经发现并命名的。目前已经发现并命名的CDK激酶包括激酶包括Cdc2、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK8、CDK9、CDKl0、CDKll和和CDKl2等。由于等。由于Cdc2第一个被发现，而其他几个第一个被发现，而其他几个CDK激酶则是通过与其相比较而得来，因而激酶则是通过与其相比较而得来，因而Cdc2激酶被命名为激酶被命名为CDKl。不同的。不同的CDK激酶所要求结合的周期蛋白不同，在

29、细胞激酶所要求结合的周期蛋白不同，在细胞周期中执行的调节功能也不相同。周期中执行的调节功能也不相同。某些某些CDK与周期蛋白的配对关系，与周期蛋白的配对关系，P428见表见表12-2。 各种各种CDK分子均含有一段类似的分子均含有一段类似的CDK激酶结构域激酶结构域(CDK kinase domain)。与。与CDKl激酶结构域相比，其他几种激酶结构域相比，其他几种CDK激酶结构域的保守程度有所不同激酶结构域的保守程度有所不同(图图12-36)。在在CDK激酶结构域中，有一小段序列则相当保守，即激酶结构域中，有一小段序列则相当保守，即PSTAIRE序列。据认为，序列。据认为，此序列与周期蛋白结

30、合有关。此外，在此序列与周期蛋白结合有关。此外，在CDK分子中也发现一些重要位点。对这分子中也发现一些重要位点。对这些位点进行磷酸化修饰，将对些位点进行磷酸化修饰，将对CDK激酶活性起重要调节作用。细胞内存在多种激酶活性起重要调节作用。细胞内存在多种因子，对因子，对CDK分子结构进行修饰，参与分子结构进行修饰，参与CDK激酶活性的调节。激酶活性的调节。 除周期蛋白和上述修饰性调控因子对除周期蛋白和上述修饰性调控因子对CDK激酶活激酶活性进行调控之外，细胞内还存在一些性进行调控之外，细胞内还存在一些CDK激酶活性起负激酶活性起负性调控的蛋白质，称为性调控的蛋白质，称为CDK激酶抑制物激酶抑制物(

31、cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKI)。到目前为止，已。到目前为止，已经发现多种对经发现多种对CDK激酶起负性调控作用的激酶起负性调控作用的CDKI，分别，分别归为归为CipKip家族和家族和INK4家族。家族。CipKip家族成员主家族成员主要包括要包括P21cip/waf1、p27kip1和和p57kip2， P21cip/waf1为此家族为此家族的典型代表。的典型代表。 p21主要对主要对G1期期CDK激酶激酶(CDK2、CDK3、CDK4和和CDK6)起抑制作用。起抑制作用。p21还可以与还可以与PCNA (proliferating cell

32、 nuclear antigen)直接结合。直接结合。PCNA是是DNA复制聚合酶复制聚合酶的辅助因子，为的辅助因子，为DNA复制所必需。复制所必需。p21与与PCNA结合，可以直接抑制结合，可以直接抑制DNA复制。复制。INK4家族家族成员主要包括成员主要包括p16、p15、p18和和p19等，等，p16为此家族的为此家族的典型代表。典型代表。p16主要抑制主要抑制CDK4和和CDK6激酶活性。激酶活性。五、细胞周期运转调控五、细胞周期运转调控 目前已经公认，目前已经公认，CDK激酶是细胞周期运转的引擎分子，对细胞周期起着激酶是细胞周期运转的引擎分子，对细胞周期起着核心性调控作用。核心性调控

33、作用。 (一一)G2M期转化与期转化与CDKl激酶的关键性调控作用激酶的关键性调控作用 CDKl激酶，或激酶，或p34cdc2激酶，由激酶，由p34cdc2(或或p34cdc28)蛋白和周期蛋白蛋白和周期蛋白B结合而结合而成，即成，即MPF 。p34cdc2蛋白在细胞周期中的含量相对稳定，而周期蛋白蛋白在细胞周期中的含量相对稳定，而周期蛋白B的含量的含量则呈现周期性变化。则呈现周期性变化。p34cdc2蛋白只有与周期蛋白蛋白只有与周期蛋白B结合后才有可能表现出激酶结合后才有可能表现出激酶活性。因而，活性。因而，CDKl激酶活性首先依赖于周期蛋白激酶活性首先依赖于周期蛋白B含量的积累。周期蛋白含

34、量的积累。周期蛋白B一一般在般在G1期的晚期开始合成，通过期的晚期开始合成，通过S期，其含量不断增加，到达期，其含量不断增加，到达G2期，其含量期，其含量达到最大值。随周期蛋白达到最大值。随周期蛋白B含量达到一定程度，含量达到一定程度，CDKl激酶活性开始出现。到激酶活性开始出现。到G2期晚期阶段，期晚期阶段，CDKl活性达到最大值并一直维持到活性达到最大值并一直维持到M期的中期阶段。期的中期阶段。 CDKl激酶活性和周期蛋白激酶活性和周期蛋白B含量的关系如含量的关系如P429图图12-37所示。周期蛋白所示。周期蛋白A也可以与也可以与CDKl结合成复合体，表现出结合成复合体，表现出CDKl激

35、酶活性。激酶活性。 P429图12-37 CDKl激酶可能产生的生理效应激酶可能产生的生理效应 CDKl激酶通过使某些蛋白质磷酸化，改变其下游激酶通过使某些蛋白质磷酸化，改变其下游的某些蛋白质的结构和启动其功能，实现其对细胞周的某些蛋白质的结构和启动其功能，实现其对细胞周期的调节。期的调节。CDKl激酶催化底物磷酸化有一定的位点特激酶催化底物磷酸化有一定的位点特异性。它一般选择底物中某个特定序列中的某个丝氨异性。它一般选择底物中某个特定序列中的某个丝氨酸或苏氨酸残基。酸或苏氨酸残基。CDKl激酶可以使许多蛋白质磷酸化，激酶可以使许多蛋白质磷酸化，其中包括组蛋白其中包括组蛋白Hl、核纤层蛋白、核

36、纤层蛋白A、B、C、核仁蛋白、核仁蛋白(nucleolin)和和No.38、p60c-sre、C-abl等等(P430表表12-3)。组。组蛋白蛋白H1磷酸化，促进染色质凝集；核纤层蛋白磷酸化，磷酸化，促进染色质凝集；核纤层蛋白磷酸化，促使核纤层解聚；核仁蛋白磷酸化，促使核仁解体；促使核纤层解聚；核仁蛋白磷酸化，促使核仁解体； p60c-sre蛋白磷酸化，促使细胞骨架重排；蛋白磷酸化，促使细胞骨架重排；C-abl蛋白磷蛋白磷酸化，促使细胞形态调整等。酸化，促使细胞形态调整等。CDK激酶活性受到多种因素的综合调节。周期蛋白与激酶活性受到多种因素的综合调节。周期蛋白与CDK结合是结合是CDK激酶活

37、激酶活性表现的先决条件。但是，仅周期蛋白与性表现的先决条件。但是，仅周期蛋白与CDK结合，并不能使结合，并不能使CDK激活，还激活，还需要其他几个步骤的修饰，才能表现出活性。首先，当周期蛋白与需要其他几个步骤的修饰，才能表现出活性。首先，当周期蛋白与CDK结合形结合形成复合物后，成复合物后，WeelMikl激酶和激酶和CDK激活激酶激活激酶(CDKlactiviting kinase，CAK)催化催化CDK第第14位的苏氨酸位的苏氨酸(Thrl4)、第、第15位的酪氨酸位的酪氨酸(Tyrl5)和第和第161位的位的苏氨酸苏氨酸(Thrl61)磷酸化。但此磷酸化。但此时的时的CDK仍不表现激仍不

38、表现激酶活性酶活性(称为前体称为前体MPF)。然后，然后，CDK在磷在磷酸酶酸酶Cdc25c的催的催化下，其化下，其Thrl4和和Tyrl5去磷酸化，去磷酸化，才能表现出激酶才能表现出激酶活性。活性。CDKl激酶激酶活性调控见图活性调控见图11-37.APC:后期促进复合物后期促进复合物Anaphase promotingComplexP431(二二)M期周期蛋白与分裂中期向分裂后期转化期周期蛋白与分裂中期向分裂后期转化 胞周期运转到分裂中期后，胞周期运转到分裂中期后，M期周期蛋白期周期蛋白A和和B将迅速降解，将迅速降解，CDKl激酶活激酶活性丧失，上述被性丧失，上述被CDKl激酶磷酸化的蛋白

39、质去磷酸化，细胞周期便从激酶磷酸化的蛋白质去磷酸化，细胞周期便从M期中期期中期向后期转化。目前已经知道，向后期转化。目前已经知道，周期蛋白周期蛋白A和和B的降解是通过泛素化途径的降解是通过泛素化途径(ubiquitination pathway)来实现的来实现的。 蛋白质降解的泛素化途径中蛋白质降解的泛素化途径中：（1）首先，在首先，在ATP供能的情况下，泛素的供能的情况下，泛素的C末端与非特异性泛素激活酶末端与非特异性泛素激活酶E1的的半胱氨酸残基共价结合，形成半胱氨酸残基共价结合，形成El-泛素复合体泛素复合体。（2）El-泛素复合体再将泛素转移给另一个泛素结合酶泛素复合体再将泛素转移给另

40、一个泛素结合酶E2。（3）E2则可以直接将泛素转移到靶蛋白赖氨酸残基的则可以直接将泛素转移到靶蛋白赖氨酸残基的氨基团上。在通常氨基团上。在通常情况下，靶蛋白泛素化需要一个特异的泛素蛋白连接酶情况下，靶蛋白泛素化需要一个特异的泛素蛋白连接酶E3。 当第一个泛素分子在当第一个泛素分子在E3的催化下连接到靶蛋白上以后，另外一些泛素分的催化下连接到靶蛋白上以后，另外一些泛素分子相继与前一个泛素分子的赖氨酸残基相连，逐渐形成一条多聚泛素链。然子相继与前一个泛素分子的赖氨酸残基相连，逐渐形成一条多聚泛素链。然后，泛素化的靶蛋白被一个相对分子质量很大的称为后，泛素化的靶蛋白被一个相对分子质量很大的称为26S

41、蛋白质裂解体蛋白质裂解体(proteasome)的蛋白质复合体逐步降解的蛋白质复合体逐步降解（P432图图12-39）。多聚泛素也解聚为。多聚泛素也解聚为单个泛素分子，重新被利用单个泛素分子，重新被利用(P406图图1239)。 M期周期蛋白在泛素化途径降解过程中，其分子中的期周期蛋白在泛素化途径降解过程中，其分子中的破坏框破坏框起着重要的调起着重要的调节作用。用基因突变方法将破坏框去除，所得到的突变分子将不能被泛素化节作用。用基因突变方法将破坏框去除，所得到的突变分子将不能被泛素化途径所降解，因而可以较长时间地保持活性。途径所降解，因而可以较长时间地保持活性。1995年，分离并部分纯化了具有

42、年，分离并部分纯化了具有E3活性的蛋白质复合体。首先，活性的蛋白质复合体。首先，Sudakin等等人在青蛙卵中分离到了一个人在青蛙卵中分离到了一个1.5 x106的蛋白质复合体，称为的蛋白质复合体，称为cyclosome。在。在E1、E2、泛素和、泛素和ATP再生体系存在的情况下，再生体系存在的情况下，cyclosome可以在体外将周期蛋白可以在体外将周期蛋白A和和B通过泛素化途径降解。此时，通过泛素化途径降解。此时，King等人在非洲爪蟾卵中分离到了一个等人在非洲爪蟾卵中分离到了一个20S的蛋白质复合体，称为后期促进复合物，也支持周期蛋白的蛋白质复合体，称为后期促进复合物，也支持周期蛋白B通

43、过泛素化途径通过泛素化途径体外降解。此后证明，体外降解。此后证明，cyclosome和后期促进复合物为同源物，后期促进复合和后期促进复合物为同源物，后期促进复合物物(anaphase promoting complex)简称为简称为“APC”。APC的发现是细胞周期研的发现是细胞周期研究领域中又一大进展，表明分裂中期向后期转化也受到精密调控。究领域中又一大进展，表明分裂中期向后期转化也受到精密调控。APC至少由至少由15种成分组成，分别称为种成分组成，分别称为APC1APC15。如在人体中已鉴定了。如在人体中已鉴定了APC1、 APC8、APC10、APC13，以及，以及Cdc26等等13种，

44、在芽殖酵母和裂殖种，在芽殖酵母和裂殖酵母中也已分别鉴定出了酵母中也已分别鉴定出了13种种APC成分。成分。Tugendreich等人等人(1995)克隆了人类克隆了人类的的cdcl6和和cdc27基因，并证明基因，并证明Cdcl6Hs和和Cdc27Hs蛋白位于哺乳动物细胞的中蛋白位于哺乳动物细胞的中心体和纺锤体上。用抗心体和纺锤体上。用抗Cdc27Hs的抗体进行显微注射，可以将细胞抑制在分的抗体进行显微注射，可以将细胞抑制在分裂中期。在非洲爪蟾体系中，用抗裂中期。在非洲爪蟾体系中，用抗Cdc27Hs的抗体处理上述的抗体处理上述20S的的APC，可以，可以使使APC的泛素化活性丧失。在的泛素化活

45、性丧失。在Kim Nasmyth实验室工作的另一些科学家则在实验室工作的另一些科学家则在芽殖酵母细胞中证明，芽殖酵母细胞中证明，Cdcl6和和Cdc23也为周期蛋白也为周期蛋白B的降解所必需。的降解所必需。APC除了调节除了调节M期周期蛋白泛素化途径降解之外，也调节其他一些与细胞周期周期蛋白泛素化途径降解之外，也调节其他一些与细胞周期调控有关的非周期蛋白类蛋白质的降解，如裂殖酵母中的期调控有关的非周期蛋白类蛋白质的降解，如裂殖酵母中的Cut2和芽殖酵母和芽殖酵母中的中的Pdslp等。已知等。已知Cut2和和Pdslp均为细胞由中期向后期转化过程中的负性调均为细胞由中期向后期转化过程中的负性调控

46、因子。控因子。细胞中有正负两类细胞中有正负两类APC活性调控因子。活性调控因子。P433。(三三)G1S期转化与期转化与G1期周期蛋白依赖性期周期蛋白依赖性CDK激酶激酶在哺乳动物细胞中，在哺乳动物细胞中，G1期周期蛋白主要包括期周期蛋白主要包括周期蛋白周期蛋白D、E，或许还有，或许还有A。与。与G1期周期蛋白结合的期周期蛋白结合的CDK激酶主要包括激酶主要包括CDK2、CDK4和和CDK6等。周期蛋等。周期蛋白白D主要与主要与CDK4和和CDK6结合并调节后者的活性，周期蛋白结合并调节后者的活性，周期蛋白E则与则与CDK2结合。结合。（1）哺乳动物细胞中表达）哺乳动物细胞中表达3种周期蛋白种

47、周期蛋白D，即，即D1、D2和和D3，但三者的表达有，但三者的表达有细胞组织特异性。据推测，在快速增殖的细胞中至少表达一种周期蛋白细胞组织特异性。据推测，在快速增殖的细胞中至少表达一种周期蛋白D。显示显示周期蛋白周期蛋白D为细胞为细胞G1S转化所必需转化所必需。对周期蛋白。对周期蛋白D-CDK激酶了解甚少。激酶了解甚少。周期蛋白周期蛋白E是哺乳动物细胞中表达的另一种是哺乳动物细胞中表达的另一种G1期周期蛋白。它在期周期蛋白。它在G1期的晚期期的晚期开始合成，并一直持续到细胞进入开始合成，并一直持续到细胞进入S期。当细胞进入期。当细胞进入S期后，周期蛋白期后，周期蛋白E很快很快即被降解。周期蛋白

48、即被降解。周期蛋白E与与CDK2结合成复合物，呈现结合成复合物，呈现CDK2激酶活性。因而，激酶活性。因而，周期蛋白周期蛋白ECDK2激酶活性峰值时间为激酶活性峰值时间为G1期晚期到期晚期到S期的早期阶段。大量实期的早期阶段。大量实验显示，周期蛋白验显示，周期蛋白E-CDK2激酶活性为激酶活性为S期启动所必需。期启动所必需。（2）在细胞中提高周期蛋白）在细胞中提高周期蛋白E的表达，该细胞则快速进入的表达，该细胞则快速进入S期，而且对生长期，而且对生长因子的依赖性降低。因子的依赖性降低。（3）到达）到达S期的一定时期，期的一定时期，G1期周期蛋白也是通过泛素化途径降解，但与期周期蛋白也是通过泛素

49、化途径降解，但与M期周期蛋白的降解有所不同。期周期蛋白的降解有所不同。G1期周期蛋白的降解需要期周期蛋白的降解需要G1期期CDK激酶活性激酶活性的参与以及特殊的的参与以及特殊的E2和和E3。G1期周期蛋白分子中不含有破坏框序列，而是期周期蛋白分子中不含有破坏框序列，而是含有含有PEST序列。序列。PEST序列对序列对G1期周期蛋白降解起促进作用。期周期蛋白降解起促进作用。为什么为什么DNA在一个细胞周期中复制一次，而且只能复在一个细胞周期中复制一次，而且只能复制一次？制一次？Blow等人提出一个等人提出一个“DNA复制执照假说复制执照假说”(DNA replicationlicensing t

50、heory)。该假说认为，在细胞中必然存在一种因子，能够在。该假说认为，在细胞中必然存在一种因子，能够在G1期前或期前或G1期期与染色质结合，对染色质的与染色质结合，对染色质的DNA复制发行复制发行“执照执照”，引导，引导DNA复制的起始；复制的起始；当当DNA复制一旦完成，该执照即行消失，避免复制一旦完成，该执照即行消失，避免DNA再行复制；再行复制；在在M期，细胞期，细胞核膜破裂，胞质中的执照因子与染色质接触并与之结合，使染色质获得核膜破裂，胞质中的执照因子与染色质接触并与之结合，使染色质获得DNA复制所必需的执照。复制所必需的执照。在子细胞核形成过程中，该执照因子被限制在细胞核内。细胞通

51、过在子细胞核形成过程中，该执照因子被限制在细胞核内。细胞通过G1期后进期后进入入S期，期，DNA起始复制。随起始复制。随DNA复制过程的进行，复制过程的进行，“执照执照”信号不断减弱直信号不断减弱直到失效。到达到失效。到达G2期，细胞核不再含有执照信号，期，细胞核不再含有执照信号，DNA复制结束，并不再起始。复制结束，并不再起始。只有等到下一个只有等到下一个M期，染色质再次与胞质中的执照因子接触，重新获得执照，期，染色质再次与胞质中的执照因子接触，重新获得执照，细胞核才能开始新一轮的细胞核才能开始新一轮的DNA复制。在此过程中，核膜对执照因子起到区域复制。在此过程中，核膜对执照因子起到区域性限

52、制作用。性限制作用。DNA复制执照因子：复制执照因子：Mcm蛋白蛋白(minichromosome maintenance proteins)是其主要成分之一。进一步的实验证明，是其主要成分之一。进一步的实验证明，Orc、Cdc6、Cdtl等成分也等成分也是该执照因子的主要成分。是该执照因子的主要成分。 DNA复制起始点的识别，是复制起始点的识别，是DNA复制起始调控中的重要事件之一。复制起始调控中的重要事件之一。P436已经发现，从酵母细胞到高等哺乳类细胞，均存在一种称为复制起始点识别复合已经发现，从酵母细胞到高等哺乳类细胞，均存在一种称为复制起始点识别复合体体(origin recogni

53、tioncomplex，Orc)的蛋白质。的蛋白质。Orc含有含有6个亚单位，分别称为个亚单位，分别称为Orcl、Orc2、Orc3、Orc4、Orc5和和Orc6。Orc能够识别能够识别DNA复制起始位点并与复制起始位点并与之结合。当之结合。当Orc与与DNA复制起始点结合后，复制起始点结合后，Cdc6和和Cdtl被募集到该起始点上。被募集到该起始点上。Cdc6必须事先与必须事先与ATP分子结合。分子结合。 ATP的结合对的结合对Cdc6与染色质的结合很重要，而与染色质的结合很重要，而ATP的水解则便于的水解则便于Cdc6进一步募集进一步募集Mcm到染色质上。一旦到染色质上。一旦Cdc6结合

54、到结合到Orc上，上，通过通过Cdc6的的ATP酶活性，改变酶活性，改变Orc的构型，并与的构型，并与Cdtl一起，共同促进一起，共同促进Mcm蛋白复蛋白复合体结合到合体结合到DNA复制起始位点上。复制起始位点上。至至Mcm蛋白复合体结合到染色质上，前蛋白复合体结合到染色质上，前DNA复制复合体复制复合体(pre-replication complex，Pre-RC)即告形成，即告形成，DNA复制的起始则获复制的起始则获得了执照。得了执照。Mcm蛋白复合体由蛋白复合体由Mcm27 6个亚基组成，个亚基组成，Mcm蛋白复合体具有解蛋白复合体具有解旋酶功能，可能是旋酶功能，可能是DNA复制起始过程

55、中的复制起始过程中的DNA解旋酶。随着解旋酶。随着DNA复制的进行，复制的进行，Mcm蛋白分子从染色质上不断脱落，与染色质结合的蛋白分子从染色质上不断脱落，与染色质结合的Mcm蛋白复合体数量逐渐蛋白复合体数量逐渐减少。至减少。至DNA复制结束，染色质上不再含有前复制结束，染色质上不再含有前DNA复制复合体，新一轮的复制复合体，新一轮的DNA复制也就不能起始。复制也就不能起始。 为了阻止在一个为了阻止在一个S期内发生多重期内发生多重DNA复制，每个前复制，每个前DNA复制复合体只能行使复制复合体只能行使一次功能。一次功能。Cdc6和和Cdtl受受Cdk2CyclinA激酶的调节。激酶的调节。Cd

56、c6被磷酸化以后，从细被磷酸化以后，从细胞核内向细胞质运输或发生降解。胞核内向细胞质运输或发生降解。Cdtl还受到还受到Geminin蛋白调节。蛋白调节。Geminin通过通过与与Cdtl结合，抑制结合，抑制Cdtl与染色质的结合。与染色质的结合。Cdc6和和Cdtl与染色质脱离，可以有效地与染色质脱离，可以有效地阻止阻止Mcm蛋白与染色质再结合，从而阻止前蛋白与染色质再结合，从而阻止前DNA复制复合体组装和复制复合体组装和DNA再复制。再复制。从而实现从而实现DNA在一个细胞周期中复制一次而且只能复制一次，确保在一个细胞周期中复制一次而且只能复制一次，确保DNA复制的复制的准确性与完整性。准

57、确性与完整性。前前DNA复制复合体形成后，在复制复合体形成后，在S期期CDK激酶和激酶和DDK激酶激酶(Dbf4-dependent kinase)及及Mcm10参与下，参与下，募集募集Cdc45与复制起始点染色质结合，与复制起始点染色质结合，形成前形成前DNA复制起始复合体复制起始复合体(Pre-initiation complex，Pre-IC)。Mcm复合复合体与体与Cdc45形成的紧密复合结构具有解旋形成的紧密复合结构具有解旋酶活性。酶活性。DNA解旋后，单链结合蛋白解旋后，单链结合蛋白RPA(replication protein A)和和DNA聚合酶聚合酶Pol结合于结合于DNA复制起始点处，进一步复制起始点处，进一步募集募集DNA Pol。 Pol具有引物酶活性，具有引物酶活性，合成起始引物。合成起始引物。RFC(replication factor C)也随之结合到已结合有引物的模板上。也随之结合到已结合有引物的模板上。 RFC进一步募集进一步募集PCNA(proliferating cell nuclear antigen)和和Pol，正式起始，正式起始DNA复制。复制。真核细胞DNA复制起始调控示意图(四四)DN