基因多态性的检测方法

1、基因多态性的检测方法多态性(polymorphism)是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核甘酸序列存在着差异性称为基因(DNA的多态性(genepolymorphism)0这种多态性可以分为两类，即DNAX点多态性(sitepolymorphism)和长度多态性(longthpolymorphism)。基因多态性的主要检测方法简述如下：1. .限制性片段长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP:由DNA的多态性，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时,缰怯环out

2、hernBlot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应(PCR与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLFfe进行研究基因的限制性片段长度多态性。2. 单链构象多态性(SSCP：是一种基于单链DNA勾象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DN做口果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCFT物经变性后，进行单链DNAS胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位(mobilityshift),多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。3. PCR-AS解针法(PCR-allelespecificoligonucleotide,AS

3、O)：即等位基因特异性寡核甘酸探针法。在PCRT增DNAt段后，直接与相应的寡核甘酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核甘酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核甘酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核昔探针杂交，但能

4、与相应的正常的寡核昔探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核甘探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。4. PCR-SSOt：SSO技术即是顺序特异寡核甘酸法(SequenceSpecificOligonucleotide,SSO)。原理是PCR1因片段扩增后利用序列特异性寡核甘酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCRT物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素标记，通过放射自显影的方法检测，也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测。5. PCR-SSP法：序列特异性引物分析即根

5、据各等位基因的核甘酸序列，设计出一套针对每一等位基因特异性的(allele-specific)、或组特异性(group-specific)的引物，此即为序列特异性引物(SSP。SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PC布异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的。6. PCR-荧光法：用荧光标记PCFSI物的5'端，荧光染料FAMffiJOE呈绿色荧光，TAMRAg红色荧光，COUM兰色荧光，不同荧光标记的多种引物同时参加反应，PCR扩增待检测的DNA合成的产物分别带有引物5'端的染料，很容易发现目的基因存在与否。7. PCR-DNA测序：是诊断未

6、知突变基因最直接的方法，由于PCR技术的应用，使得DNA测序技术从过去的分子克隆后测序进入PCRft接测序。PCFT物在自动测序仪上电泳后测序。常用方法有：Sanger双脱氧末端终止法；Maxam-Gilbert化学裂解法；DNA«序的自动化。目前DNA顺序全自动激光测定法是最先进的方法。8. PCR旨纹图法(PCR-fingerprints):实用于快速的同种异型DR/Dwffi型。在DR/DW屯合子及杂合子个体中，每种DR单倍型及每种单倍型组合所产生的单链环状结构的大小、数目和位谿各异，由于同质双链和异质双链之间的分子构象不同。因此，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它们的迁移率各不

7、相同，从而获得单倍型特异的电泳带格局即PCR旨纹。也有人用人工合成的短寡核甘酸片段作为探针，同经过酶切的人体DNA乍Southernblot,可以得出长度不等的杂交带，杂交带的数目和分子量的大小具有个体特异性，除非同卵双生，几乎没有两个人是完全相同的，就象人的指纹一样，人们把这种杂交带图形称为基因指纹(genefinger-printing)。9. 基因芯片法:又称为DNA微探针阵列(Microarray)。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针，通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象，确定杂交探针的位谿，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基

8、因的序列。这一技术已用于基因多态性的检测。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光探针杂交技术可以大大提高芯片的准确性、定量及检测范围。应用高密度基因芯片检测单碱基多态性，为分析SNP雕供了便捷的方法。10. AFLP(AmplicationFragmentLengthPolymorphism)法AFLP技术是一项新的分子标记技术，是基于PC叱术扩增基因组DNA艮制性片段，基因组DNAfe用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA>t段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了RFL可口PC叱术特

9、点，具有RFLPtfc术的可靠性和PCRfc术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA®带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNAT增后彳#到的DNA态性可做为一种分子标记。AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段。以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA旨纹技术。11. DGGE（denaturinggradinentelectrophoresis,DGGE）法变性梯度凝胶电泳法（）DGGE!分析PCFT物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100%,检测片段可达1kb,最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链D

10、NAft变性梯度凝月$中进行到与DN侬性湿度一致的凝胶位谿时，DNA®生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNAS中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装谿,合成的PCR引物最好在5'末端加一段40bp-50bp的GC5,以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGEfe（温度梯度凝胶电泳temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE）。DGG医口TGGE匀有商品化的电泳装谿，该法一经建立，操

11、作也较简便，适合于大样本的检测筛选。12. RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA）法运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPDRandomamplifiedpolymorphicDNA随机扩增的多态性DNA）尽管RAPD技术诞生的时间很短，但由于其独特的检测DN够态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPDJ术建立于PCRfc术基础上，它是利用一系列（通常数百个）不同的随机排列碱基顺序的寡聚核甘酸单链（通常为10聚体）为引物，对所研究基因组DNAS彳TPCFT增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNAt段的多态性，这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPM用的一系列引物DNAf歹I各不相同，但对于任一特异的引物，它同基因组DNA?列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位谿，且引物3'端相距在一定的长度范围之内，就可扩增出DNAt段.因此如果基因组在这些区域发生DN%段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分