组织切片操作流程

1、组织切片操作流程组织切片操作流程切片法主要步骤1、取材与固(1)取材：从动物体取下所需的器官材料.取材的动物要健康,材料愈新鲜愈好,应在致死后立即取材,防止组织细胞自溶变性；取材的器械要锋利；所取材料力求小而薄(以不超过0.5cm为宜),不能挤压和损伤.(2)固定：将所取的材料立即投入固定液中,目的是使组织蛋白迅速凝固,使细胞内的结构和成分不再发生变化,保持组织细胞与活体相似的形态结构,固定后的组织块变硬,便于进一步处理.常用的固定剂有甲醛、乙醇、苦味酸或混合固定液.实验室常用Bouin固定液,固定时间为1224小时,其固定的组织块不需进行水洗,可直接进行脱水.2 、脱水与透明(1)脱水：固定

2、后的组织块内含有的大量水分要彻底脱去,以便石蜡的浸入.常用的脱水剂为乙醇,脱水过程必须循序渐进,从低浓度开始,逐步升高,使组织块中的水分逐渐被乙醇所取代.具体操作为：Bouin固定液固定的组织块可直接进入70%的乙醇进行脱水,时间12小时左右.假设材料暂不制片,可保存于70%乙醇中.然后将组织块依次移入85%乙醇I、H各8-12小时,95%乙醇I、n各2小时,100%乙醇I、n各1小时.因无水乙醇对组织有脆化作用,故在无水乙醇中时间不能超过2小时.2透明：由于乙醇与石蜡不能相溶,故浸蜡前要对脱水后的组织块进行透明.常用透明剂有二甲苯、氯仿、苯、香柏油或冬青油等,透明剂能同与乙醇和石蜡相溶,并能

3、增强组织块的折光系数,故透明后的组织块呈半透明状.使用二甲苯作透明剂的透明过程为：将脱水后的组织块放入无水乙醇与二甲苯混合液1:1中30分钟,再移入二甲苯中15-20分钟.3 、浸蜡与包埋1浸蜡：将透明后的组织块置于刚过熔点的熔化石蜡中浸渍,使石蜡逐渐渗入并完全置换出透明剂.过程为：先将透明的组织块移入二甲苯与石蜡混合液1:1中,在60C温箱中放置30分钟,再移入熔化的石蜡I、n、ni中,在温箱中每级各1小时.2包埋：将浸蜡后的组织块置于盛有熔化石蜡的模具中,并使之凝固成蜡块.4 、切片与贴片1切片：将修整后的蜡块夹在切片机的固定器内,使蜡块的被切面与刀口平行,刀和蜡块成一斜角,以右手摇动摇柄

4、进行切片,切片厚度以58um为宜,连续操作可形成蜡带,此时左手持毛笔轻轻取下蜡带,放于盒中.2展片：将切下的蜡片放于温水约40C的外表,使皱褶自然舒展开来.3贴片：借助别离针或镣子,将蜡片贴在洁净载玻片上.贴片后,将切片置于切片架上自然枯燥或放入温箱40c左右中烘干.5 、染色与封固1染色：染色后可增加细胞和组织中各结构间色彩的比照以便于观察.切片的染色方法很多,常用的是苏木精hematoxylin伊红eosin染色,简称HE染色.染色的具体步骤如下：脱蜡：将切片放入二甲苯I、H中,各置510分钟,溶去切片上的石蜡.将脱蜡的切片经各级浓度乙醇由高到低下行至水：将从二甲苯n中取出的切片依次经过：

5、二甲苯与无水乙醇混合液1:1无水乙醇I无水乙醇n95%JI85%乙醇70%乙醇各35分钟,最后在蒸储水中浸5分钟,即可进行染色.切片由蒸储水中转入苏木精染液染色510分钟,使细胞内的嗜碱性物质着色.用自来水洗去切片上剩余的染液.0.51%盐酸溶液分色数十秒钟.放入自来水中1520分钟、蓝化.置入70%、85%乙醇中各35分钟.置入伊红染液中染色12分钟,使细胞中嗜酸性物质着色.依次进入95%乙醇I、n100%乙醇I、n,各5分钟,以除去切片上水份.透明：切片入无水乙醇与二甲苯混合液1:1二甲苯I、II田,各5分钟.zzz常用固定液和染液的配制Bouin固定液的配制饱和苦味酸溶液75份甲醛25份

6、冰醋酸5份由于Bouin固定液的各种成分一旦混合,假设不立即使用将会失效,故Bouin固定液只能现配现用.苏木精染液的配制1Harris苏木精染液甲液:苏木素0.5g95%乙醇5.0ml乙液：硫酸铝钾钾明矶10g蒸储水100ml氧化汞0.25g冰醋酸几滴先将甲液用玻棒搅拌使苏木精溶解,再将硫酸铝钾溶于蒸储水中,并加热使之溶解,去火；迅速参加甲液,煮沸后,再去火；立即参加氧化汞后再煮沸；将此液迅速冷却后用滤纸过滤,参加几滴冰醋酸即可.此液可保存数月.苏木精染液的配制Hansen苏木精染液甲液：苏木素1g95%乙醇10ml乙液：硫酸铝钾钾明矶20g蒸储水200ml丙液：过镒酸钾1g蒸储水16ml将

7、三液分别溶化,然后将甲液注入乙液,再参加丙液3ml,时时搅拌,加温至煮沸0.51分钟,迅速冷却.0.5%伊红染液的配制将0.5g伊红溶于100毫升95%乙醇中即可.0.5%盐酸溶液配制将0.5毫升盐酸参加100毫升蒸储水固定后处理及切片一、洗涤与修切1、水洗法一般常用流水冲洗,凡用含铭或钺的固定液固定的组织块,必须用流水冲洗24h左右.常用的固定液为10%的甲醛水溶液,也必须用流水冲洗,一般时间也为24h左右,固定时间长的标本,冲洗时间也应延长.2 、酒精洗涤法凡含苦味酸或酒精的固定液固定的组织块,大多采用酒精洗涤,如苦味酸影响着色,但易溶于70%酒精.三、脱水与透明一、脱水的意义与目的组织经

8、固定和水洗后含大量水分,水与石蜡不能混合,因此在浸蜡和包埋前,必须进行脱水,脱水是借某些溶媒置换组织内水分的过程.脱水时必须由低浓度脱水剂开始,逐步转入高浓度脱水剂,以防组织过度收缩而变形,或脱水不完全而影响制片效果.脱水剂必须具有以下特性：脱水剂能与水按比例混合；高浓度,一般指不含水分；脱水剂也能与透明剂混合.3 、透明或媒浸1二甲苯：是最常用的常规透明剂,它对组织的收缩性强,易使组织变硬变脆,在二甲苯中一般30min即可使组织透明,组织块可先经过无水酒精-二甲苯混合液处理,再浸入二甲苯.也常用于切片染色后透明,且不会使染料退色.2zzz苯和甲苯：对组织收缩性较小,与二甲苯相比不易使组织变脆

9、,但透明速度慢且挥发快,适用于处理致密结缔组织、肌肉及腺体等组织的透明.4 、浸蜡组织经透明后,在溶化的石蜡内浸渍的过程称浸蜡.一般用于浸蜡的石蜡熔点为52-56C,在夏天较热时一般用高熔点石蜡,在冬天气温较低时用低熔点石蜡,主要是有利于切片的制作.时间不易过长,否那么容易造成组织脆硬,时间缺乏,也难制作良好的切片.一、石蜡包埋法石蜡包埋法为组织学技术中最常用的一种包埋法.石蜡具有不同的熔点,夏天一般用50c以上熔点硬蜡石蜡包埋,冬天用50c以下熔点软蜡石蜡包埋,软的组织用软蜡包埋,硬的组织用硬蜡包埋,一般常用的包埋熔点使52-56C,如果需要切4微米以下的切片,那么用56-60C的石蜡,较厚的切片那么用熔点为52-54c的石蜡.新蜡必须在温箱内溶化一次,以使其所含的挥发性物质蒸发,无论新蜡和旧蜡都必须加热过滤后再包埋.二、石蜡包埋法包埋过程组织块透明后,即可放入已熔的石蜡内浸蜡；一般厚度约5mm的实质性器官,总的浸蜡时间约2-3h,均在恒温箱内进行.较理想的的浸蜡温度是石蜡刚溶化的温度,或在蜡杯底部尚残留一小局部未熔完蜡时的温度,浸蜡完成后,即做成包有组织的蜡块.包埋蜡块的器材有专用的包埋框,也有自己制作的包埋盒,只要是具有一定形状的容器,我们都可以把它用作包埋盒.包埋的具体过程详述.B:切片用品准备(1)切片