ACCESS免疫化学发光技术介绍

1、ACCESS免疫化学发光技术介绍CONFIDENTIALRev. 05/07/02219901997199619951993199419921991199819992000200220012003CONFIDENTIALRev. 05/07/023免疫全系列产品Access 2UniCel DxI 600UniCel DxI 800UniCel DxC 600i分析项目UniCel DxC 660iUniCel DxC 880iUniCel DxC 680iUniCel DxC 860i一种技术的延续和相同的试剂盒在不同分析平台的使用，确保病人结果的一致性CONFIDENTIALRev. 05

2、/07/024免疫分析检测的浓度关系免疫分析检测的浓度关系临床生化10-1210-910-610-310-0pg/mLng/mLmg/mLmg/mLgm/mL免疫分析治疗药物甲状腺激素性激素特殊过敏原肿瘤标志物感染性疾病维他命心脏标志物CONFIDENTIALRev. 05/07/025丰富的分析菜单丰富的分析菜单性激素（12）雌二醇促卵泡生成激素泌乳素促黄体生成激素游离雌三醇总人绒毛膜促性腺激素 孕酮睾酮 硫酸脱氢表雄酮抑制素A性激素结合球蛋白 PAPP-A *唐氏筛查甲状腺（9）第三代促甲状腺素三碘甲状腺原氨酸游离三碘甲状腺素原氨酸甲状腺素游离甲状腺素甲状腺过氧化物酶抗体抗甲状腺球蛋白抗体

3、甲状腺球蛋白甲状腺摄取 肿瘤标志物（8）甲胎蛋白癌胚抗原BR(CA15-3) OV(CA12-5)GI(CA19-9)前列腺特异性抗原游离前列腺特异性抗原ISOFORMS PSA *贫血类（7）维生素B12 铁蛋白叶酸红细胞叶酸内因子抗体促红细胞生成素可溶性转铁蛋白受体 心血管（4）肌酸激酶同功酶-Mass肌红蛋白肌钙蛋白BNP骨代谢类（2）全段甲状旁腺激素骨碱性磷酸酶过敏原总IgE生长类人类生长激素糖尿病类胰岛素肾上腺/垂体皮质醇炎症指标白介素-6自身免疫ANA * 研发中CONFIDENTIALRev. 05/07/026免疫分析的基本概念免疫分析的基本概念CONFIDENTIALRev.

4、 05/07/027 免疫分析的基本原理免疫分析的基本原理 免疫分析是根据抗体与特异性的抗原结合的原理进行定性/定量检测的技术。 抗 原Y 抗 体CONFIDENTIALRev. 05/07/028“锁和钥匙锁和钥匙”CONFIDENTIALRev. 05/07/029免疫分析检测的发展历程免疫分析检测的发展历程免疫学方法的发展免疫学方法的发展非标记免疫非标记免疫标记免疫标记免疫CONFIDENTIALRev. 05/07/0210标记免疫技术标记免疫技术将将Ag或或Ab用标记物用标记物(如荧光素、酶、放射如荧光素、酶、放射性同位素、化学发光物质等性同位素、化学发光物质等)进行标记，在进行标记

5、，在与标本中的相应与标本中的相应Ab或或Ag反应后，可以不必反应后，可以不必测定测定Ag-Ab复合物本身，而测定复合物中复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。提高了免疫技术的敏感性。 CONFIDENTIALRev. 05/07/0211标记免疫分析技术三要素标记免疫分析技术三要素通常在检测系统中会使用到一种叫通常在检测系统中会使用到一种叫标记物（标记物（labeling）的物质的物质,常标记在抗体上常标记在抗体上通常会有一个通常会有一个分离（分离（separation）的过程在的过程在最后读取信号前最后读

6、取信号前需要去仔细关注一下分析的需要去仔细关注一下分析的模式（模式（format） CONFIDENTIALRev. 05/07/0212免疫分析的经典定义免疫分析的经典定义免疫分析免疫分析 是一种通过特异性的抗体与分析物的结合来检测或者定量抗体或抗原的一种分析技术 YAntibodyAntigenCONFIDENTIALRev. 05/07/0213IgG 抗体抗体两条重链和两条轻链分子大小 150,000 道尔顿特异性结合位点非特异性结合位点CONFIDENTIALRev. 05/07/0214免疫分析的工作定义免疫分析的工作定义免疫分析免疫分析 是利用特异性的抗体与底物结合、但不能用简单

7、的化学方法读数和检测的一种分析方法需要通过特异性抗体的标记标记形成测试系统通常需要在分析检测前进行分离（分离（异相免疫技术异相免疫技术）特别注意分析的形式 CONFIDENTIALRev. 05/07/0215免疫分析的类型免疫分析的类型均相免疫技术均相免疫技术无需分离步骤容易自动化, 但不够灵活，具有局限性比浊法 适合含量较高的大分子物质FPIA, EMIT, CEDIA 主要针对小分子分析物,特别是药物检测FPIA:荧光偏振免疫分析EMIT:多聚酶免疫分析技术CEDIA:克隆酶供体免疫分析CONFIDENTIALRev. 05/07/0216免疫分析的类型免疫分析的类型异相免疫分析技术异相

8、免疫分析技术需要分离步骤不容易自动化, 但适合多种分析方法和检测手段，较容易灵活控制高度敏感性和特异性反应时间短CONFIDENTIALRev. 05/07/0217免疫分析的类型免疫分析的类型免疫分析免疫分析 - “what”检测手段检测手段 化学发光 分离技术分离技术 磁性微粒子 结合方式结合方式 灵活多变（竞争法、夹心法）- “how”CONFIDENTIALRev. 05/07/0218检测技术检测技术免疫分析检测技术检测技术 方法多样 需要有一种 “标记物” 来生成可供检测的能量标记物可能需要或不需要活化需要有适合由该标记物生成的可检测物的侦测器（光电倍增管）分离技术分离技术 结合方

9、式结合方式 CONFIDENTIALRev. 05/07/0219标记免疫分析技术放射免疫分析酶免疫分析荧光免疫分析化学发光免疫分析CONFIDENTIALRev. 05/07/0220标记免疫分析技术标记免疫分析技术放射免疫分析放射免疫分析- RIA不稳定的分子衰减过程中释放出射线125I产生 射线发射器通过记数仪进行检测3H产生射线通过液体闪烁记数仪进行检测CONFIDENTIALRev. 05/07/0221放射免疫分析技术放射免疫分析技术优点优点敏感性高动力学范围宽干扰因素少局限性局限性有害的底物不易自动化射线半衰期短射线存在废物处理问题CONFIDENTIALRev. 05/07/0

10、222标记免疫技术标记免疫技术荧光免疫分析技术荧光免疫分析技术 - FIA原理荧光底物, 通常使用 4-MUP(4-甲基伞酮)吸收并储存能量，进入激发态，并回复到基态的过程中，多余的能量以电磁辐射的形式（发光）释放通过荧光计检测优点跟RIA具有相同的敏感性和动力学检测范围避免了RIA的半衰期短、有害物质的环境污染问题局限性容易受自动荧光素或者样本中含有的能使荧光淬灭的物质干扰应用举例Abbott - Large molecule (MEIA) assays on IMx, AxSYMCONFIDENTIALRev. 05/07/0223标记免疫技术标记免疫技术荧光偏振免疫技术荧光偏振免疫技术

11、- FPIA原理单束偏振光通过反应物通过检测偏振荧光的强度来测量所检测的物质，多采用竞争抑制法 优点属于均相免疫分析技术，无需分离步骤局限性只用于小分子分析物，采取竞争法应用举例Abbott - Small molecule assays on TDx, IMx, AxSYMCONFIDENTIALRev. 05/07/0224标记免疫技术标记免疫技术酶免疫技术酶免疫技术 - EIA原理在基本的免疫学反应完成后，加入底物催化反应通常这种反应包含有颜色变化，并且可以通过分光光度计检测 优点技术容易应用，经常用来做定性检测局限性做定量检测的时候，灵敏度差、检测范围不够宽CONFIDENTIALRe

12、v. 05/07/0225标记免疫技术标记免疫技术化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术 - CLEIA原理是一种不稳定的中间体利用化学反应释放的自由能激发中间体（底物AMPPD）当其从激发态回到基态，同时释放出等能级的光子，即引起发光具有荧光一样的特异性，但又无需激发光优点 具有放射免疫的所有优点（如灵敏度高：ACCESS达10-21 mol/L 、动力学范围宽等），同时又避免了放射免疫的缺点通过简单的光度计就可以进行读数同时由于无需激发光，可以避免杂散光的干扰，本底特别低类型 闪烁，发光 (包括 “增强”)CONFIDENTIALRev. 05/07/0226标记免疫技术的发展历程标记免

13、疫技术的发展历程荧光素荧光素(Fluorophores) FIA放射性同位素放射性同位素(Radioisotopes) RIA酶酶(Enzymes) EIA化学发光物质化学发光物质 - CLIACONFIDENTIALRev. 05/07/0227化学发光免疫技术化学发光免疫技术化学发光物质化学发光物质 - CLIA原理原理 某些某些 化合物（发光底物）可以利用一个化学反应产生的能量使其产化合物（发光底物）可以利用一个化学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子升至电子激发态。当此产物分子或中间态物分子或反应中间态分子升至电子激发态。当此产物分子或中间态分子衰退回基态时，以发射光子的形式释放

14、能量。）分子衰退回基态时，以发射光子的形式释放能量。）优势优势 - 具备具备RIA所拥有的优势所拥有的优势(灵敏度和宽线性灵敏度和宽线性),但排除其缺点但排除其缺点用一个简单的光度计读数用一个简单的光度计读数非常低的背景干扰非常低的背景干扰类型类型 - 闪烁闪烁(flash), 连续连续(glow) 发光发光(包含包含 “增强发光增强发光”)CONFIDENTIALRev. 05/07/0228化学发光物质化学发光物质AMPPD, Dioxetane (Lumi-Phos 530TM)代表性分析系统代表性分析系统BCI - Access/Access 2 /DxI800DPC - Immuli

15、te/Immulite 2000Fujirebio - Lumipulse 1200CONFIDENTIALRev. 05/07/0229 ACCESS使用的发光底物使用的发光底物AMPPD 目前性能最好的化学发光底物目前性能最好的化学发光底物4-甲氧基甲氧基-4-（3-苯磷酸盐）螺苯磷酸盐）螺-（1，2-二螺二螺4，4二二氧己烷氧己烷-3，2-金刚烷金刚烷4-methoxy-4-(3-phosphatephenyl)-spiro-(1,2-dioxetane)-3,2adamantaneAMPPD是一种金刚基二螺是一种金刚基二螺4，4二氧己烷的磷酸酯。经二氧己烷的磷酸酯。经ALP水解生成一种

16、不稳定的阴离子，该阴离子分解时水解生成一种不稳定的阴离子，该阴离子分解时持持续续发光。发光强度发光。发光强度稳定稳定，与，与ALP成正比。成正比。CONFIDENTIALRev. 05/07/0230ACCESS Dioxetane 化学发光物质化学发光物质O-OOOCH3O-OOCH3*LIGHTAlkalinePhosphatase OOOCH3OPO3Na2发光底物在碱性磷酸酶作用下磷酸酯基发生水解，脱去一个磷酸基而得到一个中等稳定的中间体AMPD-，(半衰期230分钟)。此中间体分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当其回到基态时产生470nm的

17、光，并可持续几十分钟。CONFIDENTIALRev. 05/07/0231ACCESS Dioxetane化学发光物质化学发光物质稳定持续的发光稳定持续的发光RLU00 5 10 Time (minutes)55 60 CONFIDENTIALRev. 05/07/0232分离技术分离技术标记免疫分析标记免疫分析检测技术检测技术分离技术分离技术(Separation) 有很多方式有很多方式典型的是典型的是,特异性结合的分析物被保留而未结合物特异性结合的分析物被保留而未结合物质和无用的反应物被清除质和无用的反应物被清除 分析模式分析模式 CONFIDENTIALRev. 05/07/0233A

18、CCESS磁颗粒分离技术磁颗粒分离技术磁性微粒子技术的优点：磁性微粒子技术的优点：快速分离结合相与游离相快速分离结合相与游离相提高与提高与Ag或或Ab包被亲和力包被亲和力提高接触表面积提高接触表面积/反应容量比例，实现微量分析反应容量比例，实现微量分析不需要抗体分离步骤，杜绝干扰与交叉反应不需要抗体分离步骤，杜绝干扰与交叉反应允许共价耦合反应，因此可以检测大允许共价耦合反应，因此可以检测大/小分子的各种物质成小分子的各种物质成分分能应用各种分析设计与反应模式，扩大应用范围能应用各种分析设计与反应模式，扩大应用范围 如：夹心法，竟争法，抗体检测法等如：夹心法，竟争法，抗体检测法等利于检测自动化与

19、微量分析利于检测自动化与微量分析CONFIDENTIALRev. 05/07/0234分析模式分析模式标记免疫分析标记免疫分析检测技术检测技术分离技术分离技术 分析模式分析模式- 有很多种方式有很多种方式可定义为分析的可定义为分析的 “处方处方”设定一个最优化的模式设定一个最优化的模式(可变量可变量)去最大化项目的去最大化项目的临床应用临床应用 CONFIDENTIALRev. 05/07/0235Access 的分析模式的分析模式基本分析模式基本分析模式夹心法夹心法(Sandwich)抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测 竞争结合竞争结合(Competitive binding)试剂的加入试剂的

20、加入 同步同步(Simultaneous) (1步步, 1次清洗次清洗)分步分步(Sequential) (2步步, 2次清洗次清洗)“Piggyback” (2步步, 1次清洗次清洗)CONFIDENTIALRev. 05/07/0236ParamagneticparticlesMousemonoclonalanti-BhCGGoat anti-mouseIgG+Samplecontaining BhCG+Rabbit anti BhCG- alkaline phos-phatase conjugate37 C清洗去除未结合物质底物加入发光CONFIDENTIALRev. 05/07/023

21、7+钩状效应（Hook Effect）磁颗粒羊抗鼠IgG抗体抗-hTSH鼠单克隆抗体YYYY YY羊抗-hTSH检磷酶标记物样品中含 1,000mIU/mLhTSHYYYYYYY37 CCONFIDENTIALRev. 05/07/0238YY清洗步骤YYYY37 CYYYDioxitane-PO437 C钩状效应（Hook Effect）YDioxitaneCONFIDENTIALRev. 05/07/02392步步,夹心法抗体检测夹心法抗体检测+YY标记碱性磷酸酶的鼠单克隆抗人-IgG抗体YY样品中的抗疯疹病毒的IgG抗体YY+磁颗粒疯疹病毒抗原37 CYY第1步孵育和清洗CONFIDEN

22、TIALRev. 05/07/02402步步,夹心法抗体检测夹心法抗体检测第2步孵育和清洗YYY37 CYYYYYYYYDioxitane-PO437 CDioxitaneCONFIDENTIALRev. 05/07/0241夹心法的定标曲线6 个逐渐增加的不同浓度水平的标准品信号与浓度呈正比关系CONFIDENTIALRev. 05/07/0242夹心法分析模式夹心法分析模式捕捉抗体捕捉抗体(Capture antibody)和标记抗体和标记抗体(labeled antibody)每个抗体的存在可以与更多的分析物发生反应每个抗体的存在可以与更多的分析物发生反应分析更可靠分析更可靠,精确精确,

23、准确和可重现性准确和可重现性分析更灵敏因为所有分析物都参与反应分析更灵敏因为所有分析物都参与反应CONFIDENTIALRev. 05/07/0243夹心法分析模式夹心法分析模式捕捉抗体捕捉抗体(Capture antibody)和标记抗体和标记抗体(labeled antibody)每个抗体的不同可以针对不同的抗原决定簇，每个抗体的不同可以针对不同的抗原决定簇，或二个在同一个抗原决定簇或二个在同一个抗原决定簇分析更特异因为二个抗体同时反应分析更特异因为二个抗体同时反应受限制于检测大分子物质受限制于检测大分子物质bhCG hTSHIgEProlactinhFSH hLHFerritinChla

24、mydiaCONFIDENTIALRev. 05/07/0244+磁颗粒羊抗鼠抗体Y1步,竞争法鼠单克隆抗可的松抗体YY+可的松标记的碱磷酶样品中的可的松37 CYYYCONFIDENTIALRev. 05/07/0245清洗步骤1步,竞争法Dioxitane-PO437 CYYY37 CYYYDioxetaneCONFIDENTIALRev. 05/07/0246竞争法的标准曲线竞争法的标准曲线6 个逐渐增加的不同浓度水平的标准品信号与浓度呈反比关系CONFIDENTIALRev. 05/07/0247竞争法分析模式竞争法分析模式只有捕捉抗体只有捕捉抗体主要针对小分子物质检测主要针对小分子物

25、质检测 没有足够表面积的分析物去符合没有足够表面积的分析物去符合 “夹心法夹心法” 要求要求 T3FT3 B12 Digoxin ProgesteroneT4 FT4 Folate Cortisol EstradiolCONFIDENTIALRev. 05/07/0248加入样品,磁颗粒和试剂孵育使反应物结合在磁场中清洗去除未结合物质加入底物产生信号孵育,促使信号的产生信号检测CONFIDENTIALRev. 05/07/0249Samples loadedReagent loadedPipettor transfers fluids to reaction vesselVessel incu

26、batesVessel is washedVessel incubates and is readVessel is sent to wasteCONFIDENTIALRev. 05/07/0250分析模块分析模块Supplies tracked automaticallyReaction vessels (RVs)Reaction vessel waste bag3 hour walkaway timeCONFIDENTIALRev. 05/07/0251分析模块分析模块Wash arm3 dispense probes3 aspirate probesSubstrate probeWash

27、 carouselMoves RVs through wash process, substrate incubation and signal readingContains magnetsSupports mixer beltAttached to luminometerReads RLUs (Relative Light Units) of each RVSubstrate probeAspirate probesDispense probesCONFIDENTIALRev. 05/07/0252液路模块液路模块Supplies tracked automaticallySubstrat

28、eWash bufferLiquid waste3 hour walkaway timeCONFIDENTIALRev. 05/07/0253液路模块液路模块Fluids traySupplies bulk fluidsStores liquid wasteLiquid waste bottleWaste exhaust filterSubstrate bottleBuffer bottleBuffer reservoirWeight sensorFloat sensorCONFIDENTIALRev. 05/07/0254电子模块电子模块Hard disc driveReset button

29、Floppy driveCard cagePower supplyCONFIDENTIALRev. 05/07/0255Chassis Base ModuleTop coverFront panelCarousel doorSupply coverBase panelCONFIDENTIALRev. 05/07/0256病人样品中可能自然产生一些针对动物免疫病人样品中可能自然产生一些针对动物免疫球蛋白的抗体球蛋白的抗体(通常是鼠或羊通常是鼠或羊)来源于暴露于这些动物或接受过动物血清的治疗来源于暴露于这些动物或接受过动物血清的治疗分析的干扰分析的干扰可以在双单克隆夹心法分析模式中引起假阳性可以在

30、双单克隆夹心法分析模式中引起假阳性可以在单克隆可以在单克隆/多克隆分析模式中出现假阴性多克隆分析模式中出现假阴性CONFIDENTIALRev. 05/07/0257封闭剂可以加在反应基质中或整合在试剂盒内封闭剂可以加在反应基质中或整合在试剂盒内鼠鼠 (鼠科类鼠科类), 鸟鸟 (鸟科类鸟科类) 和羊蛋白和羊蛋白各个厂家生产的分析试剂都有可能会不同程度的受各个厂家生产的分析试剂都有可能会不同程度的受到任何一个病人血清的影响！到任何一个病人血清的影响！CONFIDENTIALRev. 05/07/0258试剂说明书的数据试剂说明书的数据期望值期望值(参考范围参考范围)研究研究正常人群的分布正常人群

31、的分布?非正态的分布非正态的分布?分析系统的详细说明分析系统的详细说明每个实验室必须自己建立人群的正常值每个实验室必须自己建立人群的正常值CONFIDENTIALRev. 05/07/0259Test Result FlagsFatalSYS: system error that is known or likely to affect the sample resultTMP: temperature out of range substrate, incubator, wash carousel QNS: quantity (of sample) not sufficientNCR: No calibration RLU: RLUs out of range of PMT, either 30,000,000NRV: supplies insufficientAppears on screen during runSample status r