植物细胞组织培养专业技术实验书

1、植物细胞组织培养技术实验指导书中国计量学院生命科学学院二零零六年七月植物细胞组织培养实验指导实验一、植物组织培养培养基母液的配制 实验二、植物组织培养的培养基配制 实验三、康乃馨的离体快繁 实验四、胡萝卜愈伤组织的建立 实验五、组织培养物的继代培养实验一 组织培养基母液的配制一、仪器及药品冰箱、天平（ 0.0001g）容量瓶 : 1000 ml, 500 ml、250 ml、100 ml、 25 ml广口储液瓶： 500 ml、250 ml、50 ml、25 ml烧杯： 1000 ml 、500 ml 、 250 ml、100 ml 、50 ml 数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺或挖耳勺标签纸、

2、胶水、50%酒精、95%酒精、1 mol/L盐酸、1 mol/L NaOH 几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等 药品蒸馏水二、方法和步骤：按照培养基配方 ,把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类,每一类中各种药品分别称量，如N6培养基各种母液的配制步骤如下：大量元素母液：包括用量较大的几种化合物见 N6培养基配方，按表中 排列顺序 ,将每种药品的用量扩大 10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混 合在一起。如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容，最后加上蒸馏 水，定容至 1升或500毫升。在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃搅棒以减少 误差。定容后的

3、溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1 L培养基需吸取该母液 100 ml 或 50 ml。微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便 ,常配成 100倍或1000倍的 母液，即每种药品扩大l00倍或者l000倍。逐个溶解，混合在一起成为微量元素 母液，每配1 L N6培养基需吸取该母液10 ml或者1 ml。铁盐：在N6培养基中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSQ?7H2O） 2.78 g 和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）3.73 g,分别溶解，混合后，用酒精灯加热 半小时以上，冷却后定容至1 L。冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制。每 配l升N6培养基需加该铁盐母液5 ml。有

4、机物质：主要指氨基酸，维生素类物质。它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入。植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、萘乙酸（NAA ）、吲哚乙酸（IAA ）、 吲哚丁酸（IBA）;细胞分裂素类：激动素（KT ）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA ）、 玉米素（ZT）。配制时需要单个称量，根据需要可分别用酸、碱或酒精等不同 的溶剂溶解后，再用蒸馏水配制成所需的浓度，一般为每ml含0.1-2 mg,配制培 养基时按所需要的量分别加入，本实验中的 2,4-D和6-BA均配成1 mg/ml的母液。在配制吲哚乙酸（IAA ）母液时，先用几滴95%酒精溶解完全后，加蒸馏

5、水 定容，否则会发生沉淀。而配制6-BA母液时，要用少量的1 mol/L NaOH溶解； 而配制2,4-D时，可先用少量的95%酒精溶解。表1 N6朱至清（1975）培养基配方药品名配方量（mg/L）母液倍数称取量（g/L）(NH4)2SO4r ,曰人量儿糸46310X4.63KNO32 83028.3CaCb 2H2O1661.66MgSO4 7H2O1851.85KH2PO44004.0Na2- EDTA铁盐37.3100X3.73FeSC4 7H2O27.82.78MnSO4 4H2O微量儿糸4.01000 X4.0ZnSO4 7H2O3.83.8H3BO31.61.6KI0.80.8盐

6、酸硫胺素（VB1）有机物质11000 X1.0烟酸0.50.5盐酸吡哆醇（VB6）0.50.5甘氨酸2.02.0各种母液配制好后，要贴好标签，注明母液的名称，配制 1 L培养基需要的 吸取量、母液配制的日期， 然后放入冰箱中储存。 一般无机物质的母液在冰箱中 可保存半年以上， 有机物质的母液保存时间在半年以内， 但若发现有沉淀或霉变 应立即需重新配制。三、注意事项1. 如药品所带结晶水不同，应进行换算。2.因常用的MS培养基中硝酸铵（NH4NO3）属于公安部门严格限制管理的药品, 所以本实验采用N6培养基替代MS培 养基。实验二培养基的配制一、仪器设备及试剂电炉天平(0.0001 g)咼压火菌

7、锅量筒：10 ml、20 ml、100 ml、500 ml烧杯：1000 ml、500 ml、250 ml移液管：1 ml、2 ml、5 ml吸管若干、记号笔三角瓶或试管、试管架锡铂纸、玻璃棒配制好的各种母液，如大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物、生长调节剂等，个别生长调节剂要随配随用。蒸馏水、pH试纸蔗糖、琼脂等1 mol/L NaOH 溶液、1 mol/L HCl 溶液。二、方法和步骤1量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配I升培养基，先量取约700 ml体积的水。2根据培养基配方， 用量筒量取所需要的各种元素的母液。物质加入体积或重量大量兀素母液(10X)100ml微量元

8、素母液(1000 x )1 ml有机物质母液(1000 x )1 ml铁盐母液(1000X)10 ml蔗糖30 g琼脂8 g吸取母液时，注意应先将几种母液按顺序排好，不要弄错以免使培养 基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素，如 本实验中培养康乃馨侧芽或茎段时就加入 1ml的1 mg/ml的6-BA ;而另一个 实验胡萝卜愈伤组织培养中应加入2ml的1 mg/ml的2,4-D。加入一种母液后 应先搅拌均匀，避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀，琼脂可于加入 蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌，以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯 底而炭化。加热至沸腾片断，以使琼脂充分溶解，检查

9、时可注意烧杯内溶 液是否透明。3调节培养基的pH值，用pH计或pH试纸测定培养基的pH按照培养材料的要求分别用1 mol/L NaOH溶液、1 mol/LHCl溶液来调节所配制培养基的pH值，一般培养基的pH值约为5.8,培养的 材料不同，对培养基的pH值要求也不同。4 分装 将配制好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶， 用锡铂纸封口， 注明标签，然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道 进行高压灭菌。5 培养基的灭菌 一般用手提式医用高压锅来灭菌（方法略），本实验采 用全自动高压灭菌锅。6 培养基的保存 消毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存， 一般 应在消毒后的两周内用

10、完，最好不要超过一个月。三、注意事项激素应在调节 pH 之前加入，因为有些激素是用酸或碱溶解的，在调节 pH 好之后加入会改变 pH 值。 pH 过酸或过碱对培养基均是不利的，会导致过软或 过硬的结果，从而影响培养质量。在本次实验中将下次实验所需的其它材料一同灭菌处理。实验三 康乃馨的离体快繁、 仪器设备和试剂超净工作台、带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水培养基 N6+1 mg/L 6-BA剪刀、枪型镊子量筒、酒精灯、滤纸、蒸馏水、小刷子95%乙醇、 70%酒精、 70%酒精棉球、 0.2%升汞、甲醛、高锰酸钾、来苏尔 纱布、棉塞、牛皮纸、才培纯、肥皂、酒精喷壶 植物的嫩茎、侧芽、茎尖、叶片、花

11、、愈伤组织上的不定芽、胚状体、试 管苗等二、实验材料 康乃馨枝条三、方法和步骤1 外植体灭菌 取从市场上购买的康乃馨枝条 ，去掉大的叶片，剪取带腋 芽的节结，用肥皂（洗洁精）清洗表面，再用自来水冲洗30-60分钟，然后在无菌室（超净工作台）内用 70%酒精浸没 20-40秒钟（根据材料的木质化程度掌握 具体的浸没时间。用 0.2% 的升汞溶液浸泡 10-15分钟，再用无菌水冲洗 3-4次， 放入已灭菌的培养皿中的滤纸上待用。2 接种 先进行无菌室内消毒，用紫外灯照射 30-45分钟，地面用低浓度的 来苏尔溶液消毒，紫外灯关闭约 20分钟后方可进去工作。超净工作台消毒 开启无菌风开关，让无菌风吹

12、上 30-45分钟后方可工作。 并用 70% 的酒精棉球擦净工作台。接种时先点燃酒精灯， 镊子和剪刀都要先浸泡在 70%的酒精溶液中。 用酒精 灯上灼烧好冷却后的镊子、 剪刀取出一个侧芽或小段茎， 迅速打开三角瓶口， 将 材料才插入瓶内，注意材料上下端的极性，不能倒插。在酒精灯边塞回锡箔纸， 用记号笔在瓶体上写明日期和材料。3培养条件：25C光照13小时/天 光强1000 Lux4 继代培养（见下一个实验）5 诱导生根：用低浓度的吲哚乙酸或者萘乙酸或无激素的 N6 培养基诱导生根6 试管苗移栽参见有关其它实验实验四 胡萝卜愈伤组织的建立一、材料和设备 超净工作台或者无菌接种室 培养基 N6+2

13、 mg/L 2,4-D 带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水 解剖刀、枪型镊子、刀片 无病虫的胡萝卜直根数十个 消毒剂 0.2%的升汞溶液 70%酒精、 95%酒精及 70%的酒精棉球1000毫升的玻璃烧杯数个、酒精灯、火柴、记号笔、小刷子（可用一次性 牙刷）二、实验材料 新鲜胡萝卜、胡萝卜愈伤组织三、实验步骤 1 选择无伤、无病、形状较规则的胡萝卜，用小刷子在流动的自来水下洗 刷胡萝卜，除净表面所有的泥屑。可以根据实验的时期，选用其它的实验材料。2将胡萝卜切成大约 40 mm厚的片段，放入100或500 ml的烧杯中，倒入消 毒液，将植物材料覆盖、浸泡10-30 min。在灭菌过程中，在每个材料

14、上做好标 记，并对应地放在预接种的培养基边上。 接种后在培养瓶上标明培养物名称和培 养日期。3 在超净工作台上，倒掉消毒液，用无菌水冲洗 3-5次，以便去除残留的消 毒液。4 取消毒过的胡萝卜放入已灭菌的带有滤纸的培养皿中， 用无菌解剖刀从两 端各切去 10毫米，再将留下的胡萝卜直根切成一系列一毫米厚的横切片。 取其中 的一片转到另一个已灭菌的带有吸水纸的培养皿中， 再将每一片切成小块， 使其 每个小块上均包含木质部、形成层和韧皮部，外植体的大小要尽量一致。5接种 取下培养瓶的塞子（或锡铂纸），用火灼烧瓶口 2 cm处，手持培养 瓶呈45。角，用消毒镊子把4-8块外植体转到琼脂培养基的表面，注

15、意把靠近根尖 的一面接触培养基。 然后立即将烧过的封口棉塞或锡铂纸封住瓶口。 每两次转移 之间都要用酒精灯灼烧镊子，防止带菌。6培养 接种好的外植体在25C的培养箱中，黑暗条件下培养四周左右就会形成一块较大的愈伤组织。实验五 组织培养物的继代培养一、 材料和设备材料 从培养 4-6周的外植体上长出的愈伤组织、丛生芽或胚状体超净工作台培养基 N6+0.5 mg/L 2,4-D N6+2 mg/L 6-BA （也可以自已设计） 三角瓶、带有吸水纸的成套的培养皿、镊子、解剖刀 70%酒精、 95%酒精及 70%的酒精棉球 酒精灯、火柴、记号笔、酒精喷壶二、方法步骤1 取材 在无菌室的超净工作台内， 每次取一瓶培养物， 灼烧培养瓶口约 20 毫米处，用灼烧冷却后的镊子和解剖刀， 取出外植体或者愈伤组织放在无菌的培 养皿中。每个培养皿中约放 4-6个外植体或者愈伤组织。把每块愈伤组织分成两、 三个不小于5 mm见方的小块。外植体下面向着中心的细胞常呈坏死状 ，不适宜作 继代培养。 这些坏死的部分应当与正常的部分分离并弃去。 每次操作后要去掉用 过的吸水纸并重新盖上培养皿的盖子。2 继代转接 将正在发育的外植体或愈伤组织转移到新鲜培养基上， 接种方 法同前。转接后在培养瓶上写明培养物、培养基、日期。长期培养的胡萝卜组织 会产生大块愈伤组织 。正在发育的愈伤组织作第一次继