(SOP)时间分辨荧光免疫分析实验操作指南

1、时间分辨荧光免疫分析实验操作指南以及注意事项第一节时间分辨反应过程图TRFIA的操作要点优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证TRFIA检测结果准确可靠的必要条件。下面列出TRFIA各个操作步骤的注意要点，严格遵照规定操作.1、样本的采取和保存TRFIA测定的样本一般为血清。不能使用含抗凝剂EDTAF口柠檬酸的样本，因为二者可以螯合筠，使测定值降低。血清样本可按常规方法采集，溶血和脂血样本可能会影响测值。样品在2C-8c可以保存3-5天,如果需要长期保存，请20c保存，避免反复冻融。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，宜轻缓充分混匀，避免气泡，可上下颠倒混和。不要把样本保存在室温，室温

2、放置48小时可能会导致结果不稳定。2、试剂的准备整个实验过程应尽量在干净无尘的环境下进行实验前应检查试剂盒的出厂日期以确定试剂盒是否过期，一般自产品检验合格出厂日期起有效期为一年。按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。TRFIA中用的去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的去离子水。从冰箱中取出的试验用试剂应待其温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。试剂盒中的标准品或铕标试剂若是冻干的状态，第一次开盒做实验在加去离子水溶解标准品或铕标后，请不要立刻开始使用，静置10分钟左右待其溶解完全后再开始。板条若未能一次用完，剩余板条用塑料袋（内有干燥剂）封口后密

3、封保存。TRFIA受反应温度的不恒定、操作误差以及钻标记物的稳定性等因素的影响，不同日期的荧光值会有所波动，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。3、加样在TRFIA中一般有3次加样步骤，即加样本，加铕标记物，加增强液。加样时应将所加物加在微孔板的底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。加样本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。加不同的样本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加铕标记和增强液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。连续加样器使用时要连续流畅，并不是加样越慢越好！加样时检测吸嘴是否堵塞，加量是否足够，注意吸头之间是有差异的。

4、加样品时把样品按12个一排排好，做时每加样一个，就把它前移一排，这样不容易出错。注意按操作步骤计算试剂的量是否充足，特别是使用全自动仪器时！使用干净的一次性容器配制铕标记物。铕标记物的污染是造成实验本底增高的首要原因。注意铕标记物的瓶盖不要与标准品瓶盖混用；所有接触过铕标记物的用品使用完毕应该丢弃，不能重复使用。注意铕标记物原液和工作不要污染实验台面、加样枪及试剂盒中的其他组份。4、孵育在TRFIA中一般有一次或两次抗原抗体反应，即加样本和铕标记物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为孵育，或者温育。目前TRFIA常用模式在微孔板中进行，属固相免疫测定，抗原、抗体的结合

5、只在周相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的样本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗体结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的钻标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么TRFIA反应总是需要一定时间的孵育。孵育在室温进行即可。室温一般指20-25Co室内温度白高低会影响TRFIA的荧光值，升高，抗原抗体反应加速，荧光值提高。反之，则降低。全自动仪器，孵育过程在一个恒温（25）的孵育器内完成，荧光值比较恒定。如果使用半自动仪器，孵育过程需要加盖封片，防止污染和液体的挥发。TRFIA房孵育过

6、程一般在振荡器上完成，注意调节振荡的幅度和频率。振荡的幅度太大、频率太高，微孔板内液体可能溢出，影响实验结果；振荡的幅度太小、频率太低，抗原抗体反应不完全，也可能影响实验的结果。振荡器上的微孔反应板不宜叠加堆放。叠加可能造成反应板的洒落，同时可能造成反应的不均匀。孵育的温度和时间应严格遵照说明书规定。不同的检测项目，待测物质的性质不同，反应的时间是有差别的。5、洗涤洗涤在TRFIA不是一个反应步骤，却也决定着实验的成败。TRFIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的铕标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。在TR

7、FIA操作中，洗涤是最比较的关键技术，操作者应严格按要求进行。TRFIA的洗涤方式一般使用自动洗板机，不需手工操作。洗板机在每天使用时应进行校正注液量和残留量，注意管道是否通畅。洗涤时，确认每孔中的洗涤液都注满微孔，洗涤后，需将板倒扣在无尘吸水纸上拍干，拍干完毕，将反应板对光检查，孔底内外侧均必须无残留液体。注意微孔反应板的底部不要弄脏或划伤，不要用手摸微孔反应板的底部。6、加增强液TRFIA技术特点之一就是抗原抗体反应完毕，加增强液，使得荧光信号增强100万倍，检测灵敏度大大提高。加增强液时，最好能每次吸取增强液都更换枪头，如果不更换枪头，加增强液时应悬空加入，千万不要让吸头碰到小孔边缘或其

8、中试剂而造成增强液污染。增强液的体积数应严格按说明书的要求；加完后增强液不能洒出；一旦洒出，此次实验无效，需要重做。第二节时间分辨试剂盒的组成包括：包被反应板：一块，96孔。铕标记抗抗体：一瓶，冻干品，用时每瓶以1ml去离子水溶解缓冲液参考标准品：共六瓶。增强液：一瓶，50ml。浓缩洗液25:一瓶，50ml,使用前用去离子水作1:25稀释。分析缓冲液：一瓶，50ml。说明书：一份。第三节时间分辨操作基本步骤Eu3+（1）双抗体夹心法（检测抗原）：一抗包被、封闭一加入检测样品一加入标记的二抗一加入增强液一检测JrisiAFP lii sample k + : Solid pbasc： anii-

9、AFP例如：TRFIA法检测甲胎蛋白（AFP）实验方法1.试剂的准备1ml1)甲胎蛋白参考标准品：使用前一小时将每瓶甲胎蛋白参考标准品用去离子水溶解。2)洗涤液：将50ml浓缩洗液和1200ml去离子水混合，作为工作洗涤液。3) 铕标抗体工作液：使用前一小时将每瓶铕标记抗甲胎蛋白抗体用1ml去离子水溶解，用分析缓冲液以1:75倍稀释作为铕标抗体工作液。2 .将所需数量的包被反应条置室温平衡。3 .每孔加25l甲胎蛋白参考标准品或样品。a、 选一支最接近25l的加样器，因为参考标准品是实验最关键的第一步，所以加样量要求非常准确。b、 在吸参考标准品时枪要在液体内吹打4次，使枪头内的表面张力平衡，

10、从而达到吸样时进一步减少误差。c、将样品加入到反应孔中要注意枪要垂直轻轻靠在孔壁上打入样品，要保持一个样品一只枪头，这样可以避免加样污染和孔内包被物不受加样影响。4 .加200l分析缓冲液，振动孵育1小时。a、 剪一张与加样条大小相似的封口膜平稳封上加板条，写上标记。b、 将样品板放入震荡器时注意，减速、平稳、轻巧、放入震荡器中。5 .用洗涤液冲洗4次。a、洗板时要注意板一定要与洗板机的样品架吻合6 .每孔加钻标抗体工作液2001,振动孵育1小时。a、筠标是是实验最关键的第二个步骤，所以配箱标时一定要保证，比例准确、充分混匀、加样量准确。7 .用洗涤液冲洗6次。a、洗板时要注意板一定要与洗板机

11、的样品架吻合8 .每孔加增强液2001,振荡孵育5分钟a、增强液是实验最关键的第三个步骤，虽然增强液是一个不要做任何处理就可以直接使用，但它是一个最形容污染的液体，所以加增强液时一定要注意，加增强液枪头不能碰样品孔、吸增强液手法要轻柔避免液体反压力过大回流到加样器内。9 .测定。夹心法，浓度与荧光值成正比。双抗体夹心法标准曲线图1（LOGLOGB拟合方式）（2）竞争法（检测抗体）：例如：TRFIA法检测总三碘甲状腺原氨酸（TT3）实验方法抗原包被、封闭-加入一抗/检测样品-加入Eu3而记的二抗f加入增强液检测1. 试剂的准备1） 总三碘甲状腺原氨酸参考标准品：使用前一小时将每瓶总三碘甲状腺原氨

12、酸参考标准品用1ml去离子水溶解。2）洗涤液：将50ml浓缩洗液和1200ml去离子水混合，作为工作洗涤液。3） 铕标抗体工作液：使用前一小时将每瓶铕标记抗总三碘甲状腺原氨酸抗体用1ml去离子水溶解，用分析缓冲液以1:50倍稀释作为铕标抗体工作液。2. 将所需数量的包被反应条置室温平衡。3 .吸取50屋参考标准品或待测样品，按顺序加入微孔反应条小孔中，然后各加100屋箱标记三碘甲状腺原氨酸工作液和100屋抗三碘甲状腺原氨酸抗体工作液。a、选一支最接近501和1001的加样器，因为参考标准品是实验最关键的第一步，所以加样量要求非常准确。b、在吸参考标准品时枪要在液体内吹打4次，使枪头内的表面张力平衡，从而达到吸样时进一步减少误差。c、将样品加入到反应孔中要注意枪要垂直轻轻靠在孔壁上打入样品，要保持一个样品一只枪头，这样可以避免加样污染和孔内包被物不受加样影响。4 .室温振动孵育1.5小时a、剪一张与加样条大小相似的封口膜平稳封上加板条，写上标记。b、将样品板放入震荡器时注意，减速、平稳、轻巧、放入震荡器中5用洗涤液冲洗6次，拍干。a、洗板时要注意板一定要与洗板机的样品架吻合。6 .每孔加增强液200仙1,振荡孵育5分钟。a、增强液是实验最关键的第二步，虽然增强液是一个不要做任何处理就可以直接使用，但它是一个最形容污染的液体，所以加增强液时一定要