感受态细胞制备

1、感受态细胞制备实验目的1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术；2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法；3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。实验原理 在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被 导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培 养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必 须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而 获得大量的克隆基因。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一 阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期 时，才会处于感受态 , 如大肠杆菌。大肠杆菌的感受态细胞 制备原理是取对数生

2、长期的细菌处于0 C, CaCI2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 C短时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA复合物，在丰富培养基 上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细 菌中，重组子中基因得到表达。对这种现象的一种解释是 CaCI2 能使细菌细胞壁的通透性增强， 目前还可以使用电激 的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率 往往比化学法高出 1 到 2 个数量级，达到 1x108 转化子每 1 卩gDNA甚至1x109转化子每1卩gDNA所以常

3、用于文库构 建时的转化或遗传筛选化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70 C保存，因此被广泛用于外源基 因的转化。物理制备法：电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电 击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促 使DNA进入细菌，转化率最高能达到1091010转化子/卩g 闭环DNA因操作简便，愈来愈为人们所接受。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子， 根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公 式如下：转化总数=菌落数X稀释倍数X转化反应原液总 体积涂板菌液体积转化率（转化子数/每 卩g质粒DNA =转化子总数/ 质粒DNA加入量

4、（卩g）理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数为 1*10 10实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、 移液枪、锥形瓶、离心管、 LB 液体培养基、实验试剂：O.IMCaCb溶液、含10%甘油的O.IMCaCb溶液、GYT三蒸水、10%甘油的水溶液、DH5况、TopIO、DE3 BL21、 液氮、冰水。实验步骤 (一)化学感受态细胞的制备(1) 菌种的活化：取-70 C的冰箱中感受态细胞 DH5%、Top10、DE3 BL21在LB的平板上进行划线分离。(2) 菌种的前培养：从LB平板上挑取相应的单菌落，接种 于10mlLB液体培养基中，37C振荡培养过夜至对数生长中 后期

5、。(3) 菌种的准备：将该四种菌悬液以 1:100 的比例分别接 种于四个不含有抗生100mlLB液体培养基锥形瓶中,37 C振 荡培养大约 2.5 小时至 OD=0.40.5。( 4)感受态细胞的制备： 把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把 100mL培养 液均匀分成两份到50mL离心管中，在4C、3000转每分钟， 离心 10min。 弃去上清液，加入 30mL0.1M的CaCl2溶液，轻轻混匀， 在冰水中静置 30min。 弃去上清液，加入 30mL0.1M的CaCl2溶液，用巴氏管轻轻吹吸让沉淀充分混匀，在冰水中静置30min。 从冰水中取出4C、3000转每分钟，离心10min,弃

6、去上 清液并用移液枪轻轻地把多余的液体吸干净，加入 0.5mL 含 10%甘油的 0.1MCaCl2 溶液。用巴氏管轻轻吸起液体打到 壁上使沉淀混匀并放置在冰上。 把液氮倒到小的塑料盒子里，在离心管架子上摆放好0.5ml 离心管，用剪过的移液枪头进行分装， 每个离心管中 分装40卩L悬浮液。 迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放到标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70 C保存。（二）电转化的感受态细胞的制备第 1、 2、 3 步同化学转化的感受态细胞的制备过程的 1、 2、3 三步相同。（4）制备感受态细： 把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把 100mL 培养液均匀分成两

7、份到 50mL离心管中，在4C、3000转每 分钟，离心 10min。 弃去上清液，加入30mL三蒸水，用巴氏管吸起液体打到离心管壁上使沉淀充分混匀，在4 C、3000转每分钟下离心10mi n,倒去上清。重复两次； 再加入30mL含10%甘油水溶液，在 4C、3000转每分钟下离心10mi n,重复一次。 弃去上清液，加入 0.5mLG YTmedium含有10%Glysiron 、0.125%YeastExtraction 、0.25%Trypton) ， 放置在冰上。(5) 准备好成有液氮的塑料盒子和把0.5mL离心管若干放到离心管架子上，将悬浮的感受态细胞分装在离心管中， 每管40卩I

8、，迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻， 然后放在标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中，-70 C保存。三)效价检测1、化学转化：( 1)取化学转化感受态细胞于冰上解冻，同时把标准 质粒PUC19稀释十倍置于冰上。(2) 在含有40卩I感受态细胞的0.5ml离心管中加入1卩L稀释后的标准质粒充分混匀。冰上静置30min。(3) 将离心管置于42 C干式恒温器上90s，然后迅速 放回冰上，使细胞冷却 23min。(4) 向离心管中加入已预热的无菌LB培养液400卩L,再转移到10ml离心管中，37C恒温振荡培养 4560min。(5) 将离心管内容物混匀，分别吸取4.4卩L和110 卩L菌液

9、于含有AMP勺LB固体培养基上，用无菌的弯头玻 璃棒轻轻将细胞均匀涂开，将平板置于室温下直到液体被 吸收，倒置平板，在37 C过夜培养，然后通过菌落数计算效价。2、电转化 :(1) 取电转化感受态细胞于冰上解冻， , 标准质粒也 置于冰上，同时准备干净的电击杯于冰上预冷。(2) 在含有40卩l感受态细胞的0.5ml离心管中加入1卩L稀释十倍的标准质粒，充分混匀。然后转移到电击杯 中，把电击杯放在电击仪上进行电击(2500V，5ms)。(3) 在电击杯中加入160卩L无菌LB培养液(无抗生 素)，然后充分混匀，吸取于 10ml离心管中，置于37C恒 温振荡器中培养 4560min.(4) 分别取

10、2卩L和50卩L涂板，涂板操作同化学转 化。(5) 平板放到37 C的恒温培养箱过夜培养。第二天早 上读取两个平板的菌落数。四、实验结果1、电转化感受态细胞的效价：涂 2卩L菌液的平板上 菌落数为 88 个，通过计算知道，电转化感受态细胞的效价 为 8.8 X 108。2、化学转化感受态细胞的效价：无菌落生成，同组的 也没有出来结果。五、讨论1、感受态细胞制备及转化中的影响因素 细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于4C的培养菌，最好从70C或-20 C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为 好，可通过监测培养液的 OD6O0来控制。密度过

11、高或不足均会影 响转化效率。 质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋 态DNA转化效率与外源 DNA的浓度在一定范围内成正比，但当 加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1ng 的标准质粒即可使50卩l的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5%。 试剂的质量:所用的试剂，如CaCb等均需是最高纯度的， 并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件 下进行 , 所用器皿 , 如离心管 , 枪头等最好是新的 , 并经高压灭菌 处理,所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂 DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入，为以后的筛 选、鉴定带来不必要的麻烦。 整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化 率将会降低。2、效价检测结果分析： 化学转化