大肠杆菌生长曲线

1、四川大学化学实验报告课程名称生物工艺学实验课程号309119060学院轻纺与食品学院专业轻工生物技术学生姓名赵凤佼学号0843095035指导教师周荣清成绩评定实验日期2011-06-202011-06-22、实验名称：大肠杆菌生长曲线的制作、实验目的：1 .通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生长特征与规律，绘制生长曲线。2 .掌握光电比浊法测量细菌数量的方法。、实验仪器及药品：1 .菌种：大肠杆菌。2 .培养基:LB培养基100ml,分装两支大试管（5ml/支），剩余90ml装入250ml三角瓶3 .仪器和其他药品：722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管和无菌吸管等。四、基本原理：在合适的

2、条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次，将一定量的细菌转入新鲜培养液中，在适宜的培养条件下细胞要经历延迟期、对数期、稳定器和衰亡期4个阶段。以培养时间为横坐标，细菌数目的对数或生长速率为纵坐标所绘制的曲线成为该细菌的生长曲线。不同的细菌在在相同的培养条件下其生长曲线不同，同种细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不同。当光线微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比；而光密度或透光度可以通过光电池精确测出。因此，可利用一系列菌悬液测定的光密度及其含菌量，做出光密度一菌数的标准曲线，然后根据样品液所测得的光

3、密度，从标准曲线中查处对应的菌数。本实验用分光光度计进行光电比浊，测定不同时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。五、关键步骤及注意事项：1 .测定OD值时，要求从低浓度到高浓度测定2 .严格控制培养时间六、操作步骤：1 .标记取11支无菌试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。2 .分别用5ml无菌吸管吸取2.5ml大肠杆菌过夜培养液（培养1012h）转入盛有90mlLB培养液的三角瓶，混合均与后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌试管中。3 .培养将已接种的试管置于摇床37c振荡培养（振荡频率250r/min）,分别培养0、1.5、

4、3、4、6、8、10、12、14、16、20h,将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。4 .比浊测定用未接种的LB培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.10.65之间。七、详细实验过程记录：时间实验进度要求具体操作备注2011-06-20上午分组（2人/组）；准备、清洗实验仪器。小试管3支，大试管3支，250ml三角瓶1个，5ml吸管3支，洗净干燥。2011-06-20下午准备、清洗实验仪器；配置LB培养基。（1）清洗仪器：6cm小培养皿8套，9

5、cm培养皿48套，4个150ml三角版+玻珠，5ml吸管1支,0.5ml吸管12支，1ml吸管12支，洗净干燥。（2）配置1000mlLB培养基（5组用量）:蛋白陈10g,WW5g,NaCL10g蒸储水1000ml,NaOK溶液调节PH至7.0后，分装入250ml三角瓶封装，于120c火菌20min。LB培养埴不加琼脂。2011-06-20晚上一次接种。取湿热火菌后LB培养液分装2支试管各5ml,一支接入E.coli斜向菌种，一支做空白对照，静置培养。2011-06-21上午观察一次接种生长情况；二次接种。用5ml无困吸管吸取3ml大肠杆菌过夜培养液（培养1012h）转入盛有90mlLB培养液

6、的三角瓶，混合均与后分别取5ml混合液放入编号为1#11#勺11支无菌试管中，置于摇床37c振荡培养（振荡频率250r/min）。一次接种中接入E.coli的LB培养液浑浊，未接种的对照组培养液澄清。2011-06-21上午2011-06-22上午接种困液分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h,将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存。按编号将各组相同培养时间编号的试管分组今放置于摇床中，按时取出置于冰箱保存。2011-06-22上午光电比浊测定各培养时问段的细菌培养液OD用未接种的LB培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。从早值。取出的培养液开始

7、依次测定，对细胞密度大的培养液用LB液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.10.65之间。2011-07-04整理实验数据，分析实验结果，完成实验se告撰写。八、实验报告：1 .结果(1)将测定的OD值填入表V-1:表V-1细菌培养液OD值测定结果时间/h对照01.534681012141620取出时间12:3012:3013:1514:4515:4517:4519:4521:4523:4501:4503:4507:45OD值00.0480.0940.2780.5040.5330.7230.7731.0651.2171.2911.160(2)绘制大肠杆菌的生长曲线：见0大肠杆菌生长曲线图

8、V-4实验结果分析：通过比浊测定法和稀释平板菌落计数法对大肠杆菌生长曲线进行了测定，测定结果显示：大肠杆菌生长曲线基本符合延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期的划分，但是与典型生长曲线存在明显差异，延缓期较短，稳定期延长到十小时以上。本次试验因采用以培养1012小时的大肠杆菌，故延迟期较短。在培养3小时之后进入对数期，生长速率逐渐增大，在培养15小时之后，菌数不再发生变化，进入稳定期。由于培养时期较短，故无衰亡期。2 .思考题(3)细菌生长繁殖所经历的4个时期中哪个时期的时代最短？若细胞密度为103个/ml,培养5小时候其密度高达2X1C8个/ml,计算出其代时。答：对数生长期时间最短。细菌

9、经过迟缓期进入对数生长期，并以最大速率生长和分裂，导致细菌数量呈对数增长，此时细菌生长呈平衡生长，即细胞内各成分按比例有规律的增加，所有细胞组分呈彼此相对稳定速度合成。对数生长期细菌的代谢活性及酶活性高而稳定，细胞大小比较一致，生活力强。在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需时间为代时，以G表示。细菌的比生长速率a=(IgNt-lgNo)/(t-to)x2.303=(8lg2-3)/5x2.303=2.4417hG=t-tolnNt-lnNo=n(t1-to)G=(lnNt-lnNo)/=ln(Nt/No)/产(5+ln2)/2.4417=2.3316(h)(4)次生代谢产物的大量积累在哪个时期？根据细菌生长规律，采用哪些措施可以使次生代谢产物积累更多？答：稳定期次级代谢产物大量积累。由于营养物质消耗，代谢产物积累和PH等环境变化，环境条件逐