酶基因随机突变

1、酶基因的随机突变1引言:酶分子的定向进化简称为酶定向进化，是模拟自然进化进程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变,成立突变基因文库，在人工操纵条件的特殊环境下，定向选择取得具有优良催化特性的酶的突变体的技术进程。酶定向进化的大体进程包括随机突变，构建基因文库，定向选择等步骤。酶的定向进化的第一步是在体外人为的进行积阴德随机突变，以取得丰硕多样的突变基因，为后续的定向选择打下基础。酶基因的体外随机突变第一要取得酶基因，然后在体外进行随机突变，体外随机突变的技术多种多样，要紧有易错PCR技术，DNA重排技术，基因家族重排技术等。这些突变方式的目标都是为了取得丰硕多样的突变基因,可

2、是各自采纳的进化策略和偏重点有所不同，易错PCR技术是从酶的单一基因动身，通过改变聚合酶链式反映的条件，如改变底物和镁离子浓度等，在PCR扩增进程中，使碱基配对错误而引发基因突变；DNA重排技术是从两条以上的正突变基因动身，通过酶切和不加引物的PCR扩增,使DNA碱基序列从头排布而引发的基因突变；基因家族重排技术是从基因家族的多个同源基因动身，通过酶切和不加引物的PCR扩增等，使DNA的碱基序列从头排布而引发基因突变。这些随机突变方式能够单独利用，也能够联合利用，交叉进行，通过次实验，反复挑选，就能够够完成对酶的定向进化。2酶基因的随机突变经常使用技术:，易错PCR技术：在DNA聚合酶的作用下

3、进行体外DNA扩增的一种分子生物学技术，简称为PCR技术。聚合酶链式反映技术的大体进程包括双链DNA的变性，引物与单链DNA退火结合，引物延伸三个步骤。,双链DNA的解链：将待扩增的模板DNA升温至8595度，使DNA双链之间的氢键断开，解离为单链DNA。,引物与单链DNA退火结合：单链DNA在温度慢慢降低至5070度是，会与碱基互补的引物结合形成双链，长度为1530个碱基。,引物延伸：引物结合后，将温度升高至7075度，在DNA聚合酶的作用下，以引物为起点，以4种脱氧核甘三磷酸为底物，以目标DNA为模板，依照碱基配对原那么，由5一端向3一端的方向延伸，而进行DNA复制。以上三个步骤反复进行，

4、一样通过30次循环，即可使目的基因扩增几百万倍。在PCR技术的基础上，通过改变反映条件，增加碱基配对错误的显现频率,就成为易错PCR技术。DNA重组技术：乂称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离取得的同源DNA,勇酶切割成随机片段，通过不加引物的多次PCR循环，是DNA的碱基序列从头排布而引发基因突变的技术进程°DNA重排技术是1994年由斯田沫等第一次提出，他们通过该技术对B内酰胺酶进行了定向进化研究，是该酶的催化效率提高了32000倍。DNA重排技术的大体进程如下图：tn卜,DNA随机片段1无引物PCR陶切木突变技从闪雨川（反舞训h）vI构厚袋吧日SXA）.一.I1_负突少

5、鼠囚一£二娜a_1口欠支马内卜”地化间/Ti图83I）NAi”|拉术的J儿本过松/基因家族重排技术：乂称为基因家族改组技术，是从基因家族的假设干同源基因动身，勇酶切割成随机片段，通过不加引物的多次PCR技术，使DNA的碱基序列发生从头排布而引发基因突变的技术进程。基因家族重排技术的要紧进程如下图：I基因家族专干同源基因I酶切DNA轲片无引物PCR酶切基因重组（反复进行）突变基因文库负突变基因一"筛选IH正突变基因FT进化酶I3酶基因随机突变的应用：酶基因的随机突变时酶定向进化的第一步，因此专门重要。定向进化技术要紧用于酶的改性方面，如提高酶催化的效率，增强酶的稳固性，改变酶的底物特异性等方面。提高酶的催化效率：P内酰胺酶是一种催化B内酰胺水解的酶，在该酶的作用下，可使B内酰胺类抗生素的内酰胺结构被破坏而失去活性。1994年，斯田沫等通过DNA重排技术进行定向进化，使B内酰胺酶的催化效率提高32000倍，大大提高了突变菌株关于抗生素的耐受能力。增加酶的稳固性：。一淀粉酶是一种在食物、医药、轻工等领域有普遍用途的催化淀粉水解的工业用酶，乔耶等通过定向进化，取得热稳固性大大提高的Q淀粉酶，该酶在90度的半衰期