糖化温度、pH、时间、原料对酚酸和 氨基酸溶解的影响 - 副本

1、.糖化温度、pH值、时间、原料对酚酸和氨基酸溶解的影响华润雪花啤酒（河北）有限公司 石秀云 摘译【摘要】本文旨在研究小麦啤酒最佳的糖化条件。糖化工艺参数，如温度、pH值、时间应提供淀粉酶和蛋白酶最佳的酶解条件，使阿魏酸、对香豆酸、氨基酸最大程度溶解。这些酚酸是挥发性芳香酚类物质4-乙烯基苯酚（4VP）和4-乙烯基-2-甲基-苯酚（4VG）的前体物质。高级醇和酯类物质，如苯乙醇、乙酸异戊酯，决定着小麦啤酒的风味和口感。最佳的糖化条件还应降低含苯乙烯基类物质的溶解度。苯乙烯类物质普遍存在于谷物中，小麦啤酒酿造过程中在加热和酶促作用下转化为有害物质苯乙酸。试验参数，特别是糖化pH,对试验目的的实现起

2、着决定性作用。此外，还研究了不同麦芽和原料对酚酸和氨基酸溶解的影响。【关键词】氨基酸、苯丙烯酸、阿魏酸、糖化条件、对香豆酸、小麦啤酒香气引言酚酸广泛存在于各种香草和麦芽制品中。其中阿魏酸、对香豆酸是4-乙烯基苯酚（4VP）和4-乙烯基-2-甲基-苯酚（4VG）的前体物质，是重要的酚酸物质，对啤酒风味起重要作用。这些酚酸在酶促或加热作用下生成相应的多酚（见图1）。阿魏酸，最常见的羟基肉桂酸，多通过酯键与多糖交联存在于植物细胞壁中。这种结构能被各种酶酶解成相应的物质：被阿魏酸酯酶酶解成阿拉伯糖和阿魏酸；被-(1-4)木聚糖内切酶酶解成低聚木糖；被-D- 木糖酶酶解成木糖和低聚木糖；被L-阿拉伯呋喃

3、糖酶酶解成相应的阿拉伯呋喃糖。因而，阿魏酸对植物细胞壁的稳定性与弹性有着显著作用。此外，阿魏酸也是一种抗氧化剂，能清除自由基。糖化过程中，粮食内的苯丙烯酸同阿魏酸、对香豆酸一起溶解出来，在加热或酶解下脱羧降解成苯乙烯，而苯乙烯对小麦啤酒风味无显著作用。高纯苯乙烯是种可挥发性芳香液体，合成聚苯乙烯的单体。而聚苯乙烯用于制作各种绝缘体及一次性泡沫饭盒。国际癌症研究机构已将苯乙烯归为很可能致癌物质（B组），暂定每日允许摄入量为0.4ug/kg(体重)。按照暂定每日允许摄入量摄入苯乙烯，可能危害人体健康。目前检测出各种小麦啤酒麦汁中的苯丙烯酸含量在75ug/l和375ug/l之间，低于阿魏酸和对香豆酸

4、含量,而小麦啤酒中苯乙烯浓度高于24ug/l。与酚酸相似，在羧肽酶、二肽酶、氨基肽酶酶解下，氨基酸溶解出。发酵过程中，在酶的作用下，氨基酸被酵母代谢合成为酯类和高级醇类的前体物质。氨基酸，特别是苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸对小麦啤酒水果味和麦芽味起决定性作用。酵母通过Ehrlich 途径合成发酵液中的高级醇和酯类物质（见图2），如苯乙醇、异丁醇、正丙醇、甲硫醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯酯、乙酸己酯. 表1给出了部分氨基酸及其相应的高级醇和酯类物质。4VG、4VP和前面提到的芳香物质决定着小麦啤酒的风味和口感。表1：部分氨基酸及其相应的高级醇和酯氨基酸高级醇酯亮氨酸异戊醇乙酸异戊酯异亮氨酸戊醇乙

5、酸戊酯苯丙氨酸苯乙醇乙酸苯乙酯蛋氨酸甲硫醇乙酸甲硫酯除考虑麦芽水分、发芽温度、时间、干燥温度对糖化过程的影响，本文旨在寻找最佳的糖化条件，提供最适的酶解条件，使阿魏酸、对香豆酸、氨基酸最大程度溶解，同时减少苯丙烯酸的产生。此次研究中，主要考虑糖化温度、pH、时间及麦芽色度。试验材料与方法l 试验材料所有分析物和试剂都是分析级或色谱级，其中，苯丙烯酸、对香豆酸、甲醇、冰乙醇由Sigma-Aldrich(Steinheim,Germany)提供。l 酚酸含量测定方法如Schwarz等发现，使用安捷伦高效液相色谱（Agilent 1100 HPLC-DAD ）检测苯丙烯酸、阿魏酸、对香豆酸。使用 A

6、ppliChrom OTU Li-poMare C18 (250 mm * 4.6 mm *5 pm )(AppliChrom.Oranienburg)检测各类酚酸。 通过不同的紫外检测波段最终区分苯丙烯酸（280nm），对香豆酸、阿魏酸(312nm)。l 氨基酸含量测定方法使用EZ （Phenomenex,Aschaffenburg.German）和GC-FID(Hewlett-Packard 5890)分析样品中游离氨基酸。l 糖化温度影响的分析方法采用以下试验来研究糖化温度对酚酸和氨基酸浸出的影响：分别磨碎40g比尔森啤酒麦芽和裸小麦芽，加入300ml热水糖化。依据Vanbeneden

7、等人的研究，在 25到80之间，进行恒温糖化，pH值设定为5.4。样品分别处理30,60,120及180分钟，然后立即使用100ml冰水冷却，5ml冰醇酸调酸灭酶。调整溶液到500g后，离心5分钟（10，000rpm），上清液冷藏于-18待分析。l 糖化pH影响的分析方法添加300ml水后，使用1N氢氧化钠溶液或1N盐酸溶液将料液pH分别调至4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8，于45下分别糖化60分钟。l 糖化时间影响的分析方法45，pH5.4条件下，样品分别糖化10,20,30,45,60,75,90,105,120

8、,180,240和 300分钟。l 不同麦芽和原料影响的分析方法分析不同色度（1.8-300EBC）着色麦芽和各种粮食（大麦、小麦、黑麦）对酚酸、氨基酸溶解的影响。麦芽由Weyermann (德国,班贝克)提供。45，pH5.4条件下，样品分别糖化60分钟。l 统计分析所有试验至少重复两次。每一组试验麦汁在同一水平下进行分析，结果用偏差表示。结果与讨论l 糖化温度的影响为研究糖化温度对麦汁（小麦麦芽：哈雷麦芽=50%：50%）酚酸（苯丙烯酸、阿魏酸、对香豆酸）和氨基酸（丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸）溶解的影响， 样品在25-80间进行恒温试验。从图3可以看出糖化温

9、度对阿魏酸溶解的影响。整体来看，45时阿魏酸溶解量最大，这与目前的研究结论一致（40、43、45）。考虑糖化时间（30分钟、60分钟），50时阿魏酸溶解量最大。25-60间，糖化时间越长，阿魏酸溶解量越大。65以上，糖化时间对阿魏酸溶解没有显著影响，因为这个温度范围内，大多数阿魏酸降解酶已失活。Vanbeneden和McMurrough等人也有类似的发现。从图4可以看出糖化温度对苯丙烯酸相似的影响趋势。45和50时，苯丙烯酸溶解量最大。从试验数据来看，60以内，糖化时间越长，物质浸出越多；65以上，糖化时间对物质的浸出没有显著作用。图5中没有显示对香豆酸最佳的溶解温度。在30-35、45-50

10、均出现对香豆酸溶解峰值。与苯丙烯酸、阿魏酸相比，随着糖化时间的延长，对香豆酸溶解量并没有增加。糖化时间超过120分钟，延长糖化时间可以降低对香豆酸的溶解。65以上，随着温度的上升，对香豆酸溶解量明显降低。图6显示，糖化温度50时，氨基酸浓度出现峰值。检测的氨基酸中，亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸峰值较高（c200mg/l）。而蛋氨酸峰值最低（芳香物质甲硫醇和甲硫代丙醛的代谢前体，这两种物质风味阈值非常低）。l 糖化pH的影响在45下，糖化60分钟，研究不同pH（4.2-6.8）对酚酸和氨基酸溶解的影响。从图7可以看出pH对阿魏酸、对香豆酸、苯丙烯酸溶解的影响。对阿魏酸来说，最适pH为5.4-

11、6.6。Vanbeneden等人研究发现最佳pH 为5.8，也有研究表明相关酶的最适pH在一定范围内。对对香豆酸来说，出现两个最适pH范围： 4.4-4.6、5.8-6.0。对苯丙烯酸来说，呈现下降趋势，醪液越接近中性，苯丙烯酸的溶解量越大。从图8可以看出，pH值5.2-5.4时，氨基酸含量出现峰值。这与目前研究的最适pH5.2是一致的。从图6也可以得到相似的结论。l 糖化时间的影响图9,10显示不同糖化时间对酚酸和氨基酸溶解的影响，研究从10分钟持续到300分钟，使用小麦芽和大麦芽。图表9显示糖化时间对阿魏酸、对香豆酸、苯丙烯酸溶解量的影响。对阿魏酸来说，糖化时间与阿魏酸溶解量呈献性关系（R

12、2=0.98），10分钟时，阿魏酸含量0.7 mg/l,300分钟时，阿魏酸含量为7.8 mg/l。与阿魏酸相似，整个糖化过程中，苯丙烯酸含量呈线性增长趋势。但240分钟后，溶解量维持在相近水平（0.4 mg/l）。105分钟到120分钟，对香豆酸出现峰值（0.9 mg/l），然后不断降低直至糖化结束。从图5也可看出，120分钟后，对香豆酸溶解量快速降低。从图10 可以看出，随着糖化时间的延长，氨基酸溶解量不断增加。120分钟后，氨基酸已基本溶解。这与糖化温度、pH影响的研究结论是一致的。l 着色麦芽和不同原料的影响不同原料（小麦、大麦、黑麦）和着色麦芽（1.8-430EBC）中酚酸和氨基酸含

13、量是不同的。45下分别糖化60分钟，来研究不同原料及麦芽对阿魏酸、对香豆酸、苯丙烯酸溶解的影响（图11）。所有样品中，黑麦麦芽样品中阿魏酸和对香豆酸溶解度最高，但苯丙烯酸的溶解量与其他样品相近。从大麦绿麦芽到比尔森麦芽，所有酚酸含量呈上升趋势。与小麦麦芽和比尔森麦芽相比，大麦制成的麦芽样品酚酸含量偏高。与浅色小麦麦芽相比，深色小麦麦芽样品中酚酸含量偏低。整体来讲，色度2-74EBC，麦芽色度与酚酸含量没有明显的关联性。此外，色度超过91 EBC样品中，没有检测到酚酸物质，这与Inns 等人的研究是一致的，他们也没有发现麦芽干燥温度与酚酸明显的关联性。图12显示不同原料及麦芽对氨基酸的影响趋势。

14、从大麦到绿麦芽再到比尔森麦芽，氨基酸溶解量趋势与酚酸相似。与酚酸相比，黑麦麦芽样品中各类氨基酸溶解量与深色小麦麦芽样品相似。因而，麦芽色度与氨基酸含量没有明显的关联性，如特种麦芽Caraamber色度高，氨基酸溶解量也高。其它特种麦芽中也有少量氨基酸溶解。与pH、时间、温度影响试验相同，在此试验过程中，丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸被大量检出。结论通过试验研究糖化pH、时间、温度对酚酸及氨基酸溶解的影响，寻找增加芳香前体物质如阿魏酸、对香豆酸溶解量，同时降低苯丙烯酸含量的最适糖化条件。同阿魏酸、对香豆酸一样，苯丙烯酸在45-50糖化温度下也可溶解。延长糖化时间可以促使这三种物质溶解。因此，相

15、关参数的确定是相当困难的。试验证实，随着pH值的增加，苯丙烯酸的溶解度不断增加。将麦汁调酸至pH值5.2-5.4，可使苯丙烯酸的溶解度降低。在这个pH值范围内，游离氨基酸溶解量增加，这些氨基酸是构成芳香物质高级醇和酯类的前体物质，但阿魏酸和对香豆酸的溶解度有微量降低（见表2）。目前研究表明，前体物质的数量与芳香物质的量没有必然联系，酵母菌株、发酵温度、进一步生产过程都显著影响小麦啤酒风味。如在酯类形成过程中，含氮物质浓度，可发酵糖，脂类物质也有重要作用。且芳香物质对酒体风味的影响取决于其嗅觉阈值。表2: 酚酸和氨基酸溶解最适糖化条件时间，min温度，pH值阿魏酸300455.4-6.6对香豆酸105-20