细胞工程作业总

1、细胞工程作业1（第一、三、五章）一、名解：1. 细胞工程：以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的的利用或改造生物遗传性状，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。2. 细胞全能性：每一个活细胞都包含植物生长发育所必需的全部基因，都具有再生成一个完全的有机体的潜力。 3. 愈伤组织：由脱分化的细胞经过分裂产生的无组织结构无明显极性的松散细胞团，它具有再分化成为完整植物体的潜能。4. 外植体：植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。5. 脱分化：又称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程，即

2、分化的细胞在适当条件下转变为胚性状态而重新获得分裂能力的过程。6. 原生质体：植物细胞工程中脱去全部细胞壁的细胞叫原生质体。7. 胚胎培养：指对植物的胚及胚器官（如子房、胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术。 8. 成熟胚培养：一般是指子叶期至发育成熟的胚的培养。 9. 幼胚培养：是指胚龄处于早期原胚、球形期胚、心形期胚、鱼雷期胚的培养。10. 胚乳培养：指处于细胞期的胚乳组织的离体培养，它的功能是为胚发育和种子萌发提供营养。 11. 胚珠培养：是指未受精或受精后的胚珠离体培养。 12. 子房培养：是指授粉和未授粉的子房培养。 13. 人工种子：将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹

3、在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮形成的类似种子的颗粒。 14. 植物脱毒：利用物理、化学或生物学方法脱除植物所感染的病毒，在无菌条件下培养不带病毒的植株，进行快速繁育无病毒种苗的技术。二、问答题：1、细胞培养有哪些主要设备及途?超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，CO2培养箱，倒置显微镜，酶标仪、液氮罐、滤器，自动双重纯水蒸馏器，纯水仪等。自动双重纯水蒸馏器和纯水仪是水处理设备，细胞培养对水的要求较高，至少是使用双蒸水，最好使用三蒸水或超纯水。超净工作台为细胞操作提供无菌环境。压力蒸汽消毒器：湿热消毒。电热干燥箱：干热消毒（玻璃器皿）（160，2h）/烘干消毒湿热物品（60，24h

4、）。CO2培养箱：用于动物细胞培养，提供精确的温度，维持培养基pH。倒置显微镜：能够从容器底部观察培养的活细胞形态。酶标仪:定量测定培养物中的OD值。2、 如何测定细胞活力？依据的原理是什么？台盼蓝染色法：活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力。MTT（甲基噻唑基四唑）法：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。3、 试述细胞培养的灭菌方法和各自的适用范围。物理灭菌法紫外线消毒：用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，主要应用范围是布类

5、、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。过滤除菌：一是用超净台对操作空间的空气除菌；二是用滤膜对培养用液和各种不能高压灭菌的溶液（如抗生素、激素、酶液、血清的灭菌。以022 m滤膜除菌最为常用。火焰灭菌：用于玻璃吸管、培养瓶口的灭菌。化学消毒法70(或75)酒精 (卫生级) ：最常用的化学表面消毒剂 ，用于手和一些金属器械或工作台面或物体表面的消毒。05过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。抗生素抑菌在细胞培养时，在培养基中添加抗生素，抑制细菌、真菌等污染。4

6、、 试述细胞冻存的主要方法。细胞冻存分为两种：一种是低温保存：-20ºC左右温度保存细胞；一种是超低温保存：在液氮（-196ºC）中保存。超低温冷冻又分为：缓慢冷冻、快速冷冻、预冷冻等。缓慢冷冻法：将处于0或其它预处理温度下材料以1-2/min的降温速度降到-70再投入液氮中。适用于不抗寒的或含大液泡和大量水分的植物材料以及动物细胞。快速冷冻法：将材料在0或其它预处理温度下直接放入液氮中进行冷冻。适用于脱水程度高、抗寒性强的材料如种子、花粉、冬芽、茎尖等。预冷冻法（两步法）：第一步用慢冻法降到一定温度（多以0.5-4/min的速度降到-40左右）并停留一段时间，第二步投入液

7、氮中。适用于多种植物的茎尖、芽、悬浮细胞等。5、 试述人工种子的制作流程。1选取目标植物2通过组织培养诱导形成愈伤组织3愈伤组织转移到液体培养基中增生扩大4由愈伤组织获得体细胞胚5选用合适的人工胚乳包埋体细胞胚，其中含有必需的营养物质、生长因子等成分。6包裹形成人工种皮6、 植物组织培养中的调节物质有哪些？各有何作用？生长素：刺激细胞分裂和诱导根的分化。细胞分裂素：引起细胞分裂，诱导芽的形成。赤霉素：促进细胞生长。7、 植物组织培养再生植株的途径有哪些？试举例说明。器官发生途径、体细胞胚发生途径、器官外植体直接发生途径、悬浮培养细胞发生途径、愈伤组织发生途径、单细胞发生途径、原生质体发生途径8

8、、 试述植物组织培养的步骤（过程）选择合适的外植体 接种在合适的培养基上培养 形成愈伤组织 诱导培养形成芽、根 进一步发育成试管苗 练 移栽进一步发育成完整植株9、 植物组织培养中经常会遇到哪些问题，如何解决？（1） 玻璃化现象。措施：降低培养基中细胞分裂素和生长素浓度，添加低浓度多效唑、矮壮素等生长抑制物质。控制适宜的培养温度 降低容器内湿度 减少培养基中含氮化合物的用量 增加自然光照 控制继代次数（2） 褐变问题选择适宜的外植体。选择适宜的培养条件。材料预处理和经常进行细胞筛选。使用抑制剂。使用吸附剂。（3） 微生物污染改进外植体消毒方法。反复检查培养物。使用抗生素。10、 植物脱毒主要的

9、方法和特点是什么？如何鉴定脱毒植物？植物脱毒主要有物理、化学、和生物3种方法。物理方法：高温处理又称热疗法。使病毒钝化失活，繁殖力下降，失去侵染能力，而植物基本不受伤害。该方法对一些圆形病毒或者线状病毒有效。低温处理法：冷疗法，降低温度使病毒活力下降。化学方法：利用嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等化学药品处理患病植物可以抑制植物体内病毒复制。生物方法：病毒并不会侵染植物的每一个部位，因此选择不带病毒的外植体来再生植株就可以达到去病毒的目的。鉴定再生植株后，一般应在18个月以内进行病毒检测，因为病毒在植物体内的潜伏期一般在6-12个月。常用的检测方法：直接检测法；指示植物法；电镜法抗血清检测法

10、；分子检测技术。细胞工程作业2（第六、七、八章）一、名词解释：1. PGD试管婴儿：通过种植前遗传学诊断（PGD）技术培育出的试管婴儿将被称为第三代试管婴儿。2. 胚胎工程：是指对动物早期胚胎或配子进行的工程技术操作，获得所需要的成体动物的技术。3. 超数排卵：利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，利用手术的取出卵母细胞。目的是最大限度地利用母畜的生殖能力（牛超数排出5-10个卵母细胞） 4. 胚胎移植：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎移植到与供体同时发情排卵、但未经配种的“受体”母畜输卵管或子宫的技术。 5. 胚胎分割：借助显微操作技术或徒手操作方法，切割早期胚胎

11、成2、4等多等份，再移植给受体母畜，从而制造同卵多仔后代的技术。 6. 胚胎融合：又叫胚胎嵌合，是将两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种动物）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育形成一种嵌合体后代的技术。 7. 试管动物：将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。8. 体外受精：哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。 9. 克隆动物：用特定发育阶段的核受体体外构建重组胚，通过胚胎移植到受体完成发育出生的动物。包括胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物。10. 核体：与胞质分离得到

12、的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。 11. 胞质体：是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 12. 微细胞：又可被称为微核体，是指含有一条或几条染色体（即只含一部分基因组），外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。 13. 细胞质工程：研究真核细胞的核-质关系以及细胞器、细胞质基因转移的技术。 14. 胞质杂种：将两种来源不同的核外遗传物质（细胞器）与一个特定的核组合在一起得到的细胞。 15. 细胞融合：是指用人工的方法使二个或二个以上的细胞或原生质体(除去细胞壁的细胞) 融合成一个细胞的技术。16. 体细胞杂交：不同来源的体细胞融合并使之分化再生形成新品种的技术。 17. 染色体工

13、程：按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术，从而达到定向改变遗传性和选育新品种的目的。广义上讲它还应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。 18. 多倍体：细胞中含有三个或更多染色体组的个体。 19. 单倍体：细胞中含有正常体细胞的一半染色体数。 20. 温度休克法：即用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体(抑制第二极体排放)或四倍体(抑制第一次卵裂)的方法。 21. 植物的离体受精：指在体外无菌条件下培养未受精的子房、胚珠和花粉，使花粉萌发进入胚珠完成受精的技术。二、问答题：1试管动物培育的步骤是什么?精子采集与体外获能、卵子采集与成熟培养

14、；体外受精； 重组胚激活与体外培养；胚胎移植； 体内发育、出生。2核移植动物与体外受精动物相比有怎样的优点和缺点？ 核移植优点：能克服远缘杂交的不亲和性,有目的地培育优良品种.动物体细胞克隆,可用于保存濒危物种、保持优良品种、挽救濒危动物、利用克隆动物相同的基因背景进行生物医学研究等缺点：技术复杂,难度大；它将对生物多样性提出挑战,有性繁殖是形成生物多样性的重要基础,而“克隆动物”则会导致生物品系减少,个体生存能力下降.3细胞核移植克隆动物的技术路线。核供体细胞的获得与取核 受体细胞的准备与去核 细胞核移植 重组胚的激活与培养 胚胎移植 核移植后代鉴定。4如何分离X精子和Y精子？在胚胎移植前进

15、行性别鉴定的方法和依据是什么？免疫学分离法： Y精子存在H-Y抗原，利用H-Y抗体检测精子质膜上是否存在H-Y抗原。离心分离法：X精子DNA含量略大于Y精子，因此X精子密度较Y精子略大。电泳分离法： Y精子负电荷略步小于X精子，利用表面电荷差异采用电泳进行分离。流式细胞仪分离法：根据X、Y精子上DNA含量的微小差别分离。化学药品处理法：Y精子有嗜碱性，而X精子有嗜酸性。胚胎移植前性别鉴定细胞生物学方法：通过判定胚胎细胞性染色体是还是来鉴定胚胎的性别。分子生物学方法：根据Y染色体上的SRY基因的有无进行鉴别。可用DNA探针法和PCR扩增法。生化分析法胚胎H-Y抗原检测法 相关酶分析法：通过测定与

16、X染色体相关的酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶）活性来达到鉴别胚胎性别的目的 5、何谓细胞重组？细胞重组的方式有哪些？细胞重组又叫细胞拆合，指从活细胞中分离出细胞器及其组分，在体外将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞的一种技术。细胞重组的方式 （1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。（2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。（3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞。其中最后一种是非常重要的细胞重组技术。6、试述细胞融合的方法和各自的特点。1、生物法有仙台病毒法等。各种病毒都具有凝集细胞的能力。仙台病毒除有凝集细胞的能力外，还具有促使凝集的

17、细胞发生融合的能力。缺点：融合随机，融合率低。要提前培养病毒，并且灭活后才能使用，一旦灭活不充分的话，病毒还可能感染操作者与亲本细胞。因此，目前已经很少使用。2、 化学法最常用的方法：PEG结合高Ca2+-高pH诱导法诱导优点：融合成本低，产生异核率高，不受物种限制，融合率较高缺点：过程繁琐，可能对细胞有毒害。3、 物理法主要采用电融合诱导法。优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；方便简单、可在显微镜下观察或录像融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等等。缺点：可能会造成不可恢复的细胞损伤。7、 细胞融合后如何筛选？ 融合后细胞的种类未融合的细胞同核体同源原生质体的融合体。

18、 异核体非同源原生质体的融合体。 多核体含有双亲不同比例核物质的融合体。 1、选择性培养基筛选法：利用原生质体或细胞对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞的方法，是常用的筛选方法 抗性互补筛选系统:利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞的方法营养互补选择系统：利用两种亲本细胞营养互补作用原理筛选杂种细胞的方法温度敏感突变型融合细胞的筛选：在低温和高温下均能生长的为杂种细胞2、物理特性筛选法：利用亲本细胞与杂种细胞的物理特性的差异进行选择3、荧光素标记法：利用双亲细胞与杂种细胞不同的荧光标志用荧光显微镜或流式细胞仪进行选择。8、 试述体细胞杂交的过程（步骤）：亲本选择；原生质体制备；原生质体

19、融合；融合细胞（杂种细胞）筛选；融合细胞（杂种细胞）的培养（细胞壁再生、分裂形成细胞团、愈伤组织）由愈伤组织再生植株；杂种植物鉴定。9、如何进行体细胞杂交后的鉴定?形态学鉴定：根据茎、叶、花等组织的形态、颜色来鉴别杂种。两亲本的亲源关系较远时，杂种植物的形态倾向于亲本之一，但存在差异。细胞学鉴定：原生质体融合的亲本材料一般为二倍体，杂种细胞的染色体应该为双二倍体。如果亲本的亲源关系较远，染色体差异会较大；同时，杂种细胞中一亲本的染色体可能会受到另外一亲本的排斥，可能会产生大量非整倍体。因此可以从杂种植物染色体的形态、大小和数目上鉴定是否是杂种植物。同工酶（isoenzyme）鉴定：杂种植物的同

20、工酶谱是双亲本酶谱的总和，表现为条带增多、酶带颜色加深、宽度加大，有时还出现两亲本都不具有的新谱带或者丢失部分亲本酶带。DNA分子标记鉴定：是在分子水平对亲本和杂种植物遗传性状差异进行鉴定，能正确揭示出生物个体间核苷酸序列的差异。10、植物和动物多倍体育种方法有哪些？如何获得异源多倍体植物？植物多倍体育种方法物理因素诱导：温度骤变、机械创伤、电离和非电离辐射、离心力等化学因素诱导：秋水仙素是至今发现的最有效、使用最为广泛的染色体加倍诱导剂。 生物方法生物学方法主要指杂交，利用染色体加倍个体与未加倍个体杂交繁殖多倍体后代，经常与化学、物理方法结合使用。动物多倍体育种方法A 物理方法（1）温度休克

21、法：即用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体(抑制第二极体排放)或四倍体(抑制第一次卵裂)的方法。 多用于鱼类三倍体培育。通过温度调控技术诱导多倍体是物理方法中简便而效果佳的方法之一。（2）水静压法：采用较高的水静压（如65kg/cm2）可抑制卵母细胞第二极体的释放或者抑制第一次卵裂诱导产生多倍体的方法。多用于鱼类三倍体培育。该方法诱导率较高、处理时间短、对卵子操作等优点。但需专门的设备如水压机等。B 化学法细胞松弛素诱导法：细胞松弛素B(CB)导致极体的保留是通过阻止卵子微丝环的收缩和极体的分离来实现的。CB处理比其他物理方法如温度、水压等能更有效地诱导三倍体的形成。6-甲氨基嘌呤

22、诱导法： 6DMAP 是一种蛋白激酶抑制剂。当6DMAP 与微管蛋白二聚体结合以后对微管正常的结构和功能起到了抗有丝分裂的作用，因此可以产生三倍体。C 生物学方法 主要是通过杂交方法尤其是种间杂交获得异源多倍体。11、分别叙述多倍体和单倍体倍性鉴定的方法多倍体倍性鉴定的方法（1）染色体计数法由于染色体制片技术比较成熟，因此染色体计数仍是目前鉴定多倍体倍性的一种最为直观、准确的方法，但缺点是比较费时。 （2）核体积测量法一般细胞核的体积与染色体数目成正比，可借测定细胞核的体积鉴定染色体的倍性。比较费时，缺乏准确性（3） DNA含量测定是倍性鉴定的另一个比较有效的直接鉴定的方法。是较为先进常用的方

23、法，其测定快速准确，并能测出嵌合体，但是缺点是这种仪器比较昂贵。（4）生化分析根据二倍体与多倍体间可能存在的不同组织细胞蛋白和酶的活性差异，通过生化方法进行分析鉴定。不具有普遍性的意义。单倍体鉴定形态鉴定：通过观察花药和花粉植株的形态特征进行染色体的倍性鉴定。 生长发育弱，体形小，各器官明显减小。鉴定准确率低。结实性鉴定：单倍体开花但不结实；二倍体植株则开花结实都正常；四倍体植株虽能开花但通常结实性不良。染色体数目鉴定：染色体数目是花药和花粉植株倍性的直接证据，因而是花和花粉植株倍性鉴定的重要方法。生化标记鉴定：生化标记是指以基因表达产物蛋白质为主的一类标记系统，常用的是同工酶标记。分子标记鉴

24、定：根据植物基因组DNA水平差异进行检测。细胞工程作业3（第九、十一章一部分）一、 名词解释：1. 植物细胞培养：在离体条件下，将分离的植物细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。(P164) 2. 看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖。 3. 饲养层培养：用处理过的（如X射线处理）无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。 4. 悬浮培养：将细胞接种于液体培养基中，保持良好的分散状态情况下培养。 5. 细胞固定化：指将游离的细胞包埋在支持物内部或表面进行培养的一门技术。6. 毛状根：是植株或组织、器官受到发根农杆菌

25、感染后而形成的类似头发一样的根组织。7. 植物细胞两步培养：第一步采用利于细胞生长的培养基使细胞达到高的细胞浓度。第二步更换为利于产物合成的培养基或者添加代谢产物的前体物质或诱导子促进产物合成。8. 动物细胞培养：动物细胞培养是模拟动物体内的生理环境使细胞在体外生存、增殖的一种技术。 9. 对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 10. 原代培养：指从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。在这个阶段，细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。 11. 传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。12. 动物细胞大规模培养：是指在人工条件

26、下在生物反应器中（设定pH、温度、溶氧等）高密度大量培养细胞用于生产生物制品的技术。13. 细胞系：是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的细胞群体。 14. 细胞株：是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。二、问答题1、.与微生物相比，植物细胞培养有哪些特点？1 与微生物细胞相比，植物细胞要大很多（30-100倍） 。2 很少以单一细胞形式悬浮生长 ，常以非均相集合细胞团的方式存在。3 植物细胞的纤维素细胞壁和大的液泡很容易被剪切力高的传统搅拌式微生物反应器损伤。 4 植物细胞生长速度慢，操作周期长。5 植物细

27、胞培养基成分丰富而复杂劳动，适合微生物生长，防止污染的发生更困难。6 与微生物不同，植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对培养过程影响较大2、 植物单细胞分离与初步培养单细胞制备方法A机械法 主要通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的细胞。该方法是一种原始的方法，效率很低，获得的细胞数量也非常有限。B酶解法 这种方法是目前最为有效的一种获得细胞的方法。主要是根据植物细胞壁的组成特点选用某一专一性水解酶，在温和条件下将壁物质分解掉，从而释放出细胞。 ·上述两种方法获得的细胞须经诱导脱分化后才具分裂能力。C愈伤组织诱导法 该方法通过植物组织培养获

28、得愈伤组织，并通过培养使愈伤组织大量增殖。由于愈伤组织细胞之间的结构非常松散，因此可以通过高频率振动从悬浮状态的愈伤组织中振荡下来单个细胞，也可以添加酶使细胞分离下来。 分离获得的细胞有分裂能力植物单细胞初步培养A看护培养：具体方法是将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织之上培养。B饲养层培养：是用处理过的无活性的或分裂很慢或不分裂的细胞来饲养所需培养的细胞使其分裂生长。3、 如何获得适合工业化生产的细胞株。1 愈伤组织的诱导与培养：选用植物的目标化合物高产部位作为外植体诱导愈伤组织。愈伤组织形成后，进行继代培养。2 单细胞分离：选取生长快速而疏松的愈伤组织，通过固体培养基继代培养，挑选生长快

29、速的细胞。3 细胞无性系的分离：转移到液体培养基中进行悬浮培养，从中选择分散性好、生长速度快的细胞。4 细胞株筛选：检测目标产物含量，从中选择目标产物含量高的细胞株。5 性能评价：进行较大规模培养，考察细胞生长与目标产物合成的稳定性。6 细胞株获得：得到适合工业化生产的细胞株，保种。4、 植物次级代谢产物合成过程中受到哪些因素的影响。A.生物因素（1）细胞株稳定、高产、生长速度快的细胞株是细胞大规模培养生产代谢产物的前提。缺乏适合的细胞株是目前许多代谢产物无法利用细胞培养生产的主要限制之一。（2）细胞凋亡细胞凋亡是植物细胞培养过程中凋不可避免的现象，但是可以通过条件改变进行调控来减少细胞凋亡。

30、（3）细胞团植物细胞容易聚集成团，细胞团的形成影响稳定的悬浮体系的维持，同时造成了培养物的显著异质性，细胞团表面与内部的细胞存在营养吸收和代谢产物分泌的差异。此外，细胞团容易受剪切力影响而破碎，引起培养液粘度增加，致使气体交换与传递受到影响。适当大小的细胞团有利于代谢产物积累。（4） 生物合成机制次级代谢产物的生物合成不同于蛋白质合成，涉及多基因参与（基因簇），机制非常复杂，影响因素非常多。B.化学因素 主要通过合适的培养基来培养选择控制，包括营养盐、前体和调节因子等。（1） 营养盐：一方面是保证植物细胞生物量的增长；另外一方面是要保证 细胞能合成和积累次级代谢产物。（2）前体：指某一代谢中间

31、体的前一阶段的物质。 缺乏某一种前体时细胞就不能合成某一种代谢物。（3） 诱导子（4） 反馈抑制植物次级代谢产物在培养系统的积累有时会对目标产物的合成具有反馈抑制。C.物理因素主要包括：光照、温度、通气、搅拌、pH值等。（1）光照： 光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响。光照时间长短、光质、光强等都会对代谢产物合成和积聚产生作用。光对许多酶有诱导或抑制作用。（2）温度： 温度会影响酶的活性。细胞的生长速率与培养温度紧密相关。植物细胞培养一般在25左右进行。（3）pH 会影响培养液的渗透压、酸碱度，酶的活性，从而影响细胞代谢。 植物细胞液体培养的pH 变化范围在55 .6 之间，最佳的起始pH在

32、5.55.8 之间。如果对培养液pH进行控制，将有利于次级代谢产物的生成。D.工程技术问题（1）培养液的流变特性由于植物细胞培养过程中容易结团，同时，不少细胞在培养过程中容易分泌粘多糖等物质，从而使传氧速率降低，影响细胞生长。（2）气体传递与微生物不同，植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对培养过程影响较大。（3）搅拌与剪切力为了加强气液固之间的传质，细胞悬浮培养时需要混合搅动。植物细胞虽然有较硬的细胞壁，但是细胞壁很脆弱，对搅拌的剪切力很敏感。由于剪切力比较大，细胞会自溶，次级代谢产物合成会降低。（4）泡沫与器壁表面粘附性与微生物细胞培养相比，植物细

33、胞培养过程中产生的气泡更大，而且由于培养液含有蛋白质或粘多糖，粘度大，细胞很容易被包埋在泡沫里，造成非均相培养，也可从营养液中带出来，造成损失或污染。因此，必须对泡沫进行消除。5、 试说明毛状根诱导的原理、方法与应用。原理：发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） ：土壤细菌，能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物。感染整体植株或其某一器官、组织、单个细胞甚至原生质体后，其Ri质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型:形成多分枝的、似头发一样的根组织(毛状根或称为发根）。方法：外植体接种法 无菌的外植体与发根农杆菌共同培养后形成愈伤组织后再形

34、成毛状根 茎杆接种法 将发根农杆菌接种由组培苗茎尖再分化形成的茎杆上 原生质体-农杆菌共培养法应用：烟草毛状根培养生产烟碱6、试述动物细胞体外生长特点（1）动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁。对机械搅拌或剪切力敏感。（2）动物细胞倍增时间长，生长缓慢，易受污染。（3）动物细胞间主要以聚集体形式存在。（4）正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。 (5)体外生长的动物细胞一般具有贴附、细胞接触性抑制、密度抑制的特点。（6）动物细胞对于营养要求更加苛刻，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清。（7）对于培养环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等

35、。（8）细菌、真菌、病毒、支原体均可导致动物细胞培养物的污染。7、动物细胞培养基有哪些种类？各有何优缺点分天然培养基、合成培养基、无血清培养基。天然培养基主要有血清、组织提取液、鸡胚汁等。血清是天然培养基中最有效和最常用的成分。天然培养基营养价值高，但成分复杂，来源有限。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低。 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。需补充一定量的天然培养基（常为10%小牛/胎牛血清）无血清培养基由基础培养基和添加成分组成。优点:保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性。减少了细胞污染

36、，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。缺点:无血清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。不同细胞株，所需补加物也不同。8、动物细胞在体外生长需要什么特定的条件？温度: 哺乳动物细胞培养适宜温度：37 pH: 7.2-7.4常用加含NaHCO3的磷酸盐缓冲液调整培养环境中的CO2的浓度。渗透压：260-320m0sm/kg气体：溶解氧：5%-80% CO2: 5% 环境无毒无污染：与细胞或培养液接触的用品严格清洗灭菌,培养过程中所需的气体、液体去除细菌、病 毒、支原体等各类污染。9、试述动物细胞原代培养和传代培养的方法。原代培养（1）组织块原代培养 处死动物，取材分离 组织剪碎（1mm3)

37、 冲洗、离心 接种、培养 常规检查(细胞形态活力、营养、pH及污染)（2）细胞原代培养取材分离，组织剪碎 消化液(常用胰酶)消化 过滤离心分离、计数接种、培养 常规检查传代培养（1）悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2-23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。（2）半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。（3）贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液为0.25的胰蛋白酶液。10、动物细胞固定化培养

38、技术主要有哪些？各有何特点？（1） 吸附固定法 通过物理吸附、离子吸附等方法使细胞固定在载体上。该方法操作简便，对细胞影响小，但是固定的细胞数量有限。（2） 离子/共价交联法 利用双功能或多功能试剂与细胞表面的基团发生反应，使细胞彼此交联形成网状结构。缺点是反应条件较剧烈，对细胞损伤大。（3） 共价结合法 细胞表面的基团和固相支持物表面的基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。该方法结合牢固，细胞不容易脱落，稳定性好。但需引入化学试剂，对细胞活性有影响，细胞容易死亡。（4） 包埋法 将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞。优点是：操作简便，条件温和，负荷量大，细胞泄露少，抗机械力损伤，

39、是目前采用较多的细胞固定化方法。缺点是：扩散限制，并非所有细胞都能处于最佳基质浓度，且大分子基质不能渗透到内部。（5） 微囊化 利用天然的或者合成的高分子材料作为囊壁材料将细胞包裹成微米级的微小球囊，形成的微囊膜是亲水半透膜，培养基的营养成分以及代谢产物可以通过微囊膜交换。细胞工程作业4（第11章部分、第12、13、14章）一、名词解释：1、单克隆抗体：经过免疫的哺乳类动物单一的B淋巴细胞可以分泌单一性抗体，这种具有特异性的、同质性的抗体为单克隆抗体。2、HAT培养基：含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷3种关键成分的培养基。3、成体干细胞：成体干细胞是成体组织内具有更新和进一步分化潜能的细胞

40、。4、多能干细胞：是能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。 5、转基因动物：是指在基因组内稳定地整合外源基因，并且外源基因可以稳定遗传给后代的基因工程动物。 6、组织工程：组织工程是利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或器官再生的一门技术 。 7、转基因生物反应器：转入外源基因的细胞或动植物称之为转基因生物反应器。 二、问答题：1、为什么可以利用HAT培养基筛选杂交瘤细胞的？其筛选的过程是什么？融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT/TK-细胞株，在HAT培养中不能合成DNA。融合所用的脾细胞是HCPRT和TK细胞株，能通过补救途

41、径合成DNA，但不能长期生存。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中通过补救途径合成，又能长期存活与繁殖。筛选过程细胞用HAT培养基悬浮，加入到含饲养细胞的培养板，37、5CO2培养，每3-4d更换HAT培养基。15d后改用HT培养液维持培养三周；改用一般培养液；8-12d进行抗体检测2、 试述单克隆抗体的制备过程。免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。同时培养骨髓瘤细胞。细胞融合 无菌操作取出免疫过得小鼠脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇

42、作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。只有融合的杂交瘤细胞能在HAT培养基中存活和增殖。杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。3、制备转基因动物时的转基因方法有哪些？各有什么优缺点？（1）原核期胚胎基因显微注射法：通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵特点：表达载体制备简单，外源基因容量大；整合率低； 导致基因组的重排、易位、缺失或定点突变。（2）胚胎干细胞移植法将正确整合的转基因ES细胞培养后通过核移植、聚合或注射法到核受体

43、细胞、桑椹胚或囊胚中，将胚胎移植到代母的子宫内。特点：转基因的效率高；可能得到嵌合体（3） 精子载体导入法：这一方法的独特步骤包括：外源目的基因导入精子：可通过DNA与精子共育法、脂质体转染法等方法实现。被导入外源目的基因的精子与卵子受精，最终获得转基因动物。特点：经济、方便、转染率高（4）逆转录病毒感染法将含目的基因的逆转录病毒载体人为感染早期胚胎细胞或直接将胚胎与能释放反转录病毒的细胞共孵育，实现基因转移，产生转基因动物。特点：基因转移效率、感染率、整合率明显高于其他基因转移方法。（5）卵母细胞显微注射法 基本方法：将带有外源目的基因的逆转录病毒通过显微注射技术注入卵母细胞的卵周腔，通过体外受精、体外培养、胚胎移植获得转基因动物。优点：适合制备大型转基因动物；对卵的机械损伤小；提高外源基因与核染色体接触的机会；提高外源基因的整合率。（6）转基因克隆动物方法：外源目的基因导入动物细胞，再以这些细胞作为核供体，利用克隆动物技术获得转基因动物。优点：获得转基因动物的效率高；通过鉴别核供体核型预知转基因动物性别 所需动物数量大为减少；实现大片段基因转移4、转染哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记有哪些?TK- 胸腺嘧啶核苷激酶； APRT- 腺苷磷酸核糖转移酶APH- 氨基糖苷磷酸转移酶； HPH- 潮霉素B磷酸转移酶 DHFR- 二氢叶酸还原酶； GS- 谷氨酰