电化学分析文献翻译

1、回顾：用于检测真菌毒素的亲和型电化学传感器本文综述了电化学生物传感器对食品中真菌毒素的测定现状。真菌毒素是有毒霉菌产生的高毒性次生代谢。这些急性毒性物质严重的导致了人类和动物的健康问题，但直到20世纪60年代以来第一个研究者才发现曲霉毒素有致癌性。真菌毒素广泛的影响农业产品, 最重要的是谷物及与谷物为基础的食品。大多数国家，特别是欧盟，为了控制和预防真菌毒素对食品的污染已经制定了严格的法律计划。霉菌毒素的官方分析方法通常需要精密仪器仪表，如液相色谱，荧光或质量检测器，结合提取程序进行样品制备。约十六年,基于亲和性传感器所产生的更简单和更快速的分析程序已经出现在科学文献中，这些科学文献被认为是一

2、个非常有前途的替代方案，特别是电化学（即安培，阻抗，电势和电导率）的亲和性的生物传感器，由于其简单性和灵敏度。通常，尽管重组抗体，人工受体和分子印迹聚合物显示出潜在效用。但是电化学生物传感器还是把对于真菌毒素使用特定的抗体或适体作为亲和配体。本文主要是综述了用于真菌毒素的亲和性生物传感器的研究进展，涉及了大约从十六年前的第一次报告以来的所有文献。1.简介霉菌毒素是一个庞大而多样的组模的次生代谢产物，他们都具有共同的特点，都是由真菌产生的，对脊椎动物和其他生物具有毒性作用。丝状真菌产生成千上万的有毒化合物. 但最重要的霉菌毒素属于曲霉属，镰刀菌属，和青霉属物种（莫斯，1996）。从毒理学和立法的

3、角度来看最相关的真菌毒素是黄曲霉毒素，赭曲霉毒素，某些单端孢霉烯（伏马毒素，脱氧，T-2，HT-2，和玉米赤霉烯酮），棒曲霉素，桔霉素，和麦角生物碱。1. 所选的分子的化学结构示于图1(Bennett and Klich, 2003)。真菌毒素影响广泛的农产品包括谷物、谷类食物、干果、葡萄酒、牛奶、咖啡咖啡豆、可可面包店或肉类产品,这是许多发展中国家的经济的基础(Shephard et al .,2012) 真菌毒素可能只要作物生长就存在了，但直到最近其真正的化学性质仍然不是很清楚。在20世纪60年代早期人们开始考虑去发现黄曲霉素、并且识别和测定它是根据发生和/或该疾病（霉菌毒素中毒症）产生的

4、严重程度，特别是如果它们被认为是致癌物质。用官方的方法测定真菌毒素通常在认可的具有先进的仪器与荧光高效液相色谱法(HPLC)(粤)或质量(MS)探测器的实验室，但现场对于小型设备和快速测定的需求也不断增加。在大约过去16年来，发展新亲和力生物传感器的霉菌毒素的许多新方法已经出现了特别是电化学生物传感器，这是本次审查的主要议题。一些优秀的评论是可用的分析方法,为确定真菌毒素生物传感器,电化学生物传感器。这次审查目标覆盖了电化学生物传感器霉菌毒素的全部范围。特别感兴趣的是食品污染和共轭(掩盖)霉菌毒素的存在衍生品。分析测定食品中真菌毒素是极其重要的,由于其高毒性在人类和动物,和世界各地的许多国家已

5、经建立了非常严格的控制,这些食物可能会在收获或储存期间受到污染。随着全球化和世界贸易,霉菌毒素问题在未来几年将显著增长。2.真菌毒素的重要性2.1毒性 食品的霉菌毒素的污染已成为一个极大的关注的问题，因为这些都是导致许多疾病的原因。(Richard, 2007). 据估计，全世界25%的粮食受产毒真菌的影响，结果真菌毒素已经成为食物链的一部分。饮食中高水平的霉菌毒素对人体健康和各种各样的动物造成了不良的急性和慢性影响。副作用尤其可能影响肝脏，肾脏，神经系统，内分泌和免疫系统。在20世纪60年代初黄曲霉毒素B1（AFB1）（黄曲霉素和寄生曲霉）首次被提出，它是一种强有力的人类的致癌物（据IARC

6、分类的第一类危险的致癌物质）并且也是引起动物肝脏肿瘤的主要原因。黄曲霉毒素出现在每克不同种类的食物产品中的低子纳克范围内，由于致癌性立刻产生了符合食品安全的立法规定和新的要求。(Olsen et al., 2006)。 当AFB1以饲料的形式被奶牛摄取，它就被转化成其羟基化的代谢产物，之后黄曲霉毒素M1（AFM1）被分泌在牛奶中。不幸的是，AFM1在牛奶巴氏杀菌和存储过程中以及各种奶制品的制备过程中是相对稳定的。(Gordon, 2009).赭曲霉毒素，特别是赭曲霉毒素A（OTA）（曲霉菌和青霉真菌）的首次分离于1965年，它发现于各种各样的商品中，主要集中在谷物中。由于存在于食物链中OTA的

7、持续性和携带效应，OTA还可以从被喂食受污染饲料的动物中污染牛奶或禽肉。OTA属于第二危险等级的致癌性物质，并且是已知的诱变，致畸和免疫。其他代谢产物如赭曲霉毒素B和C很少出现在食品中的。赤霉菌产生伏马菌素和单端孢(脱氧雪腐镰刀菌烯醇, T-2，HT-2，玉米赤霉烯酮), 化学结构如图1所示。伏马菌素在20世纪80年代中期被发现，它是长链聚羟基烷基胺含有三片段。至少有13个结构不同的伏马菌素已被描述。影响人类重要身体健康的最主要是是伏马菌素B1和B2（分别为FB1和FB2）包括肝肾肿瘤和食道癌。(Scott, 2012) 单端孢型A（脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇型，分别命名为DON和NI

8、V）是循环倍半萜，同时引起由肾脏问题导致的厌食和呕吐。玉米赤霉烯酮（ZEA，是一种玉米赤霉醇）它们的代谢物是具有雌激素作用和生殖毒性的雌激素的类似物。镰刀菌毒素的毒性效应对动物产生严重的作用，例如猪，禽，牛，马。另一个重点领域是由于霉菌毒素廉价的，易于得到的，它可以应用到小队敌人中去，所以在战争中利用一些单端孢-B型（T-2，HT-2）真菌毒素作为生物武器。(Rai and Varma, 2010)2.2.欧洲立法从2000年代中期，大约100个国家（覆盖世界人口约85）有具体的规定或真菌毒素在食品中出现的详细准则(Van-Egmond et al., 2007)。全面客观的保护消费者的健康,

9、 对减少食品中大量商品的出场作了共同的支持与描述。2007). 在欧盟(EU)国家自20世纪60年代以来根据国家法规增加基于权威机构的科学意见，例如EFSA（欧洲食品安全局）FVO（食品和兽医办公室）和CPVO（植物品种共同体局），给哪些要求进行足够的采样，警报和分析方法的人建议(Olsen et al., 2006; Van-Egmond et al., 2007)。在欧盟统一规定，现在对于一些真菌毒素，食品组合存在。其中最重要的立法是国会法规2006/1181（委员会建议，2006年）制定黄曲霉毒素的最高水平，赭曲霉素，棒曲霉素，DON（脱氧雪腐镰刀菌烯醇），ZEA玉米赤霉烯酮，伏马菌素和

10、无限的T-2和HT-2。而HT-2和T-2的高毒性被支承，缺乏足够灵敏的分析方法，使它们的最大浓度水平都在等待欧盟定义。国会法规1126/ 2007更新镰刀霉菌毒素的玉米和玉米产品（DON，ZEA伏马毒素）的最大允许水平的范围为每千克玉米含50-2000微克（委员会的建议，2007年）。允许的范围取决于毒性，但欧盟立法也规定在食品中直接用于人类消费的那种食物为每公斤两微克（委员会建议，2006年）。例如AFM1，虽然没有有效的作为AFB1，食用牛奶内的含量为每千克0.05微克，由于婴儿和儿童对牛奶的高消费水平。赭曲霉素允许的浓度也很小，约在每公斤0.510微克的范围内，也根据食物的种类决定（委

11、员会的建议，2006年）。分析霉菌毒素的官方控制（委员会指令，2005年）Samplig方法，预防/还原建议（委员会推荐要求-议书，2006年）和用于动物饲养的产品要有法规限制（委员会建议，2006年b）也可以来自欧洲联盟。2.3 霉菌毒素的测定分析技术 由于低浓度ppb通常被涉及到，所以非常敏感的霉菌毒素的分析方法是必要的。(Krska and Molinelli,2007). 常规分析方法主要是基于分离工具技术（如高效液色谱法，高效液相色谱法）和筛选酶免疫测定用途（如酶联免疫分析，酶联免疫吸附）(Koppen et al., 2010).目前在正式方法中使用的分析技术是反相柱高效液相色谱法

12、，利用分子荧光(Shephard, 2009)，紫外吸收或质谱检测器(Turner et al., 2009), 得到的0.01-5纳克毫升-1的检测限。这些方法包括富集和清理程序用于去除样品中的矩阵和干扰，例如用于包含抗霉菌毒素的免疫亲和柱和固相萃取柱的有机溶剂。有时分析物衍生对于光学检测是必要的。一些霉菌毒素的内在电活性已利用来开发安培检测中如HPLC玉米赤霉烯酮(Smyth and Frischkorn, 1980; Campas et al., 2012), DON的吸附溶出伏安法，黄曲霉毒素B1和B2的痕量水平(Campas et al., 2012), 葡萄酒中OTA的方伏安法(P

13、errotta et al., 2011) ZEA的安培的筛选和代谢物的,-玉米赤霉烯醇(Zougagh et al., 2008), 和一个96孔ELIME阵列的DON直接电化学传感和微波水解后的瓜萎镰菌醇的样品(Ricci et al., 2009)，但这些方法都不满足食品应用所需的灵敏度(Prieto-Simonet al., 2007). ELISA微孔板分光光度法已成为20年来快速检测霉菌毒素最有用的工具之一，尤其是对原材料的筛选，有时得到了低至0.1毫微克1的检测限。(Zheng et al.2006) 该技术是基于特异性抗体的能力去区分真菌毒素的三维结构和在大约1到2小时的时间内

14、尽力一个有竞争力的繁殖。尽管高基体的依赖，并有可能高估，ELISA试剂盒的巨大优势是速度快，易于操作，灵敏度和高样品通量。许多霉菌毒素的商业ELISA试剂盒被建立，以及可供现场使用。(Cigic and Prosen, 2009). 其他一些免疫分析技术已被开发，其中的一个最简单的和最快的（在几分钟内响应）技术是侧流装置，通常是在一个条带或浸渍片的格式但只是定性或测试的截止值的信息能被检测。(Maragos, 2004). 例如，在这样一个棒的底座上如果存在于样品提取液中的黄曲霉毒素和胶体金标记抗黄曲霉毒素抗体相互作用。 (Krska and Molinelli, 2007) 由于食品安全的控

15、制和对于检测真菌毒素快速和准确的方法高要求，发展生物传感器是至关重要的，在过去的20年里生物传感器的发展显著加快，目前它是霉菌毒素分析研究中最活跃的领域之一。(Ricci et al., 2007) 生物传感器涉及与传感器接触的识别元件（如酶，抗体，核酸或人工受体）。相关的霉菌毒素的物理化学性质（如荧光）或转导型，四组生物传感器主要用于：发光/比色(Goryacheva et al., 2007)，表面等离子体共振（SPR）传感器（Maragos，2004），质量敏感的石英晶体微天平（QCM）传感器(Vidal et al., 2009), 和电化学传感器(Laschi et al., 201

16、1). 生物传感器的重要性主要取决于其高灵敏度和最小的样品处理的特异性。其他的一些综述总结电化学(Tombelli et al., 2009; Palchetti and Mascini, 2012),optical (Goryacheva et al., 2007; Zheng et al., 2006)和其他(Maragos, 2004; Goryacheva et al., 2007; Prieto-Simon et al., 2007)用于毒素分析的生物传感器。电化学传感器在以上的群体中占据主导地位，它是本文综述的主题。3.电化学生物传感器的亲和力霉菌毒素电化学生物传感器用于检测真菌毒

17、素是由于它们的灵敏度，选择性好，低成本，简单突出，并且在某些情况下的小型化，便携和集成在自动化装置（Farre et al., 2009）。他们中的大多数是基于抗原和特异性抗体，但新颖特异性配体（例如核酸适体）之间的高亲和力相互作用不断涌现。（Palchetti and Mascini,2008; Laschi et al., 2011; Grieshaber et al., 2008，）已经用各种电化学技术（安培，电位，电导，阻抗）改造毒素的相互作用来分析信号。3.1电化学传导安培(伏安法)无疑是最合适的电化学传感器由于其高灵敏度和响应工作在多种霉菌毒素的含量。广泛使用的电流分析法是基于测量

18、的电流在一个固定的(恒电势的控制)或变量(伏安法)的潜力。大量的研究工作已经指向发现电极结构或纳米结构。极通常用惰性金属（Pt，Au）或碳（石墨，玻璃碳），虽然主要的缺点是测量之间的再生，所以今天一次性使用的丝网印刷电极（SPES），性格化的低成本和大规模生产，广泛用于克服这个问题。电化学阻抗谱（EIS）是一个功能强大的，非常敏感的，非破坏性的和信息技术，它允许以研究所述感测装置接口的电特性和跟踪在其上发生的反应（Laschi et al,2011;Zamfir et al., 2011）。无标记的电化学阻抗谱免疫跟随在来自真菌毒素的络合产生的范围内为每毫升1-20纳克的工作电极表面的变化的电

19、子传导阻力，用约每毫升0.5纳克的检测限。电化学阻抗谱生物传感器的主要优点之一就是不需要接合抗体与酶或真菌毒素,提供电化学信号(Grieshaber et al .,2008)这意味着修改电极表面,例如使用一个金电极表面4 -羧基苯基（4-CP）膜接枝的电化学还原相应的4 -羧基苯基的抗体构建一个敏感的阻抗免疫传感器检测OTA的共价键的重氮盐。虽然不太使用由于低信号/噪声比,电位(Rameil et al .,2010)和交流电导率(Liu et al., 2006)免疫传感器也被免疫传感器也被描述为黄曲霉（Rameil et al., 2010; Liu et al., 2006）等人，和D

20、ON（Kwonet al., 2011）的毒素。电位装置探测变化的潜力在零电流，而电导检测设备的变化传导两个电极之间。化学敏场效应晶体管（chemFET处）是一个重要的该电位生物传感器群，并已用于检测DON（Kwon et al., 2011）。3.2.识别受体2012). 天然（抗体，DNA）和人工（改造抗体，抗体片段，适体和受体样分子印迹聚合物）已被用于选择性结合毒素分子（Romanazzo et al., 2010; Campas et al；2012）提出对所选真菌毒素特异性抗体是最常见的（Rasooly and Herold, 2007），但适体的使用作为配位体识别目前在生长的OTA

21、的情况下。有些作者使用的霉菌毒素产生的酶抑制作用获取酶生物传感器用于这些分析。然而，这种生物传感器的主要问题是缺乏选择性，因为从样品其他毒素或分子也可能抑制酶反应（Arduini et al., 2007）。例如，安培生物传感器被用于孢霉菌毒素（AOH，AME）定量与碳糊电极蘑菇酪氨酸酶的发展，对黄曲霉毒素B1抑制乙酰胆碱酯酶（Moressi et al., 1999）(Pohanka et al., 2010; Arduini et al., 2010; Ben-Rejeb et al., 2009; Cuccioloni et al.,2008) 。这些传感器仍然作为一个“概念验证”,而不

22、是实际化验,由于缺乏选择性(例如疼痛是不可逆地抑制由有机磷和氨基甲酸酯农药(Vidal et al.,2008)和高LODs。抗体和抗体片段 真菌毒素特异性抗体的合成已经允许依赖于选择性识别真菌毒素的任何表位的一系列的分析的免疫测定。霉菌毒素是小的，非免疫原性分子（半抗原），并必须要绑定到合适的载体蛋白以引发足够的免疫反应。这意味着对于蛋白质的某种可能的亲和力，如对于BSA(Vidal et al., 2011). 大多数免疫传感器检测真菌毒素是基于竞争性测定法，和典型格式，包括直接和间接的方案（Maragos，2009年），但是由于这些分子的尺寸小并不是三明治格式。 从他们的生产方式，有三种

23、抗体：多克隆抗体(pAb), 单克隆(mAb)和重组（RAB）。多克隆是从具有低成本和易于开发的免疫动物的血液中纯化的。小心纯化缀合物（获得选择性）是非常重要的，有时用于该结合物会出现交叉反应的蛋白质（例如，BSA）。单克隆抗体是是来源于通过融合小鼠骨髓瘤细胞得到的阳性杂交瘤和免疫小鼠的脾脏细胞。相同分析性能的均匀性和无限的生产是他们的优势。第三代抗体技术是重组抗体(rAbs),它不需要动物。一些抗体的功能基因被克隆并从阳性杂交瘤或具有或不具有免疫的脾细胞传送到原核或真核器官（转基因生物）。最后，重组是可表达，筛选和收集的。抗体也可以被认为是还原剂或蛋白水解酶产生的碎片，保留了抗原片段处理结合

24、区（FAB）和增加的亲和力和特异性(Maragos, 2009). 另外也可以用重组技术来隔离免疫球蛋白主要涉及与毒素结合可变部分。(Maragos, 2009). Fab片段作为整个抗体的一个替代物显示，它们的更小的尺寸有助于非特异性的结合最小化，由于通过Fc片段相互作用和降低异构系统的空间障(Romanazzo et al., 2010). 噬菌体展示的方法也可以用于从霉菌毒素亲和性的肽库，和产生对动物有害的有毒的抗原配位体中识别分子，因此，困难随着传统的抗体提高技术而产生。适体适体的配体是单链核酸（DNA，RNA），可以以高亲和力和特异性结合到广泛的目标，范围从大的蛋白质小分子，如氨基酸

25、或药物短序列（20-90核苷酸）。他们是通过一个名为SELEX体外选择过程(系统指数富集配体的进化过程),于1990年首次报道(Ellington and Szostak,1990)。适体具有一定的物理化学条件，折叠成定义的三维构象,促进特定交互与目标分子具有高亲和力的常量(Hayat et al., 2012)。虽然抗体已为数年的霉菌毒素的分子识别标准，适体已经出现，由于固有的优势，相对于抗体免疫动物是不需要的，更多的化学和热稳定性，相对于PABS变异较小，或廉价的体外合成。特别是，常用的适体不容易受到存在溶剂中的变性真菌毒素的提取。 适体的OTA在2008年被选中，以下是字符化荧光偏振和平

26、衡透析(Cruz-Aguado and Penner, 2008a; Cruz-Aguado and Penner,2008b) 。已确定的适体具有较高的特异性OTA，并证明是对OTA的小麦籽粒通过亲和层析耦合到分子荧光检测的决心非常有用。结合亲和力，制止开采通过平衡透析，是在纳摩尔范围内，相当或以下的结合抗体常量OTA。由于这两部作品的后果，一些电化学OTA s出现从2010年，首创的一人用磁珠（MBS）作为孵化固体支持开发我们的实验室。基于核酸适体的电化学传感器是非常敏感的，显示检测的范围限制在每毫升0.030.8纳克之间 OTA（表3）通常高于安培免疫传感器在应用得到验证。预计

27、更多的工作在不久的将来，新的计划是可能的利用附着在氧化还原介质的适体的构象变化。因为新方案是可能利用附连到氧化还原介体的适体的构象变化。采用电化学阻抗谱（EIS非常敏感（每毫升最高达10 -4纳克OTA）标签免费被描述。2010年,六个独特的适配子序列经过18轮的SELEX显示绑定FB1亲和力高,其中一个(FB1-39)100730纳米的离解常数。这项工作打开了新的适配体传感器和固体萃取柱，但迄今为止，没有任何报道。作为一个初始工作,我们实验室已经证明使用FB1-39的可能性在未来的电化学适体传感器中。该公司是Neoventures生物技术公司。拥有专利的具体适体AB1和玉米赤霉烯酮的目标且K

28、d 10 nM，并介绍了OTA，黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮与横向流技术的商业适体为基础的设备。在这种情况下，我们发现对于真菌毒素问题新的适体性。到目前为止，只有特定的适配体的OTA，FB1，AB1和玉米已被报道，但预计在不久的将来，一个大的增加。3.2.3. DNA和人工受体黄曲霉毒素的亲和力原生和变性DNA(ss-DNA和ds-DNA)已经证明(Mascini et al .,2001)。检测杂交反应之间的固定探针和目标在溶液中通过鸟嘌呤的氧化改性AFB1侵入困在双链,它允许测定AFB1范围每升10 - 30毫克。在电流允许的条件下，DNA杂交时间造成的黄曲霉毒素M1是我变化范围在1.9-

29、20.9纳米内判定。一个阻抗滴定的 AFM1生物传感器的基础上的SS的DNA探针和黄金纳米粒子提供了线性响应浓度范围每毫升114纳克和应用于牛奶样品。电化学DNA生物传感器在玻碳电极上的电化学氧化OTA也用于评估OTA和DNA之间的可能的相互作用（奥利维拉等人。，2007）。然而，大多数这些杂交的DNA生物传感器有一个巨大的缺乏对环境毒理学应用的选择性和灵敏度，和很少的报道导致了今天这种结果。超分子有机结构的环糊精和氯茶碱长效是众所周知的强烈绑定的黄曲霉毒素，但没有任何选择性（Rai and Varma, 2010）。相反，分子印迹聚合物（MIP）和结合肽的组合合成得到的，是很好的候

30、选人霉菌毒素亲和配体。分子印迹聚合物的合成交联官能聚合物的分析物的存在下进行的。紫外线和热聚合后，分析物或模板分子的去除，从而形成一个腔，其中只有感兴趣的分析物可以安装非常有选择性的靶分子互补，作用类似于合成抗体（Blanco-Lopezet al., 2004）。然而，尽管一些分析荧光应用（Baggiani et al., 2008; Vidal et al., 2012a），MIPS只被施加到OTA选择性清理萃取（Jorn and Edward, 2007）和thricothechene玉米+也（mizaikoff，2003），或在固相柱（Jodlbauer et al., 2002）在非

31、常复杂的食品基质霉菌毒素选择性是主要的问题，而不是作为生物传感应用合成受体超分子有机结构的环糊精和氯茶碱长效是众所周知的强烈绑定的黄曲霉毒素，但没有任何选择性（Rai and Varma, 2010）。相反，分子印迹聚合物（MIP）和结合肽的组合合成得到的，是很好的候选人霉菌毒素亲和配体。分子印迹聚合物的合成交联官能聚合物的分析物的存在下进行的Baggiani et al., 2008; Vidal et al., 2012a。紫外线和热聚合后，分析物或模板分子的去除，从而形成一个腔，其中只有感兴趣的分析物可以安装非常有选择性的靶分子互补，作用类似于合成抗体（Blanco-Lopezet al

32、., 2004）。然而，尽管一些分析荧光应用（Baggiani et al., 2008; Vidal et al., 2012a），MIPS只被施加到OTA选择性清理萃取（Jorn and Edward, 2007）和玉米（mizaikoff，2003），或在固相柱（Jodlbauer et al., 2002）在非常复杂的食品基质霉菌毒素选择性是主要的问题，而不是作为生物传感应用合成受体4. 电化学生物传感器：选择应用据报道各种各样的电化学免疫传感器检测限在0.520纳克毫升，动态的顺序范围霉菌毒素的浓度高达约为1-100纳克毫升。(Shephard et al., 2012). 最近报道

33、OTA电化学适体传感器与较短孵育时间的常规免疫有相似的或更好的灵敏度和选择性。 安培生物传感器是最常见的，但是EIS使用的越来越频繁。最近的一些进展（使用MBS，奈米化及其他）的评论在5节。表1-4总结了记载用于黄曲霉毒素，赭曲霉毒素和其他（trichochetene及其他）的真菌毒素的亲和性电化学生物传感器的完整文献4.1黄曲霉毒素 黄曲霉毒素特异性抗体的合成已经产生了一系列的竞争性和非竞争性免疫测定技术和大量的ELISA和免疫传感器。(Li t al., 2009) 黄曲霉毒素的定量分析在电化学生物传感器测定之前需要样品萃取合适的含水甲醇的溶剂混合物。出现的大多数是谷物(Ammida et

34、 al., 2006),，但是很少有文章的重点是特殊基质如红辣椒粉，橄榄油，葡萄和人血清，和花粉（见表1）。为了实现比ELIS A更高的灵敏度和转到使用一次性探头，根据单一的SPEs得到的电化学免疫传感器AFB1首次在21世纪中期被 Palleschi等提出。相同的作者们描述了使用MBs的一种用于AFB1的间接竞争ELISA格式和作为电化学传感器的八磁化的SPE。(Piermarini et al.,2009).用于测定用单克隆抗体AFB1和SPE的间接竞争免疫传感器伏安法（DPV）与测定大麦中黄曲霉毒素B1荧光法和ELISA法相对比。(Ammida et al., 2006)SPES轴承抗体

35、对阵列配置中的AFB1能够与96孔microtriter板共同使用通过把电极侵入到用于自动化多分析物测定的微孔中。(Pemberton et al., 2006). 一个类似的但更先进的理念，之后的进步是使用一个96孔的丝网印刷板耦合到一个多通道电化学检测系统的一种电化学免疫传感器阵列和间歇脉冲安培法技术（IP-AMP）。这个系统允许AFB1敏感的测定(Piermarini et al.,2007a)和黄曲霉毒素同时进行多个样本（Neaguet al., 2009) 相似的间接竞争ELISA。相同的96孔阵列用于同时来检测AFB1和A型单端孢（T-2和HT-2) (Piermarini et

36、al., 2007b) 鉴于成本，与由厚膜工艺生产的单个SPE相比较，此阵列将导致在成本/电极是1/5的格式，这格式允许建立一个多分析阵列。虽然基于电化学生物传感器的第一个AFM1传感器和DNA杂交抑制出现在1998(Siontorou et al., 1998),但是首创的AFM1电化学免疫测定出现在2004年，黄曲霉毒素使用流动注射系统(Nagwa et al., 2004) 和黄曲霉毒素(Badea et al., 2004)几乎所有关于黄曲霉毒素的文章（正如表一所示）都是调查牛奶和奶制品中的矩阵。SPE是理想的传感器，用于可拆卸AFM1免疫传感器（arker et al., 2009;

37、 Micheliet al., 2005) 和用于从乳研究基质干扰。(Parker and Tothill, 2009).最近，根据在玻碳电极（GCE）上形成的硅胶离子液体的生物膜和和被Pt电极修饰的苯胺（PANI）(Zaijun et al., 2010)与聚苯乙烯磺酸（PSSA）薄膜(Owino et al.,2007).，非常敏感的AFB1的阻抗免疫传感器被开发出来。阻抗测量也导致黄曲霉毒素生物传感器用于固定一层 一层明确结合毒素的单链DNA探针(Dinckaya et al., 2011)，纳米结构化的Au和Ag的SPE免疫传感器(Vig et al., 2009) 和免疫传感器上的银

38、线电极(Bacher et al., 2012). 电导为AFB 1(Liu et al., 2006)，黄曲霉毒素M1的直接竞争免疫传感器的电位被报道。通过测量过氧化氢产生酶，表达的黄曲霉毒素氧化酶可以允许催化的生物传感器用于AFB 14.2 赭曲霉毒素OTA污染发生在每克数额非常低毫微克在种类繁多的商品（谷物，豆类，地面坚果，香料，干果，咖啡，啤酒或葡萄酒），因此，非常非常敏感的电化学生物传感器和矩阵的选择性是必要的实现监管立法的限制。OTA电化学生物传感器通常应用于葡萄酒、小麦、烤咖啡、啤酒、玉米和其他谷物,虽然也在苹果等不同寻常的标本。葡萄酒样品一个典型的问题是潜在的电活性干扰物,可以

39、删除与PVP等络合剂(聚(乙烯吡咯烷酮)(Vidal et al., 2012b; Prieto-Simon et al., 2008)OTA的免疫传感器从大约2004年已经有很多报道的，其中包括帕拉斯奇等人。固定化抗体OTA在丝网印刷电极（SPCEs）的单克隆抗体（mAbOTA）和多克隆抗体（PABOTA OTA）进行了比较，说明在某些情况下，至少一个数量级较低的IC 50值时使用的单克隆抗体。免疫传感器的换能器是通常的SPE，玻璃状碳，或金属电极，和固定化的方法包括重氮官能化的金电极，金胶体层用于增强在金缀合的OTA，被动吸附，耦合到羧甲基化的葡聚糖水凝胶的表面负荷电极，或碳化二

40、亚胺化学共价程序。已经进行了在各种纳米材料的通用兔抗体的固定化，如纳米晶体TiO2的-壳聚糖，苯胺偶联至阿拉伯胶，煅制二氧化硅纳米粒（纳米SiO 2）的壳聚糖（CH）薄膜的溶胶 - 凝胶衍生的氧化铈电影，CH-氧化铁纳米复合材料，CH-polyani系杂交开展生物聚合物薄膜，CS-钛纳米复合薄膜沙溶胶 - 凝胶衍生的氧化锌薄膜，所有被带领到OTA免疫传感器。然而，使用通用的R-的IgG抗体没有非特异性以OTA排除他们的选择性。我们小组的研究开发竞争的直接和间接的电化学免疫到OTA SPE上换能器（Bonel等人，2010;维达尔等人，2011），显示出由于奈米化与金纳米粒子在间接测定形式的改进

41、和使用磁珠（MBS）EIS的固有感光度和优点已经导致了一些阻抗滴定的免疫传感器对OTA所有具有非常小的检测限（表2）的发展。在大多数情况下，一个简单的铁氰化物/亚铁氰化物的电荷转移介质，仅需要获得阻抗的测量，而不需要酶标签或任何有界电化学介体（Radiet al., 2009a）。主要的挑战是找到用于固定在电极上改变初始电化学电子转移阻抗的适当方法和结合后的OTA与抗体或适体产生较大的变化。为了这个目的，电解磺化苯胺（Muchindu et al.,2011），重氮盐有机改性的金电极（Radi et al., 2009b）和共固定BSA上的C-11的SAM（Solanki et al., 20

42、10）已经被扎姆菲尔等人报道了。使用磁性纳米颗粒上的金电极检测比较了EIS与SPR的OTA(Zamfir et al., 2011)。尽管SPR测量显示更大的响应范围(每毫升OTA 1-50 ng)比EIS(每5毫升0.01ng ),SPR的LOD(每毫升0.94ng)高于与阻抗检测(每毫升0.01ng) 。分析结果表明，根据在所有情况下用标准的ELISA检测试剂盒。对OTA使用适配子一直是一些在过去两年（见表3）期间发表的论文的主题。这些适体的成本低，可以容易地标记与多种分子如酶，生物素或电介质，这使各种检测方法（Laschi et al., 2011）的发展。通常，J.C. Vidal等人

43、的存在。/生物传感器和生物电子学49（2013）146 158154钙离子是必不可少的OTA结合的适体由于这些离子有利于提高其亲和力的适体的G-四链体结构（Castillo et al., 2012）。EIS是一个非常适合的技术用于OTA 生物传感器，所以几个试验方案已报告。第一个基于适体的电化学传感器用于葡萄酒有每毫升0.1-20纳克的感应范围，用亚甲基蓝氧化还原介体和DNA杂交反应来扩增感测信号（Hua et al., 2010）。Barthelmebs等人的各种适体的性能和调查的直接和间接竞争酶联适体检测使用（ELAA）中的OTA的葡萄酒检测（(Barthelmebs

44、 et al.,2011a) 。作为一个后续的工作，同一作者报告了一种新的基于对MBS具有每毫升LOD0.11纳克竞争性测定的电化学生物传感器(Barthelmebs et al., 2011b)。在另一种工作，一种核酸外切酶催化的目标回收策略取得了放大OTA的电化学生物传感器(Barthelmebs et al., 2011b)。二茂铁标记的探针DNA在玻碳电极适配子杂交，然后在探针的DNA发夹结构的二茂铁离开在接近电极表面后，从适体OTA复杂导致的核酸外切酶解放变换分解结果存在的OTA(Tong et al., 2011) 。有竞争力的直接和间接生物传感器可以进行在一个类似于分光的ELIS

45、As（Barthelmebs et al., 2011B）。我们已经报道首次使用基于DNA的生物素化的适体的OTA一个有竞争力的适体传感器，其耦合到顺磁珠电化学检测，能够对OTA的测定，小麦远低于在欧洲联盟允许谷物的最大电平（每千克3微克）。该LOD为每毫升0.07纳克与赭曲霉毒素B的交叉反应适体可以忽略不计 (Bonelet al., 2011)4.3 单端孢和其他真菌毒素除了黄曲霉毒素和OTA，很少电化学生物传感器已经被开发用于其他重要的霉菌毒素（表4），这意味着它是一个劳教所探索。据我们所知，唯一报道的FB1 + FB2的电化学免疫传感器采用单克隆抗体修饰的丝网印刷金电极和监测与TMB的

46、计时电流法的反应，得到的LOD5ng mL 1的FB1 + FB2和从每毫升1到1000纳克的动态范围(Kadir and Tothill, 2010) 。 一些报告指出DON电化学免疫传感器(Vidal et al., 2012d)，使用复合材料如富勒烯C-60，离子液体和二茂铁在壳聚糖薄膜在GCE(Wei et al., 2011)，重组Fab抗体片段和一个96孔的电化学板的快速检测的DON和nivalenol微波水解方法和直接电化学传感后(Romanazzo et al., 2010) (Ricci et al., 2009) 一些报告指出DON电化学免疫传感器（维达尔等，2012d），

47、使用复合材料如富勒烯C-60，离子液体和二茂铁在壳聚糖薄膜在GCE（Wei等，2011），重组Fab抗体片段和一个96孔的电化学板的快速检测的DON和雪腐镰刀菌醇微波水解方法和直接电化学传感后(Ricci et al., 2009) (Ricci et al., 2009)。Escarp等人，已使用了一些玉米MBS电化学免疫传感器(Hervas et al., 2009a)和规格（(Hervas et al., 2010）测定在婴儿食品。一些这些ZEA免疫传感器被集成到使用的MB的电动微流体系统(Hervas et al., 2009b, 2011)，这使得灵敏度极低的样品和试剂体积和保温酶反

48、应被操纵原位。拉巴等人。还报道了玉米的电化学免疫传感器在微流体器件(Lai et al., 2011; Panini et al., 2010)，获得比ELISA低检测限。该作者还开发了一种微流体测定大米中桔霉素的电化学免疫传感器(Arevalo et al., 2011)。我们组的研究已经开发成功为去年使用SPCEs和MBS DON和FB1安培免疫传感器，我们的初步结果已经提交给科学界在出版之前(Vidal et al., 2012c, 2012d)。 5.电化学生物传感器霉菌毒素和未来发展趋势的最新进展与传统的生物传感器几种科学的进步已经克服了一些困难，首先在真菌毒素的测定，提高他们的分析

49、性能。其中最活跃的领域是使用纳米材料的复合材料，用于修改电极(Palchetti and Mascini, 2012; Farre et al.,2009)。纳米材料具有多项功能的用于电化学生物传感器，例如高表面积，稳定性，生物相容性，易于官能化，独特的尺寸和形状，易分散性和快速制造，通常是生产增强的配位体和增加的电流的表面浓度（(Tothill, 2011)。主要的挑战是他们依赖于组合物的物理和化学性能，需要仔细优化。金属纳米粒子（NPS），尤其是金纳米粒子（金纳米粒子），碳纳米管（CNTs）是最常用的材料（Campas et al., 2012; Palchetti and Mascini

50、,2012; Tothill,2011)。例如，金纳米粒子被加上polithionine的电聚合膜（Owino et al., 2012）和离子液体中的Nafion用于确定AFB 1（Sun et al., 2008）金纳米粒子可以在玻碳表面的大米样品中桔霉素的微流体测定直接生成（Arevalo et al., 2011）。耦合的自组装膜（自组装单分子膜的烷烃硫醇）与金纳米粒子传感器固定后允许OTA半抗原（Liu et al., 2009; Vidal et al., 2009）。纳米材料也会增加系统中的电极的电荷转移电阻的测量（校园等人。，2012）和使用共轭配体（适体或抗体）与纳米材料（P

51、alchetti and Mascini, 2012）。例如，一个DNA探针的金纳米粒子（AFM1 dinckaya等人。，2011）或在一个AFM1免疫传感器的银纳米粒子连接(Vig et al., 2009) 。我们用抗原OTA与牛血清白蛋白共轭黄金奈米化（牛血清白蛋白的蛋白质）的OTA的伏安传感器协同效应(Vidal et al., 2011)。纳米颗粒充当间隔物基质延长的OTA-BSA远造成的结合更可用抗OTA抗体位点。酶示踪剂与引渡的抗体结合的生物素化也消除的一种保温步骤，例如：带有标记的第二抗体，以获得安培的电流（Vidal et al., 2011）。纳米粒的其他用途是

52、作为用于电化学检测的标签，但经常扩增的酶是优选用于此目的（Tothill，2011）在纳米粒子的情况下，碳纳米管被用来增加工作电极的表面面积，电催化性能（的边缘面状石墨网站活动），和将特定的氧化还原探针（Campas et al., 2012; Tothill, 2011）。微流体免疫传感器，玉米赤霉烯酮(Panini et al., 2010)和酶黄曲霉毒素氧化酶生物传感器(Li et al., 2011)分别使用沉积在玻碳和铂电极多壁碳纳米管。新型石墨烯ELEC-处接上的材料没有被利用最新的霉菌毒素电化学生物传感器量子点半导体纳米晶体已经产生用于光学生物传感器很大的兴趣，但也有未在电化学生

53、物传感器用于真菌毒素的应用，尽管它们作为标记的潜在用途电化学生物分析复用或与一起选择溶出伏安法（Palchetti and Mascini, 2012）传感器本身也提供了进一步提高灵敏度的潜力例如具有从金属中的EIS形成交叉电极（Laschi et al., 2011），改性SPCEs（Vidal et al., 2011）或用于微梳电导电极AFB 1(Liu et al., 2006) 。生物传感器阵列的更多，用于检测多个真菌毒素相同的样品中，因为它们可以节省时间，并检测出协同效应比影响个体测定各真菌毒素的预期在未来（Prieto-Simon et al., 2007）。例如，一个微阵列免疫

54、用35金JC维达尔等。/生物传感器与生物电子学49（2013）146-158155元和片上参考和反电极被用于牛奶样品中确定黄曲霉毒素M1的开发，具有高灵敏度源于增强大众交通在微电极时，半球形扩散层形成(Parker et al., 2009)。我们多感觉装置结合多路恒电位仪进行平行的电化学测量允许多个样品八在我们的实验室使用，复制和所有相应的控件可以同时测量（Vidal et al., 2012c）。其他流行预先使用磁珠（MBS）。官能化和MB的分离的外部磁场下的可能性显着地改善传统的免疫传感器和适体传感器的性能（(Laschi et al., 2011）。MBS粒子（d13 mm）由磁性材料

55、色散（(Fe2O3 and Fe3O4）和覆盖着薄薄的外壳的聚合物，用于定义一个表面积的吸附或耦合的各种分子（霉菌毒素，抗体或核酸适体）。商用的MB与各种修饰电极都容易获得。多功能MBS已用于亲和支持AFB1的共轭BSA（牛血清白蛋白）磁性附着的铟锡氧化物（ITO）电极（Tang et al., 2009），一个玉米传感器（Hervas et al.,2009b; Hervas et al., 2010），在牛奶中的AFM1检测（Panielet al., 2010），或在EIS / SPR检测OTA(Zamfir et al., 2011)。我们已经证明，在我们的实验室中

56、一个显著下降启示和葡萄酒基质干扰由于顺磁性微粒，也允许的酶标记的精确位置上的磁化工作电极表面上的OTA免疫(Vidal et al., 2012b).。芯片实验室”是指集成微流体系统设计来执行一个或多个步骤的免疫传感器的信号(Vidal et al., 2012b)。这些装置可以与腔室用于孵育或多个通道，并允许电化学多分析物检测用的微电极在每个通道中存在的亲和反应的直接量化进行(Parker et al., 2009)。电化学微流体电路和免疫芯片的传感器已被设计为AFM1(Parker et al., 2009)。微流体系统中的这些设备，比表面积大的小尺寸降低的孵育时间，试剂的量，劳动成本。此

57、外，该技术可以有利地和容易地结合住房抵押贷款证券化的使用(Hervas et al., 2009a, 2011; Lai et al., 2011)。在我们看来，对于提高霉菌毒素的生物传感器的最令人兴奋的领域之一是发展新的亲和配体和合成。毫无疑问，新的重组抗体，今天不存在新的适体（如DON，单端孢）将打开新的机遇。标记的适配体的构象变化可以用来调节电标签的距离的电极，从而改变在新的基于适配子的测定法设计的氧化还原电流。其他的可能性是新的竞争法方案的开发（(Vidal et al., 2011)，减少了耗时的温育步骤(Vidal et al., 2011)，或结合紧密的非面状结构(Bonel et al., 2010)和MBS (Vidal et al., 2012b).。然而，夹心测定具有两个配位体通常是不可能的，由于该毒素分子(Palchetti and Mascini, 2012)的小尺寸。另一方面，我们看来在未来必须的改进是：霉菌毒素暴露识别个体的生物标志物，包括代谢AFB1分析（Shephard，2009）或FB1(Scott, 2