甘油含量测定

1、嗯。你都问到这个问题了，具体仪器、操作什么的我就不说了。就说一下思路。强碱条件下甘油和二价铜的络合物显绛蓝色，所以利用甘油的这个特性就可以轻松搞定。主要试剂是AR级的甘油、氢氧化钠、硫酸铜。向氢氧化钠碱化的甘油溶液里加硫酸铜，一定要保证甘油被完全络合，并且保证多余的二价铜都以氢氧化铜沉淀形式存在，但是氢氧化钠也不要加太多。甘油铜可见区最大吸收波长是在630nm。先作个标准系列，绘出吸光度-浓度曲线，然后把待测试样吸光度测出来在标准曲线上一算，浓度就得到了。氢氧化铜解离出来的铜离子在630nm处也有吸收，好在它是一个定值，测出来后从每个甘油的A里面扣掉就行了。甘油含量化学方法有很多，比色法，滴定

2、法甘油在强碱性条件下，与Cu2+定量形成绛蓝色的甘油铜溶液。根据朗伯-比尔定律，溶液吸光度A与吸光物质浓度C成正比：A=kC。甘油配制浓度C1与衍生的分析甘油铜浓度C有如下关系：C=k1C1，k1为稀释系数，则吸光度值与甘油配制浓度有如下正比关系：A=kk1C1+，k、k1为常数，为系统误差。先根据吸光度与甘油配制浓度C1做出关系曲线:，然后确定最佳线性拟合范围，最终得出拟合线性方程，程序化后，用于甘油含量的快速测定。供应 拜发甘油检测试剂盒 发布日期：2010-9-21 截止日期：2009-5-9名称：甘油检测试剂盒编号：EK-GCROL货号：100001001Cas N

3、o：70购买：Glycerol Assay Kit(70 次测定)简介:甘油是一种非常重要的物质，广泛的应用于工业生产中，在食品工业中，常被作为保湿剂、增香剂和增色剂等使用，以改良食品的质量。甘油是酿酒酵母发酵过程中的副产物,也是灰质葡萄孢新陈代谢过程中的一个重要产物，甘油是高品质果酒的一个成分，高品质的葡萄汁中不含有(或只含有痕量或微量)甘油，浓度大约为1%(v/v)，若葡萄汁中含有甘油则意味着产品中使用了品质不好的原料。甘油也常常作为润滑剂用在洗涤液、乳酪和牙膏中，在制烟工业中，通过通常是预先向烟叶上喷洒甘油以保障不会粉碎的目的。原理:甘油在甘油激酶(GK)的作用下被磷酸化，消耗ATP转化

4、成L-3磷酸甘油（L-glycerol-3-phosphate）。(1) Glycerol + ATP (GK) L-glycerol-3-phosphate + ADP上式中形成的ADP在丙酮酸激酶(PK)的催化下可与PEP作用，生成ATP及丙酮酸酯(2) ADP + PEP (PK) ATP + pyruvate丙酮酸酯在L-乳酸酯脱氢酶(L-LDH)的作用下可被NADH还原为L-乳酸酯，NADH被氧化为NAD(3) Pyruvate + NADH + H+ (L-LDH) L-lactate + NAD+被氧化的NADH的量取决于甘油的量，NADH的吸光度值可在340下测量。特异性, 灵

5、敏度, 测量范围和精确度:该实验方法是专门用于测定甘油含量的，对于纯甘油（水中的游离甘油）几乎可以100%检测到。最小可调吸光光度为0.010个吸光单位，样品体积为2.00 mL，若在340nm下检测,此时的甘油浓度为0.171 mg/L。如果最小可调吸光光度为0.020吸光光度，样品体积为2.00 mL，在340nm下检测,此时的甘油检测线为0.342 mg/L。该实验的测量范围为0.8ug-35ug甘油，同一样品分别进行两次测定，其吸光度值会有0.005-0.010吸光单位的变化，对于样品体积为2.00 mL，此时的甘油浓度大约在0.086-0.171 mg/L之间，如果样品是经过稀释的，

6、在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数（F）,如果在样品制备阶段，样品的重量是被称量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。干扰:如果甘油在试验规定的时间内（大约5分钟）完成转化过程，通常认为没有干扰发生，然而，通过向已完成反应的试管中添加甘油（0.1mL中添加20ug），进一步的实验表明，吸光度值还会进一步降低。利用附带的内部的标准质控可以对干扰物质进行鉴定。定量回收试验：通过向样品中添加标准质控，计算样品在处理和提取时的损失。如：在最初的提取步骤时添加一定量的甘油。安全性:甘油测定所使用的试剂没有有毒物质。然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02

7、% w/v)，需要按照实验室安全操作规程进行试验。试剂盒:Megazyme甘油含量测定试剂盒可以进行70次的测定试验，并提供有全部的试验方法：瓶1: Tris/HCl 缓冲液 (30 mL, 1.0 M, pH 7.4) +氯化镁(30 mM)+叠氮化钠(0.02 % w/v)稳定性> 2年，4°C保存。瓶2: 药片(14个) 含有NADH+ATP +PEP稳定性> 2年，4°C保存。瓶3: 丙酮酸激酶(600 U/mL)+L-乳酸酯脱氢酶(550 U/mL)悬浮液1.5mL稳定性> 2年，4°C保存。瓶4: 甘油激酶悬浮

8、液(1.5 mL, 85 U/mL)稳定性> 2年，4°C保存。瓶5: 甘油质控标准液(5 mL, 0.20 mg/mL)+ 0.02 % (w/v)叠氮化钠稳定性> 2年，4°C保存。试剂制备:1. 使用瓶1作为稀释液。2. 1.1 mL Tris/HCl缓冲液溶解瓶2中1片药片，大约1-2分钟，足够进行5次试验。一旦药片溶解，NADH吸光度会随着时间的延长而降低，不过溶解的药片保存在4°C下大约可以使用4天，或保存于-20°C下大约可以使用4周的时间。注意: 在打开瓶子前，首先需要将瓶子中的药片恢复到室温，避免潮气可能吸附

9、到药片上，而影响药片的稳定性。3 & 4. 准备瓶3和瓶4种的溶液，第一次打开前，需要充分晃动瓶子，不要让酶吸附在橡皮塞上，然后垂直存放好瓶子。每次使用前还需要充分混合其中的内溶物。5. 准备瓶5溶液。注意:当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质抑制了试验，再使用甘油标准质控溶液进行测定，通过测量NADH的消光系数而计算甘油的浓度。实验需要的设备:1. 容量瓶(50 mL, 100 mL和500 mL).2. 比色杯 (1 cm, 3.0 mL).3. 微量移液器4. 连续分配器5. 分析天平6. 分光光度计 340 nm.7. 漩涡混合器8. 定时钟9. Whatman No.

10、1 (9 cm)滤纸操作步骤:波长: 340 nm比色杯: 1 cm light path (玻璃或塑料)温度: 25°C最终体积: 2.34 mL样品溶液: 每个比色杯中含有0.8-35ug甘油（存在于0.10-2.0 mL样品溶液中）空白调 0：相对于空气或者水溶液 空白管 样品管蒸馏水( 25°C)样品溶液2(NADH/ATP/PEP/Tris/HCl)悬浮液3(PK/L-LDH) 2.10 mL0.20 mL0.02 mL 2.00 mL0.10 mL0.20 mL0.02 mL混合*，在反应大约4分钟后读取溶液(A1)的吸光度值（前反应完成*），在添加下列试剂后继

11、续进行试验悬浮液4(GK) 0.02 mL 0.02 mL混合*，在停止反应后（大约5分钟）读取溶液(A2)的吸光度值，如果反应没停止，在间隔2分钟后，再次测量，直到最终的吸光度值不再变化。* 用塑料棒搅拌或用试管塞封闭严实后轻轻颠倒* 必须在等到前反应完成后再添加悬浮液3(PK/L-LDH)计算:分别对空白管和样品管两次测得的吸光度值进行相减(A1-A2)，这样就获得了Aglycerol，按照常规Aglycerol 的数值至少要在0.100个吸光单位，才能获得满意的试验结果。甘油的含量可以依照下列公式计算:C = V x MW x Aglycerol g/Lx d x

12、 v注释:V = 最终体积 mLMW = 甘油分子量 g/mol = NADH在340 nm下的消光系数 = 6300 l x mol-1 x cm-1d = 比色管管径 cmv = 样品体积 mL简化公式:C = 2.34 x 92.1 x Aglycerol g/L6300 x 1 x 0.10= 0.3421 x Aglycerol g/L如果样品在制备过程中被稀释了，计算结果还必须乘以稀释系数F。当被分析的物质为固体或半固体时，甘油含量(g/100 g)依照下列公式计算：甘油含量= C甘油 g/L 样品溶液 x 100 g/100 g样品

13、重量 g/L 样品溶液注意: 使用Mega-CalcTM，该计算方法可以被简化。 制备样品:1. 稀释样品.比色杯中（如：分析0.1 mL的样品）的甘油总含量必须在0.8-25ug之间，因此样品溶液必须被充分的稀释到浓度在0.008 -0.35 g/L之间。估计浓度(g/L) 蒸馏水稀释 稀释系数F< 0.350.35-3.53.5-35> 35 不用稀释1 + 91 + 991 + 999 1101001000如果Aglycerol 的数值太低(如< 0.100)，可以增加称量的样品量或不要进行过分稀释，也可以增加比色管中的样品量到2.00 mL，只

14、要确保样品和蒸馏水的总量在2.10 mL即可。2. 净化样品.a. 溶液:Carrez I溶液：溶解3.60 g亚铁氰化钾K4Fe(CN)6.3H2O (Sigma cat. no. P-9387)到100 mL的蒸馏水中，室温保存。Carrez II溶液： 溶解7.20 g硫酸锌(ZnSO4.7H2O) (Sigma cat. no. Z-4750) 到100 mL的蒸馏水中，室温保存。氢氧化钠(NaOH, 100 mM)：溶解4 g NaOH到1 mL的蒸馏水中，室温保存。b. 步骤:吸取液体样品到含有大约60 mL蒸馏水的100 mL容量瓶中，或称取足够量的样品到含有大约60 mL蒸馏水

15、的100 mL容量瓶中，缓慢的加入5mL Carrez I 溶液和10mL NaOH溶液(100 mM)，然后充分混合，补液至刻度线，混合并过滤。3. 总则.(a) 液体样品: 清澈的或稍有些颜色的，pH大约为中性的液体样品可以直接检测。(b) 酸性样品: 如果样品为> 0.1 mL的未被稀释的酸性样品（如葡萄酒或果汁），必须用2 M NaOH调节pH到大约7.4，然后在室温中孵育30分钟。(c) 含二氧化碳样品: 样品中含有大量的二氧化碳，如：啤酒，必须用2 M NaOH调节pH到大约7.4，并缓慢的用玻璃棒搅拌。(d) 有颜色的样品: 测试中附加样品空白，如：样品中不含有GK

16、，在这种情况下，样品必须附加样品空白。(e) 重颜色的样品: 如果未经稀释的样品颜色非常深，需要向每10mL的样品中加入0.2g聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），充分混合5分钟，然后用Whatman No. 1滤纸过滤。(f) 固体样品: 均质或粉碎固体样品，然后加入到蒸馏水中，并过滤。(g) 样品含有脂肪: 需要用超过脂肪沸点的水进行提取，如：将100mL容量瓶加热到60°C，然后恢复至室温，并补液至刻度线，放置冷藏箱中15-30分钟，过滤，弃去最初的几mL滤液，选择澄清的或稍有些乳白色的悬浮液进行测试。也可以选择使用Carrez 溶液进行澄清。(h) 样品中含有蛋白: 使用Carre

17、z 溶液去除样品中的蛋白。样品处理事例:(a) 测定葡萄酒中的甘油.通常情况下，测定白/红葡萄酒中的甘油含量都不需要对样品进行处理，只需要依照稀释表格进行稀释即可。如：按照1:20倍稀释0.1mL的样品。(b) 测定啤酒中的甘油含量.使用玻璃棒进行充分的搅拌，去除样品中的二氧化碳，然后进行稀释即可测定。如：按照1:5倍稀释0.1mL的样品。(c) 测定果汁和相关饮料中的甘油含量稀释样品中的甘油含量至少到0.35 g/L，澄清的、中性的样液可以直接进行测试，不需要进行特殊处理。浑浊的液体稀释前首先需要进行过滤。有颜色的样品溶液通常在稀释到适当的甘油浓度即可测定。然而，如果要测定不经稀释的样品液中

18、的甘油浓度，需要依照下列步骤进行脱色：用1 M NaOH调节25mL样品溶液的pH大约至7.4，然后用蒸馏水补液至50 mL，加入0.5g PVPP，充分搅拌5分钟，然后用Whatman No. 1滤纸过滤。使用澄清的或稍有些颜色的提取液进行测试。没有必要进一步稀释，可以直接进行测定。(d) 测定烟草制品中的甘油含量.将样品粉碎成大约0.2 mm的小颗粒，准确的称量1g样品，放入到100 mL容量瓶中，加入大约60 mL蒸馏水，用磁力搅拌器在20-25°C下充分搅拌1小时，然后用蒸馏水补液至刻度线，混合并过滤。移取25 mL滤液到50mL容量瓶中，继续加入5 mL Carrez I

19、溶液、5 mL Carrez II 溶液和10 mL NaOH溶液(100 mM)，每加一种溶液都要充分混合，然后补液至刻度线，混合并用Whatman GF/A玻璃纤维滤纸过滤，没有必要进一步稀释，可以直接进行测定。(e) 测定肥皂中的甘油含量.准确称取1 g粉碎的肥皂粉末，加入50mL 0.1M HCl ，用热磁力搅拌器充分搅拌至沸腾，将溶液转移至100 mL容量瓶中，然后添加30mL 0.1M HCl继续搅拌提取，待温度降至20-25°C后用蒸馏水补液至刻度线，将容量瓶放置于冷藏室15分钟，用Whatman GF/A玻璃纤维滤纸过滤，取25 mL滤液，加入2 mL 2 M Tris/HCl 缓冲液（pH 7.4，自备），用1M NaOH调解pH大约至7.4，补液至50 mL，直接对该溶液（或进一步稀释）进行测定。(f) 测定牙膏中的甘油含量.准确称取1 g牙膏样品，加入70 mL蒸馏水，在70°C下充分搅拌30分钟，然后离心( 3,000g 10分钟)，再次洗涤悬浮液中的小球2次加入50 mL蒸馏水，重复搅拌和离心步骤，补液至250 mL并过滤，可以按照1:3倍稀释0.1 mL滤液，进行测定。参考文献:1. Spinella, C. I. (1966). Modified enz