功能性低聚糖的制备

1、功能性 | 低聚 | 糖 | 制备功能性低聚糖(functional oligosaccharide) 是由 210个相同或不同的单糖，以糖苷键聚合而成；但不被人体胃酸、胃酶降解；不在小肠吸收，可到达大肠部位； 具有促进人体双岐杆菌的增殖等生理功能。这类低聚糖包括异麦芽糖、低聚果糖、低聚乳糖、棉子糖、低聚木糖、水苏糖、低聚壳多糖、低聚龙胆糖、低聚帕拉金糖、海藻糖等。现将主要的功能性低聚糖的生产介绍如下：一、低聚异麦芽糖低聚异麦芽糖(Isomaltooligosacharide ，简称 IMO) 是指葡萄糖基以a-1,6糖苷键结合而成单糖数在26 不等的一类低聚糖，其主要成份为异麦芽糖(Isom

2、altose) 、 潘糖 (Panose) 、 异麦芽三糖(Isomaltotriose) 及异麦芽四糖等。1. 制备方法低聚异麦芽糖制备大致有以下两种途径：一是利用糖化酶逆合作用，在高浓度葡萄糖溶液中将之逆合生成异麦芽糖、麦芽糖等低聚糖；但由于产率低，产物复杂， 生产周期长等缺点而难以工业化大量推广。二是以淀粉制得高浓度葡萄糖浆为底物，通过a-葡萄糖转甘酶催化发生a-葡萄糖基转移反应而得。工业化生 产低聚异麦芽糖一般以淀粉为原料采用全酶法工艺，技术以日本最为成熟。工艺流程淀粉- 调浆- 淀粉乳- 喷射液化(a-淀粉酶)-糖化(0 -淀粉酶，a -葡萄糖昔酶)-灭酶-过滤(硅藻土)-脱色活性炭

3、)- 脱盐(离子交换树脂)- MOW浆- 真空浓缩-MO-90糖粉IMO-50 (糖浆)-喷雾干燥-IMO-50糖粉柱分离-MO-90(糖浆)- 喷雾干燥-2. 工艺简介淀粉加水调制成30 %淀粉乳，调节pH 66.5,加耐高温a-淀粉酶、90 C 喷射液化液化至DE值为610,按1kg淀粉加B-淀粉酶和真菌a-葡萄糖甘转移 酶 2 4 g ，于 pH 5、 60 反应 72h ，反应完毕进行灭酶，用藻土助滤，滤清后活性碳脱色，再经阴阳树脂混合床离交脱盐，真空浓缩可以得到浓度50 %的糖浆，经喷雾干燥可得50 糖粉成品。真空干燥后如果上柱分离葡萄糖、麦芽糖可得到 90 糖浆，经真空干燥得90

4、粉糖。3. 实际操作注意事项(1) 要严格控制连续喷射液化工艺条件，既做到全部糊精化，又控制较低DE值。 确定底物浓度 选择液化温度和液化酶选择合适的pH值控制液化DE值(2) 要严格控制糖化和转苷等生产关健工序 选择合适糖化酶 a- 葡萄糖转苷酶固定化 探索糖化转苷同罐同时进行工艺条件(3) 利用先进的净化分离技术在净化分离技术方面，要推广树脂吸附脱色代替活性炭。采用微滤装置过滤糖浆， 以进一步提高产品纯度和卫生指标，应用纳滤分离技术使产品低聚异麦芽糖纯度90%。二、低聚龙胆糖低聚龙胆糖(Gentiooligosaccharide)是一类由葡萄糖以0-1,6糖甘键结合而成低聚糖，主要成分是龙

5、胆二糖、龙胆三糖和龙胆四糖。1. 制备方法低聚龙胆糖有多种制备方法，最早制取低聚龙胆糖是从龙胆属茎、根中提取，由于受原料等限制，使其难以大量生产。此外， 还原苦杏仁苯或从酸法水解淀粉副产物中提纯等都可制取低聚龙胆糖。但工业化生产低聚龙胆糖主要通过酶法生产，以高浓度葡萄糖为原料，先通过 B-葡萄糖甘酶转糖昔作用及缩合作用，合 成低聚龙胆糖混合物，再经分离精制便可制得不同规格低聚龙胆糖制品。工艺流程葡萄糖- 调浆-高浓度葡萄糖- 转昔(B -葡萄糖普酶)-灭酶-分离-脱色活性炭)-脱盐- 缩合-低聚龙胆糖混合物-分离-精制-产品2. 工艺简介配制葡萄糖溶液浓度、固形物含量宜分别大少70%、 40%

6、；调整反应液的pH4.57.5 ,加热物料温度在 4070C；加酶添加量应为0.2 U/mg原料。如在300 mg D -葡萄糖中添加5.8 X105 U精制纯酶液500m 1葡萄糖含量约为60 % ,在pH 5.0、60C反应48h后，将反应混合液在100 C加热3min终止反应，3500 r/ min 离心20min,取上清液，酶反应后既可用碳柱、阳离子交换树脂色谱柱等柱分离方法提纯出低聚龙胆糖，也可采用膜分离、晶析法等方法将葡萄糖去除。如上述酶反应液用水稀释40%后，经活性炭脱色、离子交换树脂脱盐后，蒸发浓缩到固形物含量80%£右，然后加入0.5%葡萄糖晶体，置于容积为1L的夹

7、套搅拌式晶析装置中，将温度从45缓慢降至20，以析出葡萄糖晶体，最后在篮式离心分离器 ( 80 孔目滤布 ) 分离出晶体。或可以将反应液稀释至40%，经活性碳脱色、离子交换树脂脱盐，蒸发浓缩至含固形物含量60%左右后，在75 下通过内径为 2cm ，长度为120 cm 的填充了阳离子交换树脂Dawex99的柱子中，然后收集得到低聚龙胆糖组分。三、低聚果糖低聚果糖（Fructooligsacchride ,简称FOS）!指在蔗糖分子果糖残基上通过 B （1-2）糖昔键连接1-3个果糖基而成蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合 物。工业生产产品有低聚果糖 G （纯度为55%-65%和低聚果糖P （

8、纯度为96%）, 低聚果糖P是低聚果糖G进一步精制而成。1 .制备方法目前工业生产低聚果糖方法主要有两种：一是以菊芋为原料提取菊粉，再经 酶水解而得。第二种方法是以蔗糖为原料，采用固定化酶法进行连续反应，将高 浓度蔗糖溶液在5060C下以一定速率流过固定化酶柱，利用B-果糖转移酶进行一系列转移反应而获得低聚果糖。该法连续性好、自动化程度高，操作稳定性好，酶能反复使用，利用率高。固定化酶生产工艺流程蔗糖固定化酶柱或固定化床生物反应器.一A糖液灭活脱色（活性炭）酶液脱盐（离子交换树脂）真空浓缩产品。2 .工艺简介现在蔗果低聚糖的工业制造过程则包括酶的发酵生产，酶或菌体固定化及蔗果低聚糖的生产三部分

9、，用生产菌经24天通气搅拌培养，以生产含有果糖转移 活性的发酵液或菌体，再加以固定化处理，将固定化生物酶装入固定化管柱或流化床生物反应器中，通以50%60嘴糖溶液（每千克基质加入25个酶活力单 位），于5060 C下反应24h,即可得到含FOS的55 %60嘛液。若将生成之 产物再脱色、脱盐及浓缩后，可得到固形物含量75 %的液体糖浆，其中的FOS含量占固形物55%若再进一步分离与控制，可得到 FOS占固形物95%勺液体、 粉末状或颗粒产品。四、异麦芽酮糖异麦芽酮糖（Isomaltulose）,亦称帕拉金糖（Palatinose ）,化学名为 6-O -a -D -叱喃葡糖基-D-果糖，是蔗糖

10、经a-葡萄糖基转移酶作用，85%乂 上蔗糖转化成异麦芽酮糖，另外也有少量 1-O-a-D-葡糖基-D-果糖、异麦芽糖、 异松三糖、果糖和葡萄糖生成。1 .制备方法某些菌株内a-葡萄糖基转移酶作用于蔗糖，可使蔗糖上a-1,2糖昔键转移变 为a-1,6键而生成异麦芽酮糖。工业上选择使用精脱杆菌酶，采用固定化 a-葡 萄糖基转移酶柱式反应器进行连续化生产。工艺流程精皖杆菌发酵液离心分离菌体细胞固定化酶固定化酶柱 转化液离子交换真空蒸发浓缩冷却结晶离心分离异麦芽酮糖2 . 工艺简介将处理好的固定化细胞置于填充柱内，连续流加50%左右的蔗糖溶液（最佳55 %），通过调整流速，最终转化率能达到90 %以上

11、。通常，在固定化过程中一般选择海藻酸钠作为包埋材料，细胞包埋量约为20 %, CaCb作为交联剂；相比于其他材料，利用海藻酸钠包埋稳定性更好，更具有可操作性且成本更低，并且在固定化过程中，蔗糖异构酶的活力不受CaC2的浓度以及固定化所用时间的影响。但是在实际操作过程中，凝胶网格大，强度不够，固定化颗粒易破碎，随着批次转化，大部分细胞会流失，从而造成酶的活性下降，固定化酶的半衰期较短。目前从酶转化液中提取异麦芽酮糖的主要步骤是：旋转蒸发酶转化液质量浓度至 60 %左右，搅拌使其冷却，得到白色的晶体。在实际操作中，可以在已冷却的溶液中加入少量的异麦芽酮糖晶种，促使结晶速度加快。五、偶联糖偶联糖 （

12、Clycosylsucrose） 又叫葡萄糖基蔗糖，由蔗糖分子葡萄糖基上以 a-1,4 糖苷键结合1 至数个葡萄糖基所成低聚糖。1. 制备方法工艺流程淀粉十蔗糖环糊精溶液环糊精萄糖基转移酶糖混合液灭酶浓缩过滤脱色离子交换分馏结晶分离葡萄糖基蔗糖。2. 工艺简介先将淀粉水解生成葡萄糖、麦芽糖，再用淀粉水解液与蔗糖混合物培养环糊精葡聚糖转移酶，在酶催化作用下，葡萄糖基转移至蔗糖分子葡萄糖基上，葡萄糖基彼此以a-1,4 糖苷键相连，最后将反应生成混合物脱色、脱盐、 浓缩成为糖浆。六、低聚乳果糖低聚乳果糖是由B -D-半乳糖甘，a-D-葡萄糖甘，B -D-K味喃果糖甘残基组成。低聚乳果糖甜味特性类似于

13、蔗糖，甜度为蔗糖30%，商品低聚乳果糖由于含有蔗糖、乳糖等，甜度要高些。1. 制备方法低聚乳果糖（Lactosucrose ,简称LS）可采用两种途径合成。一是利用半乳糖 甘转移酶将乳糖分解产生B-半乳糖基转移至蔗糖中葡萄糖 Q羟基上，如 Sporoboromyces菌和Rahnella菌产生某些酶类。二是以乳糖和蔗糖（1： 1）为原 料，在节杆菌产生果糖基转移酶 B-味喃果糖甘酶作用下，将蔗糖分解产生果糖 基转移到乳糖还原性末端C1 位羟基上，生成半乳糖基蔗糖，即低聚乳果糖。适合酶类有纳豆芽孢杆菌( Bacillus natto )果聚糖蔗糖酶(levansucrase )和节杆菌(Arth

14、robacter sp.K-1 ) 0-味喃果糖甘酶(0-ftuctofuransidase) 。工业上主要以节杆菌B-味喃果糖甘酶生产低聚乳果糖。工艺流程过滤脱盐 ( 离子交换树脂) 分过滤冷冻干燥产品。蔗糖和乳糖混合液酶反应灭酶和活性炭脱色级 ( 碳柱 ) 活性炭脱色脱盐 ( 离子交换树脂)2. 工艺说明反应中蔗糖和乳糖比例一般为1: 1，增加乳糖和蔗糖的比例，虽然乳糖的转化率增加，但每克底物的低聚乳果糖产量下降，最适宜的糖浓度为30%40%，糖浓度继续增加，低聚乳果糖的产量反而下降，这是由于酶量一定，底物浓度增加，酶的有效浓度降低，培养液经过纯化，将酶源添加至原料中，由 B-味喃果糖苷酶

15、既具有合成低聚乳果糖能力，也能水解蔗糖和低聚乳果糖，所以一般情况最适宜的酶添加量为0.5ml 。 反应最适温度一般为4050。温度继续升高，产物含量下降，说明酶转移活力的适宜温度在此温度范围内，超过50酶的水解活力仍比较稳定，但转移活力下降。最适 pH5.86.0。这与该酶在此pH下的稳定性有关系，在将纯化的酶液与1: 1 的蔗糖和乳糖反应，在最适宜的pH 和温度下， 反应 12h 产物浓度最高，继续反应低聚乳果糖的含量也呈平稳下降趋势。控制乳糖和蔗糖质量比，可生产出形态不同产品；如LS-55 P 其蔗糖与乳糖之比为55: 45 ，而 LS-55 L 产品蔗糖与乳糖之比为45: 55 。七、低

16、聚半乳糖低聚半乳糖(Galactooligosaccharide,简称GO§是大量存在于动物乳汁和乳清中一组功能性低聚糖，是一种具有天然属性低聚糖。低聚半乳糖是在乳糖分子中半乳糖一侧以B(1-3)、B(1-4)、B (1-6)糖昔键连接1 4个分子半乳糖 形成结合糖。1. 制备方法低聚半乳糖是日本Yakult 公司首先开发并用于食品。低聚半乳糖生产方法主要有酶法、发酵法和化学法。工业生产中常以高浓度乳糖作原料，用 B-半乳糖苷酶催化乳糖水解，同时将催化水解出一个半乳糖残基或葡萄糖残基转移到另一个乳糖或葡萄糖或半乳糖分子上而得产品。乳糖溶液-转移反应(B-半乳糖普酶)-脱盐(离子交换树

17、脂)-色谱分离-脱色(活性炭)-真空浓 缩产品。2. 工艺说明 非固定化酶合成低聚半乳糖以高浓度的乳糖为基料，在具有转糖基活性的B-半乳糖甘酶的作用下，乳糖首先被水解成半乳糖和葡萄糖，半乳糖然后被转移到乳糖的半乳糖基上。自然界中的许多细菌和霉菌都可产生B-半乳糖甘酶。 通过这种方法制得的低聚半乳糖一般是在乳糖的半乳糖基一侧结合14个分子的半乳糖混合物。此法糖基供体为寡糖，价格便宜。酶来源丰富，性质稳定。充分体现了酶法大量合成低聚糖的实用性。 固定化酶合成将B-半乳糖甘酶以交联、吸附或包埋的方式固定在一定载体上制成固定化酶。固定化酶催化合成低聚糖的能力优于游离酶，原因是固定化酶结构牢固，热稳定性

18、增加，可批次反应，产物易于分离。同时，将酶固定在非水溶性的载体上，形成了一定立体障碍，与乳糖相比，低聚糖分子较大，不易与酶结合，生成的低聚糖不易被酶作用而降解。八、乳酮糖乳酮糖(Lactulose )学名口比喃半乳糖-果糖，是半乳糖与果糖通过0-1,4糖 苷键结合双糖。其甜度仅为蔗糖48%60%，且带有清凉醇和感觉。1. 制备方法工艺流程乳糖-碱液处理-异构化乳糖-去离子-脱色-浓缩-沉淀-产品2. 工艺说明一般采用碱液处理乳糖异构化。乳糖在碱性溶液中，加热处理使乳糖分子葡萄糖部分异构化，生成异构化乳糖，然后将溶液用离子交换树脂去离子、脱色、浓缩，并使未反应乳糖析出沉淀，其上清液即为异构化乳糖

19、糖浆。此外，也可用B-半乳糖甘酶进行酶法异构化制取乳酮糖；或以 1; 1蔗糖与乳糖为原料，经酶 转化而成乳果糖。九、低聚木糖低聚木糖(Xylooligosaccharides,简称 XO)H由 27 个木糖以 0-(1-4)糖苷键结合而构成低聚糖，其中以二糖和三糖为主。1. 制备方法生产低聚木糖方法：原料是从玉米芯中提取多聚木糖，由木聚糖酶控制多聚木糖水解，采用超滤和反渗透除去大分子和小分子糖，制取高纯度低聚木糖。关键技术在于水解过程：以里氏木霉(Trichoderma 了 reesei Rut C30) 为菌种，采用改进的Mandels 配方能合成酶活力高达25.5 IU/mL 的木聚糖酶，

20、产酶周期3d。在酶用量1%温度50c的条件下，酶解35g/L的纯木聚糖410h,可获得 74.08 %87.89 %的低聚糖，此时低聚糖与木糖之比为16.76 12.30 。2. 工艺说明 菌种 以美国菌种保藏中心的里氏木霉(Trichoder ma reesei Rut C30)优良突变株为菌种，将其接种到马铃薯- 木糖 -琼脂斜面上，在30 下恒温培养68d,抱子成熟后，4c冰箱中保存备用。液体种子培养 按改进的Mandels培养液配方配好菌丝体培养液，在 121条件下灭菌30min。 冷却后接入新鲜试管斜面孢子，在 30，150175 r/min的恒温振荡器上培养2d。 木聚糖酶的制备按

21、改进的Mandels营养液配方配好产酶培养基，灭菌,冷却至室温后，接入10 %的液体菌种，在150175 r/min ， pH 4.8， 28301条件下培养3d。产酶过程中定期取样，离心除去残渣，所得清液即为木聚糖酶液。纯木聚糖的制备 将无抽提物、颗粒直径为3 mm右的玉米芯原料，用亚氯酸钠法制得综纤维素。取综纤维素200 g ，加入 5 %氢氧化钠溶液2 L ，在氮气流的保护下，室温抽提8 h 。过滤，滤出的原料渣再按上述方法重复抽提2次。合并所有的滤液，用盐酸中和至pH 6.0。倾入 4倍体积的乙醇溶液，离心，白色沉淀先用95%乙醇洗涤3 次，再用无水乙醇洗涤2 次，离心后得到的产物风干备用。木聚糖定向酶水解将一定量的底物和酶液在pH4.8,温度50 C,转速80120 r/min的条件下反应212h。酶解结束后，将酶失活，冷却，离心，上层 清液供HPLS析和总还原糖的测定。 木低聚糖的层析分离称取一定量的聚丙烯酰胺(Bio-GelP-4) 缓缓到入缓冲溶液中，润胀、漂洗、脱气后装入 55cmx 7.5cm的层析柱中。吸取一定体积的样品小心铺在柱的上端，用蠕动泵输送洗脱液，用超级恒温水浴槽维持柱温，洗脱液的收集采用部分自动收集器。十、水苏糖水苏糖(Sta