DNA重组技术的基本过程PPT课件

1、 第一章 DNA重组技术了克隆羊、猪等等的技术，可以复制一个生命了克隆羊、猪等等的技术，可以复制一个生命体。（克隆羊多利体。（克隆羊多利19972003，体细胞克隆，胚，体细胞克隆，胚胎细胞克隆）胎细胞克隆）PscloltetrRb-3nersrtetrner tetr nerOtetrnerCohen Group第一次实现了细菌遗传性状转移示意图第一次实现了细菌遗传性状转移示意图技成果取代原有一代科技成果。融合是非线性的，技成果取代原有一代科技成果。融合是非线性的，即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品，即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品，造成革命性市场，它们是互补和合作的结果。造成

2、革命性市场，它们是互补和合作的结果。一个杂合一个杂合DNA分子分子(DNA分子重组体分子重组体)，然后导，然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计设计,得到一定的设计方案，故称为基因工程。得到一定的设计方案，故称为基因工程。由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。子克隆。Paul Berg SV40 phage“多利多利”羊诞生的技术路羊诞生的技术路线线维尔穆特和克隆羊维尔穆特和克隆羊“多利多利”在一在一起起克隆羊克隆羊“多利多利”用克隆技术复制人类的假想图用克隆技术复制人类的假想图3. 20世纪

3、世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式：年代，确定了遗传信息的传递方式：DNARNAPr,破译了全部遗传密码，破译了全部遗传密码，43。 以上理论和技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。（2）作为动词，是）作为动词，是“去克隆去克隆”，即利用体外，即利用体外DNA重组技术将一个特定的基因或重组技术将一个特定的基因或DNA顺序插顺序插入一个载体分子。入一个载体分子。DNA重组；重组；DNA体外诱变；体外诱变；体外基因操作；体外基因操作； 基因化学合成基因化学合成基因工程基因工程Enzymes1.限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（

4、Restriction endonuclease） 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分分子中的某种特定核苷酸序列（子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处），并由此处切割切割DNA双链的核酸内切酶。来源于原核生物，属双链的核酸内切酶。来源于原核生物，属于核酸内切酶，即在核酸分子链的内部制造切口的于核酸内切酶，即在核酸分子链的内部制造切口的酶。酶。 1.1限制与修饰现象限制与修饰现象 细菌的限制和修饰系统（细菌的限制和修饰系统（R/M体系），是细菌体系），是细菌的一种自我保护作用。的一种自我保护作用。限制性内切酶将侵入细菌体内的外源限制性内切酶将侵

5、入细菌体内的外源DNA切成小片断切成小片断 细菌自身的细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。身的限制性内切酶识别切割。 Dam甲基化酶：甲基化酶： GATC 腺嘌呤腺嘌呤N6位置引入甲基位置引入甲基 Dcm甲基化酶：甲基化酶： CCAGG或或CCTGG序列在第二个序列在第二个C上上C5位置上位置上引入甲基引入甲基EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC（3）作用机理：需）作用机理：需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。（2）切割位点：在距离特异性识别位点约）切

6、割位点：在距离特异性识别位点约10001500 bp处随处随机切开一条单链。机切开一条单链。Recognize sitecut1-1.5kb1.2.2 II类限制性内切酶类限制性内切酶 首先由首先由H.O. Smith和和K.W. Wilcox在在1970年从流感嗜血菌中分年从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是离出来。分离的第一个酶是Hind 。 （1）识别位点序列：未甲基化修饰的双链）识别位点序列：未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列上的特殊靶序列（多数是回文序列），与（多数是回文序列），与DNA的来源无关。的来源无关。（2）切割位点：识别位点处。切开双链）切割位点：识别位点处。切开双

7、链DNA，形成粘性末端，形成粘性末端（sticky end）或平末端（）或平末端（blunt end）。）。GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 5端凸出（如端凸出（如EcoR I切点）切点）CTGCAG GACGTC 5-3 3-5 5-3 3-5 CTGCA G G ACGTC （4）粘性末端的意义）粘性末端的意义连接便利连接便利i）不同的）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接，这比连接双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接，这比连接两个平齐末端容易的多。两个平齐末端容易的多。ii）同一个）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的

8、粘性末端可以连接成环分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。形分子。 5末端标记：凸出的末端标记：凸出的5末端可用末端可用DNA多核苷酸激酶进行多核苷酸激酶进行32P标记。标记。凸出的凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或或TTT等）造成人工粘性末端。等）造成人工粘性末端。 补平成平齐末端：粘性末端可以用补平成平齐末端：粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。聚合酶补平成平齐末端。（5）同裂酶（）同裂酶（Isoschizomers)：识别位点的序列相同的限制性内切酶。：识别位点的序列相同的限制性内切酶。

9、完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如Hind 和和Hsu I。Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。如不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和和 Sma I。（6）同尾酶）同尾酶(Isocaudamers）：识别的序列不同，但能切出相同的）：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等。等。 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 BamH IBcl I5-TGATCA

10、-3 3-ACTAGT-5 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5 Bgl 5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5 Xho U代表嘌呤；代表嘌呤；Y代表嘧啶。代表嘧啶。5-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。？5-G 3-CCTAG GATCT-3 A-5 BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5 BamH IBgl Sau 3A 星号（星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割）活性：如果改变反应条件就会影响酶的

11、专一性和切割效率，称为星号（效率，称为星号（*）活性。）活性。 EcoR I和和BamH I等都有等都有*活性。活性。在低盐、高在低盐、高pH（8）时可识别和切割）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等EcoR I： GAATTC（8）s型限制性内切酶型限制性内切酶 移动切割（移动切割（shifted cleavage)：在离它的不对称识别位：在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割点一侧的特定距离处切割DNA双链。长度为双链。长度为 4-7bp ，切割位，切割位点可能在识别位点一侧的点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。范围内。 GACGCNNNNN Hga ICT

12、GCGNNNNNNNNNN 5 3 1.3 III类限制性内切酶类限制性内切酶 在完全肯定的位点切割在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要，但反应需要ATP、 Mg2+和和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。它们的腺苷蛋氨酸）。它们的识别位点分别是识别位点分别是 AGACC 和和 CAGCAG ，切割位，切割位点则在下游点则在下游 24-26bp 处。在基因工程操作中用途处。在基因工程操作中用途不大。不大。EcoP1: AGACCEcoP15: CAGCAG2. DNA连接酶连接酶2.1 DNA连接酶（连接酶（ligase)的发现的发现 从细菌从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能环化现象推测，必定存

13、在一种能把两条把两条DNA双链连接到一起的酶。双链连接到一起的酶。DNADNA复制一定有断口，断口一定由酶连接复制一定有断口，断口一定由酶连接3. DNA聚合酶聚合酶3.1 基因工程中常用的基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶3.1.1 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 3.1.2 Klenow fragment 3.1.3 T7 DNA聚合酶聚合酶 3.1.4 T4 DNA聚合酶聚合酶 3.1.5 修饰过的修饰过的T7 DNA聚合酶聚合酶 3.1.6 逆转录酶逆转录酶3.2常用的常用的DNA聚合酶的特点聚合酶的特点3.2.1共同特点共同特点 把把dNTPs连续地加到引物的连续地加到引物的3O

14、H端。端。3.2.2 主要区别主要区别 持续合成能力和外切酶活性不同。持续合成能力和外切酶活性不同。 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板而不从模板上掉下来。上掉下来。 其它几种其它几种DNA聚合酶只能连续添加聚合酶只能连续添加10多个多个dNTPs就会就会从模板上解离下来。从模板上解离下来。DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA二、载体的分类二、载体的分类（三）容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细（三）容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分

15、离纯化出来。胞中分离纯化出来。必需有强大的能够被宿主细胞识别的启动子，为必需有强大的能够被宿主细胞识别的启动子，为了实现翻译，克隆基因必需有合适的了实现翻译，克隆基因必需有合适的SD序列和序列和RBS。这样一个基因表达需要的具有表达和调控。这样一个基因表达需要的具有表达和调控能力的载体称表达载体。能力的载体称表达载体。大阵容大阵容”。Pvu（二）载体的制备（二）载体的制备（三）载体的获取（三）载体的获取4.化学合成法：制备基因片段用化学合成法：制备基因片段用DNA合成仪，对目的基合成仪，对目的基因分段合成，连接，可以得到所需的目的基因。因分段合成，连接，可以得到所需的目的基因。限制酶剪切或机械

16、剪切目的基因或载体可以限制酶剪切或机械剪切目的基因或载体可以产生粘端和平端的产生粘端和平端的DNA分子。催化二者重组连接分子。催化二者重组连接（粘端或平端）反应的酶常用（粘端或平端）反应的酶常用T4DNA ligase。（三）转化和转染（三）转化和转染（transformation/transfection）rDNA导入原核细胞的过程称转化，导入真导入原核细胞的过程称转化，导入真核称转染。核称转染。基因的克隆载体基因的克隆载体（三）（三） 杂交筛选杂交筛选（四）质粒小量快速提取加酶切鉴定（四）质粒小量快速提取加酶切鉴定 乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖。乳糖类似物异丙基-D -硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。 LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物(5-