粪大肠菌群检测方法20110520

1、粪大肠菌群的测定（多管发醉法）1、 检测限2、 试剂（均为分析纯）1、配制单倍乳糖蛋白脐培养液（1份量）（因有固体培养基，以下配置方法仅做参考）单倍乳糖蛋白陈培养7成分：蛋白豚10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溟甲酚紫乙醇溶液1mL、碳酸钠10.6g。1.6%溟甲酚紫乙醇溶液（1mL）:称取溟甲酚紫1.6g倒入小烧杯，用少量95%乙醇溶解，移至100mL容量瓶,用95%乙醇多次洗小烧杯，洗液移入容量瓶，最后用95%乙醇定容至100mL,摇匀备用。（滤纸、100mL小烧杯2只、100mL容量瓶1只、95%乙醇、玻璃棒、药匙、天平、滴管、溟甲酚紫）碳酸钠（10.6g）:称取10.

2、6g碳酸钠溶于蒸储水，并定容到100mL。（100mL容量瓶1个、100mL小烧杯2只、碳酸钠）将单倍乳糖蛋白陈培养液成分蛋白豚10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g加热溶解于1000mL蒸储水中，调节pH为7.27.4（用10%碳酸钠调节），再加入1.6%溟甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管（10mL左右）中，于高压蒸汽灭菌器中，在115C灭菌20min,贮存于暗处备用（冰箱中可存放3个月）。（>1L锥形瓶1只、1mL移液管1根、pH计、电炉、倒置的小玻璃管的试管60套（小i管（12x150mm）+小套管（杜氏小管）（约6mmx36mm）、高压蒸汽灭菌器

3、、试管架（10只入）、纱布和棉花）2、三倍配制单倍乳糖蛋白陈培养液：制法同上，除蒸储水外，其余配方比例三倍。3、EC培养液（1份量）将EC培养液所需成分胰豚20g、乳糖5g、胆盐三号1.5g、磷酸氢二钾（K2HPO4）4g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g、氯化钠5g,加热溶解于1L烧杯中，然后分装于含有玻壬8倒管的试管中。用10%Na2CO3调节pH以防止培养基灭菌后pH上升0.2左右（确定值需要前期在实验室寻找规律）。再将分装试管置高压蒸汽灭菌器中，115C灭菌20min。灭菌后pH应为6.9。（>1L烧杯1只）在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30C的暗处，存

4、放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养基颜色变化，或体积明显变化时废弃不用。三、耗材和仪器1、仪器：高压蒸汽灭菌器、生化培养箱（恒温箱）（25-44C）、无菌操作台、天平2耗材：倒置的小玻璃管的试管70套（小试管（12x150mm）+小套管（杜氏小管）（约6mmx36mm）;与小试管配套的棉塞或纱布和棉花；药匙、电炉、3mm接种环3根、吸耳球、牛皮纸、酒精灯1个、火柴、镣子2个、笔、试管架、滤纸（1盒）、1mL及10mL移液管各2支三、实验步骤1、水样接种量将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管（平行

5、）。使用的水样量可参考下表。水样种类检测方法接种量（ml）100501010.1-210-310-410-510井水多管发酵法XXX河水、塘水多管发酵法XXX湖水、塘水多管发酵法XXX城巾原污水多管发酵法XXX（如接种体积为10mL,则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白月东培养液5mL;如接种量为1ml或少于1mL,则可接种于普通浓度的乳糖蛋白陈培养液10mL中）2、初发酵试验将水样分别接种到盛有乳糖蛋白月东培养液的发酵管（含有玻璃倒管的试管）中（取原水样1mL,加如到9mL无菌生理盐水中混匀。这时候得到白稀释液1mL就相当与0.1mL,再按这个方法再稀释一次，就可以得到1mL相当于0.01ml的稀

6、释液了。这时彳H取1mL加入发酵管中即可）。在37CS.5c下培养24hi2h（箱内温度一定要达到所要求的温度（37.50t5C）时，方可放入，下同）。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。（培养液中加入澳甲酚紫作为酸度指示剂，细菌产酸后，培养液即由原来的紫色变成黄色。）产酸产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。（需20支同规格试管）记录：初发酵阳性管数5个接种量为1mL管5个接种量为0.1mL管5个接种量为0.01mL管阳性管数3、复发酵试验轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒（2-3环）将培养物转接到EC培养液中。在44.5C&#

7、177;0.5C下培养24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面，提高培养温度可造成不利于来自自然环境的大肠菌群的生长）。接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为菌群阳性。记录：复发酵阳性管数由接种量为1mL管转接由接种量为0.1mL管转接由接种量为0.01mL管转接阳性管数Ps:接种过程（亦有参考视频可供学习）接种前的准备工作。a.检查接种工具，进行环境消毒。b.在欲接种的培养基试管上贴好标签，标上接种的菌名、操作者、接种日期等。c.将培养基、接种工具和其他用品全部放在实验台上摆好，进行环境消毒。接种方法接种方法：斜面接种将菌种试管与待

8、接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。置试管口于酒精火焰附近。将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后再放入有菌试管内，在管壁上停留片刻待其冷却。取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。重新塞上棉塞。烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。4、计算（参考HJ/T347-2007）其他问题：1、样品的保存：采样用的容器使用前应盖好瓶盖，用牛皮纸将瓶盖和瓶颈处包裹好，置干燥箱160C-170c干热灭菌2h,或用高压蒸汽灭菌器121c灭菌15min。采样后水样的正确保存也很重要，如保存不当可使样品中的大肠