基因表达沉默技术PPT课件

1、1药学系药物基因组学教研室药学系药物基因组学教研室2010.06.18 2010.06.18 基因表达沉默技术基因表达沉默技术2教学内容及要求1234反义核酸技术反义核酸技术核酶技术核酶技术基因敲除技术基因敲除技术RNA干扰干扰 技术技术 重点重点 熟悉熟悉3参考资料 基因工程及其分子生物学基础基因工程及其分子生物学基础- -基因基因工程分册工程分册，北京大学出版社，静国，北京大学出版社，静国忠编忠编 自备材料（个人实践经验）自备材料（个人实践经验）4第一节第一节 RNA干扰干扰技术技术5基本概念 掌握掌握 RNA RNA 干扰干扰 (RNA interference, RNAi):(RNA

2、interference, RNAi):由由小双链小双链RNARNA诱发的、同源诱发的、同源mRNAmRNA高效特异性降高效特异性降解的现象解的现象。小干扰小干扰RNA: RNA: 具有干扰功能的这种短双链具有干扰功能的这种短双链RNARNA就称为小干扰就称为小干扰RNARNA（Small interfering Small interfering RNA,siRNA)RNA,siRNA)。6注射注射sense秀丽线虫秀丽线虫antisense注射注射1995年年 发现历史7反义反义RNA(antisense RNA)对基因抑制效应比较微弱；对基因抑制效应比较微弱；而双链而双链RNA（dsRN

3、A）能够高效特异性阻断靶基因的）能够高效特异性阻断靶基因的表达。表达。 1998年年8 Craig C. Mello克雷格梅洛Andrew Z. Fire安德鲁安德鲁菲尔菲尔2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine9随后陆续发现随后陆续发现RNAiRNAi也存在于水稻、烟草、果也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。RNAi现象的普遍性10靶靶RNAi 机制siRNA在在ATP参与下形参与下形成成RISC复合体，被复合体，被RNA解旋酶解旋成单链，并解旋酶解旋成单链，并由其中的反义链指导移由其中的

4、反义链指导移至靶至靶mRNA，靶，靶mRNA被切割后诱发宿主细胞被切割后诱发宿主细胞针对这些针对这些mRNA的降解的降解反应。反应。外源长外源长dsRNA在在ATP作作用下被用下被RNase Dicer切切割成割成21nt左右、由正义左右、由正义和反义链组成的和反义链组成的siRNA重点重点11siRNA19 bp duplex2 nt 3 overhangs21 nt siRNA实验设计难点难点121 1）靶序列的调出）靶序列的调出National Center forBiotechnology Information 1314152 2）

5、利用免费设计软件进行）利用免费设计软件进行siRNAsiRNA设计设计InvitrogenTakaraOligoegine 16软件软件的选择的选择原则原则1 1、选择可读框内、翻译起始位点之后、选择可读框内、翻译起始位点之后5050100nt100nt的序列作为靶序列；的序列作为靶序列；2 2、选择的靶位、选择的靶位5 5端之前的两个碱基为端之前的两个碱基为AAAA；3 3、GCGC含量控制在含量控制在35%35%65%,65%,最好最好50%50%左右；左右；4 4、碱基数目控制在、碱基数目控制在191921nt21nt；5 5、避免连续、避免连续3 3个或个或3 3个以上的相同碱基；个以

6、上的相同碱基；6 6、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构；、避免重复序列或回文结构以免形成发夹状结构；7 7、靶序列同数据库进行、靶序列同数据库进行BLASTBLAST同源性比对。同源性比对。17我用的软件：我用的软件：siDirectsiDirect183 3）siRNAsiRNA合成或表达合成或表达RNARNA聚合酶聚合酶启动子（包括启动子（包括U6U6或或H1H1）：）：转录起始点明确；转录起始点明确；转录生成小转录生成小RNARNA；转录产物无转录产物无polyApolyA尾；尾；转录终止为转录终止为5 5个连续的个连续的U U。192021223 mg/ml 正向引物 1 l3

7、 mg/ml 反向引物 1 l90C 4 min70C 10 min室温 订购合成的引物序列退火订购合成的引物序列退火 234) siRNA working?24mRNA:Real-time PCRmRNA:Real-time PCR Protein: Western blot Protein: Western blot17siRNA Mock 17siRNA Mock 255)5)合成合成oror构建载体？构建载体？A.A.化学合成化学合成siRNAsiRNA： 瞬时转染瞬时转染 实验花费高实验花费高 使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（使用的时候，要用二乙基焦碳酸酯（DEPCDEPC）处理过的

8、灭）处理过的灭菌蒸馏水溶解，这是因为菌蒸馏水溶解，这是因为siRNAsiRNA易被易被RNARNA酶降解。酶降解。B.B.载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达载体：为了长期观察基因沉默后的影响，需要长期表达siRNAsiRNA。C. C. 载体选择：易转染的细胞用质粒载体，难转染的细胞载体选择：易转染的细胞用质粒载体，难转染的细胞用逆转录载体或慢病毒载体。用逆转录载体或慢病毒载体。266 6）体外导入细胞）体外导入细胞a.a.脂质体转染：脂质体转染：具体操作步骤：具体操作步骤：按照脂质体说明书进行按照脂质体说明书进行27b.b.电穿孔导入：电穿孔导入：28c.c.病毒感染（以腺病毒

9、为例）：病毒感染（以腺病毒为例）：2930第二节第二节 反义核酸技术反义核酸技术3119781978年，年，Stephenson Stephenson 和和ZamecnikZamecnik首次报道了首次报道了反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒反义寡脱氧核苷酸可抑制劳斯肉瘤病毒RSVRSV的的复制现象。复制现象。1984 1984 年，年，Izant weintraubIzant weintraub提出了提出了“反义核反义核酸技术酸技术”的概念。的概念。Inhibition of Rous sarcoma viralRNA translation by a specific oligodeoxy

10、ribonucleotide. Proc Natl Acad Sci USA , 1978 ;75 : 285 - 288.历史由来32 反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序反义寡核苷酸概念：正义链互补的一段核苷酸序列，包括反义列，包括反义DNADNA和反义和反义RNARNA。基本概念反义反义RNA技术技术反义反义DNA技术技术33反义抑制的主要机理直接作用于靶直接作用于靶mRNA的的SD序列或部分编码区，直序列或部分编码区，直接抑制翻译，或与靶接抑制翻译，或与靶mRNA结合形成双链结合形成双链RNA，从而易被从而易被RNA酶酶H降解。降解。反义反义核酸核酸mRNARNase H34论著

11、超过篇。论著超过篇。基因功能研究（基因功能研究（ 19941994年流行）年流行） 如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。如抗病毒或抗肿瘤基因治疗研究等领域。反义核酸应用反义核酸应用3519981998年年8 8月月2727日，美国食品药品管理局（日，美国食品药品管理局（FDAFDA）正）正式批准了由式批准了由ISISISIS公司开发的全球第一个反义药物公司开发的全球第一个反义药物“VitraveneVitravene” （福米韦生，（福米韦生，fomivirsenfomivirsen）在美国）在美国上市。上市。该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的该药抗病毒作用较强，是更昔洛韦的10001000倍，

12、用倍，用于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨于治疗巨细胞病毒性视网膜炎和艾滋病人并发巨细胞视网膜炎细胞视网膜炎, ,有效率高达有效率高达80%-90%80%-90%。VitraveneVitravene为注射剂，患者每月只需注射一次药物为注射剂，患者每月只需注射一次药物（利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应（利用专用针头直接注射进眼球内），不良反应有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为有虹膜炎、玻璃体炎，发生率为2525，用糖皮质，用糖皮质激素治疗可缓解或消除其炎性反应。激素治疗可缓解或消除其炎性反应。2 2个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成个硫代磷酸酯寡聚脱氧核苷酸组成 36a.避免内源性核酸酶

13、对其降解b.提高自身稳定性以及与靶分子的亲和力Hdeoxyribose提高有效性提高有效性技术难点技术难点37第一代硫代修饰（第一代硫代修饰（Phosphorothioate）Resisting To Nucleases；Activating RNase H pathwaysO38第二代修饰第二代修饰(2-O-methyl,2-O-methoxyethyl)Resisting To Nucleases；not activating RNase H pathways392001 2001 主要用于治疗老年人中十分常见的视网膜黄斑退化症主要用于治疗老年人中十分常见的视网膜黄斑退化症 Macugen

14、 哌加他尼40 2003 2003 新一代抗新一代抗HIVHIV新药，属于病毒的融合阻止剂类药物新药，属于病毒的融合阻止剂类药物 Fuzeon 41Tysabri 2004 2004 专治多发性硬化症专治多发性硬化症 4243第三节第三节 核酶技术核酶技术44核酶（核酶（ribozymeribozyme） ribonucleic acid enzyme ribonucleic acid enzyme 具有催化活性的具有催化活性的RNARNA，化学本质是，化学本质是RNA,RNA,却却具有酶的催化功能。具有酶的催化功能。基本概念基本概念45切赫切赫(T.R.Cech)(T.R.Cech)（194

15、7-1947-），美国人），美国人, , 他独立地发现发现四膜虫转录他独立地发现发现四膜虫转录产物产物rRNArRNA前体，可切除自身的前体，可切除自身的413413个核苷酸的内含子，使两个个核苷酸的内含子，使两个外显子拼接起来，变成成熟的外显子拼接起来，变成成熟的rRNArRNA分子。分子。历史由来历史由来Thomas R.Cech1982 46S.Altman研究发现发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，留下RNA能够切割rRNA前体的5端。1983 471989 Nobel Prize in Chemistry核酶的发现改变了核酶的发现改变了“所有酶都是蛋白质所有酶都是蛋白质”的传

16、统观念的传统观念48有封闭有封闭切割切割RNARNA应用应用阻断基因的表达（1994年左右比较流行的研究工具）49通常由60个核苷酸左右组成；底物部分：含有GU序列；保守序列：13个碱基。锤头状核酶结构示意图5051第四节第四节 基因敲除技术基因敲除技术时间：时间：8080年代末年代末功能：建立基因失活或缺失的动物模型功能：建立基因失活或缺失的动物模型52发展历史发展历史a. 胚胎干细胞（胚胎干细胞（ embryonic stem cell，ES）分离培养）分离培养取自小鼠受精卵发育第取自小鼠受精卵发育第4，5天的胚胎细胞天的胚胎细胞 能在体外培养，保留发育的全能性能在体外培养，保留发育的全能

17、性 1981年，马丁年，马丁埃文斯埃文斯(Martin JEvans) 从正常的小鼠囊胚中从正常的小鼠囊胚中分离到了分离到了ES细胞。小鼠细胞。小鼠ES细胞的细胞的分离和应用是分离和应用是ES细胞技术发展的细胞技术发展的里程碑。里程碑。53同源重组：是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中同源重组：是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或者相似相同或者相似DNADNA序列间的重组，通常通过一对同源分序列间的重组，通常通过一对同源分子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。子非姊妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。b. 同源重组技术应用同源重组技术应用541985年，奥利弗年，奥利弗史密塞斯史密塞

18、斯(Oliver Smithies) 等首次报道在肿瘤细胞等首次报道在肿瘤细胞中实现了人工打靶载体和内源中实现了人工打靶载体和内源-球蛋白基因间的同源重组。球蛋白基因间的同源重组。551988年，卡佩基安德等发展了一年，卡佩基安德等发展了一种称为种称为“正负筛选正负筛选”的策略，将的策略，将胸腺嘧啶激酶基因（胸腺嘧啶激酶基因（tk）置于打）置于打靶载体的外侧，作为筛选的负性靶载体的外侧，作为筛选的负性标记。这比单用阳性筛选正确克标记。这比单用阳性筛选正确克隆富集的倍数高隆富集的倍数高310倍，真正使倍，真正使得同源重组技术得以应用。得同源重组技术得以应用。马里奥马里奥卡佩基安德卡佩基安德(Mario R(Mario RCapechiand)Capechiand)丙氧鸟苷丙氧鸟苷56Martin Evans马丁马丁埃文斯埃文斯Mario Capecchi马里奥马里奥卡佩基卡佩基Oliver Smithies奥利弗奥利弗史密斯史密斯57原理和操作流程原理和操作流程5859小结小结 1 1、RNAiRNAi技术：技术： 基本概念；基本概念； RNAi RNAi技术发