常见实验方法汇总常用

1、技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）常用实验方法汇总目录一Western Blot（蛋白质印迹法）3二免疫组化技术4三. 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）6四免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）8五GST-pulldown9六双向凝胶电泳11七ELISA 免疫测定12八酵母双杂交系统14九荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)17十. RT-PCR19十一. 第二代DNA技术20伯豪生物十二. . . .

2、. . . . .23十三. Real-Time PCR25十四. RACE 技术28十五. DNase I 足迹试验30十六. DNase I 超敏感位点的研究32十七. Northern blot34十八. digital PCR36十九. Luciferase 报告系统38二十. 凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）39二十一. 染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）42二十二. RNA 结合蛋白免疫沉淀45二十三. 荧光原位杂交技术（Fluorescence

3、in situ hybridization, FISH）48二十四. RNA-蛋白 Pull-Down50二十五.机制信号通路关键和抑制剂521 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）二十六.机制-细胞器典型标志物62二十七.A（GeneA）的敲减载体构建64二十八. GeneA 过表达载体构建64二十九. GeneA 点突变载体构建65三十. GeneA 敲除载体构建（CRISPR/Cas9 法）65三十一. GeneA 敲除载体构建（TALENs 法）65三十二. GeneA 的 miRNA 载体表达构建66三十三. 原代细胞培养与分离6

4、7三十四. 干细胞分离培养68三十五. 细胞增殖相关研究方法70三十六. 细胞转移相关研究方法73三十七.生成75三十八. 细胞周期：PI 染色76伯豪生物三十九. 细胞凋亡检测76四十. 细胞分选78四十一. 细胞转染79四十二. 细胞慢.80四十三.稳定细胞株的筛选80四十四. 耐药细胞株的筛选81四十五. 细胞共培养81四十六. 研究肿瘤细胞增殖82四十七. 研究肿瘤细胞转移82四十八. 研究肿瘤细胞耐药84四十九. 免疫组化85五十. HE 染色862 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）一Western Blot（蛋白质印迹法）概

5、述：蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot，它是生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。目的：获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。原理：与 Southern 或 Northern 杂交方法类似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸

6、附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的表达的蛋白成分。伯豪生物步骤：1.提取组织或细胞蛋白；2.测定蛋白质浓度 ；3.电泳：电泳条件为： 恒压 100V， 待120min）；4.电转膜仪转膜 ：前沿移行到距离凝胶底部 2-3mm 时方可停止（ 约转膜条件为：恒流 250mA ，2h（时间可根据目的蛋白5.封闭：5%脱脂牛奶室温封闭 1h；量适当调整）；6. 加一抗：一抗封膜之后室温条件下摇 1h 然后放入 4冰箱中过夜；7. 收一抗

7、，PBST 洗膜 3 次，10min/次；8. 二抗孵育：室温孵育 1h，所用二抗的比例和种属见步骤 9）表格。9.洗膜：PBST 洗膜 2 次，PBS 洗膜一次，10min/次。10.显色流程图：3 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）二免疫组化技术:概述：免疫组织化学（Immunohistochemistry）是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测的技术。凡是组织细胞内伯豪生物具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体 表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而

8、目前在基础与临床科研中被广泛应用。免疫组织化学染色方法分类：1、按标记物质的种类，如荧光、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。2、按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3、按结合方式可分为抗原抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等。目的：对所研究的大如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等进行，进而深入研究其功能。

9、原理：1、免疫荧光方法4 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于 60 年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入

10、酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。3、免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，伯豪生物且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也

11、适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。步骤：1. 洗载玻片2. 包埋组织3. 切片4. 捞组织5. 脱蜡6. 抗原修复7. 血清封闭8. 加一抗9. 加二抗10. 加SABC11. 加显色剂12. 复染13. 脱水5 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）14. 封片流程图：伯豪生物三. 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）概述：免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，

12、再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和。目的：测定内激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。步骤：1、细胞准备；2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞，固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的 PBS中 4保存 3；6 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）3、通透。使用交联剂（如多聚）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通

13、透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭。5、一抗结合。室温孵育 1h 或者 4过夜。6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。7、封片，荧光显微镜检查。流程图：伯豪生物7 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）四免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）概述：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种以抗体和抗原之间的特异免疫反应为基础，研究蛋白质与蛋白质间相互作用的经典方法。其基本原理是在细胞裂解液中加入抗原特异性的抗体，抗体、抗原、以及与抗原具有相互作用

14、的蛋白质通过抗原与抗体之间免疫沉淀反应将形成免疫复合物，经过纯化，洗脱，收集免疫复合物，SDS-PAGE 电泳， western blot 和（或）质谱可鉴定出与抗原相互作用的蛋白质。其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； （3）必须在实验前目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若不正确，实验就得不到结果，方法本身具有

15、性。伯豪生物目的：研究一种已知蛋白质与已知或者未知蛋白质间相互作用原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。步骤：1.用 RIPA 裂解缓冲液裂解细胞；2. 用PBS 配制成 50%的 protein A/G-agarose 工作液；3. 在样品中以每 1ml 中加 100l 的比例，加入 50%的Protein A/G agarose 工作液。水平摇床4摇动 10min（该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白）；4. 4，14000g 离心 15min，

16、将上清转移到一个新的离心管中，去除 protein A/G-agraose 微球；5. 使用 BCA 法或者其他方法测定总蛋白的浓度；6. 加入一定体积的一抗；8 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）8. 用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物，4过夜；9. 14000g 离心收集沉淀，并且用预冷的洗涤缓冲液（或者预冷的PBS）洗涤 3 遍；10. 收集上清，用于进一步的下游 SDS-PAGE、western-blot 或者质谱分析。流程图：五GST-pulldown伯豪生物概述：GST pull-down 实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体

17、外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase 谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE 电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白” 和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白

18、。原理：9 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）利用重组技术将探针蛋白与 GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过 GST 与固相化在载体上的 GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。步骤：.Glutathione 琼脂糖珠预处理；.GST 融合蛋白挂柱：取适 GST-融合蛋白与已经处理过的 beads 置于管中，4，摇床孵育过夜；.孵育过夜的蛋白质与 beads 的混合液于 4，离心,上清收集，观察融合蛋白是否饱和

19、地挂在 beads 上；.把转染目的的细胞裂解在细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4离心，收集上清液；.将细胞裂解液上清加入 beads；.加上 SDS 上样缓冲液；伯豪生物.SDS-PAGE，Western Blot 或者质谱仪分析。流程图：10 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）伯豪生物六双向凝胶电泳概述：双向凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳。目的：凝胶中蛋白的检测、图像和分析、蛋

20、白鉴定、分离蛋白质组所有蛋白 。原理：1、 根据蛋白质的等电点（第一向）和量（第二向）的不同进行分离。，在不同的 pH 环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。对每个蛋白质是两性蛋白质来说都有一个特定的 pH，此时蛋白质的静电荷为零，此 pH 值即该蛋白质的等电点(pI)。将蛋白质样品加载至 pH 梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，蛋白可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白质迁移至其等电点 pH 位置时，其净电荷数为零，在11 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203

21、）电场中不再移动。聚焦是一个与 pH 相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI 值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒点。双向电泳的第二向是将 IPG 胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向 SDSPAGE凝胶上，根据蛋白相对质量或量(MW)大小与第一相垂直的分离。蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物，由于 SDS 是一种强阴离子去垢剂，所带的负电荷远远超过蛋白质原有的电荷量，能消除不同之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质的质量大小，其迁移率与量的对数呈线性关系。步

22、骤：.样品.第一向分离 等电聚焦.第二向分离 聚丙烯酰胺凝胶电泳.修饰和，如用 32P 标记可以研究磷酸化蛋白的变化流程图：伯豪生物七ELISA 免疫测定概述：12 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）ELISA 是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自 70 年代初问世以来， 发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。目的：1.

23、测定体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等；2. 测定激素，包括小量的甾体激素等；3.测定抗生素和；4. 测定病原体抗原，HBsAg、HBeAg 等；5. 利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs 等；原理：ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用伯豪生物洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时

24、固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。步骤：1. 包被；2. 加样：加一定稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反应孔中，置 37孵育 1 小时。然后洗涤(同时做空白孔，对照孔及阳性对照孔)；3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37孵育 0.51 小时，洗涤。4.5.6.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0.1m

25、l，371030 分钟； 终止反应：于各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml；结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，反应为无色或极浅。也可测 OD 值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm 处，以空白对照孔调零后测各孔 OD 值。13 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）流程图：八酵母双杂交系统概述：酵母双杂交由 Fields 在提出，他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录伯豪生物因子 GAL4 性质的研究。GAL4 包括两个彼此分离的但功能必需的结构域，分别是位于 N端 1-147 位

26、氨基酸残基区段的 DNA 结合域（DNA binding domainDNA-BD）和位于 C 端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域（Activationdomain，AD)。DNA-BD 能够识别位于 GAL4 效应（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)，并与之结合。而 AD 则是通过与转录机构（transcription machinery）中的其他成分之间的结合作用，以启动 UAS 下游的进行转录。DNA-BD 和 AD 单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整

27、的 GAL4 转录因子活性并可激活 UAS 下游启动子，使启动子下游得到转录。酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点： 作用信号是在融合表达后，在细胞内重建转录因子的作用，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。 检测的结果可以是表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。酵母双杂交系统可采用不同组织、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋

28、白。酵母双杂交系统仍存在一些局限性：双杂交系统分析蛋白间的相互作用于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无14 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使 DNA 结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力

29、区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告的表达，产生"假阳性"结果。目的：1. 发现新的蛋白质和蛋白质相互作用；2. 在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用；3. 筛选4. 建立作用位点及对蛋白相互作用影响；组蛋白连锁图，原理：酵母的转录激活因子 GAL4 由两个可以的、功能上相互的结构域 DNA 结合域(DNA binding domain BD)和的转录激活域(transcription activation domain,AD)。BD 可以和伯豪生物上游激活序列(upstream ac ivating sequence，UAS)结合，而 AD 则能激活 UAS

30、下游的进行转录。但是 单独的 BD 或 AD 不能激活转录，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。酵母双杂交系统主要利用酵母的 GAL4 的这个特性通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告的转录激活来研究活细胞内蛋白质的相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告敏感地检测到。步骤：1、酵母菌株的保存与表达型验证1)用接种环将冻存在-70 C°的酵母 Y190 贮备备液划于 YPD 琼脂培养平板上，在 30 C°培养，直到菌落直径达到 2mm，约需 3-5 天，密封平板，4°C 保存。2)正常的Y190 菌落由于 ade

31、2-101 突变而呈粉红色，并且直径>2mm。挑取 3-4 个菌落置于不同培养平板上(SD/-Trp，SD/-Leu,，SD/-His，SD/-Ura，YPD)，培养 4-6 天。核对其不同的生长情况。由于 Y190 可以有轻微的 His3 泄漏表达，所以需要在 SD/-His 的培养基中加入的竞争性拮抗剂 3-AT(3-ammino-l,2,4-triazole，25mmol/L)，以抑制背景生长。2、酵母感受态细胞15 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）挑取数个直径 2-3 mm 的酵母单菌落放入 1 ml YPD 液体培养基中

32、，剧烈振荡使菌落分散， 然后转入 50ml YPDA 液体培养基中。以 250 rpm、30°C 的条件培养 16-18h 达到稳定期。将过夜培养物转入 YPDA 液体培养基中，继续培养 4 h，使 OD600 值达到 0.4-0.6。室温下4,000 rpm 离心 5 min 收集菌体，用无菌 IxTE 洗菌体后，用新鲜配制的 1 xTE/LiAc 溶液重悬。3、酵母感受态细胞的转化1)PEG/LiAc 溶液。2)将各组分在反应管中混勾(BD 载体构建产物 0.1 g + AD 载体构建产物 0.1 g +鲑精 DNA0.1 mg)。3) 在反应管中加入酵母感受态细胞 100 l，

33、混匀；4) 加入PEG/LiAc 溶液 0.6 ml，混匀；5) 30 C°培养 30min；6) 加入DMSO 70 l 以达到 10%的终浓度，轻轻颠倒混匀；7) 42°C 水浴中热休克 15 min； 8)冰浴 10 min；伯豪生物9)14,000 rpm 离心 5 s 沉淀细胞；10)用 IxTE 重悬细胞。4、共转化产物的培养和处理共转化的酵母细胞铺于 SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)培养平板上。30°C 倒置培养 7-10 天， 直至菌落出现。选择直径>2 mm 的淡粉色菌落,用牙签重新点种在新鲜的 SD/-Trp/-L

34、eu/-His+3-AT(25mM)培养平板上，继续培养 2-4 天，此时可进行半乳糖苷酶活性检测。5、LacZ活性的测定1) 将 SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)培养平板上的克隆印迹到新华 3 号滤纸上；2) 滤纸克隆面朝上，在液氮中冷冻 10s 以上，取出，室温放置数分钟；3) 在一平皿中放一张新华 3 号滤纸，再加入 2ml Z buffer/X-Gal 溶液，尽量避免出现气泡。4) 将滤纸置于滤纸上，克隆面朝上，尽量避免出现气泡。30°C 温浴。5) 观察滤纸上克隆颜色反应。一般菌落半乳糖苷酶的表达需要 30min-8 h。流程图：16 / 87技术服

35、务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）九荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)伯豪生物概述：荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子尺”，在生物大相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。在生物学领域，该技术可用于研究活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间的相互作用。蛋白质-蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位，由于细胞内各种组分极其复杂，因此一些传统研究蛋白质-蛋白质间相互作用的方法如酵

36、母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息，无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质-蛋白质间相互作用的动态变化过程。FRET 技术是近来发展的一项新技术，为在活细胞生理条件下对蛋白质-蛋白质间相互作用进行实时的动态研究提供了便利。目的：1. 活细胞内检测蛋白激酶活性；2. 细胞凋亡的研究；3. 受体激活效应在细胞膜上的横向扩散；4.膜蛋白的修饰；5.细胞膜受体之间相互作用；6.细胞内之间相互作用。17 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）原理：荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体吸收一定频率的光子后被激发到更高的电

37、子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体转移（即发生能量共振转移）。FRET 是一种非辐射能量跃迁，通过间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：受、供体的激发光要足够分得开；供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。伯豪生物步骤：1 、实验所用细胞

38、的培养；2 细胞转染质粒：CFP-A和 YFP-B质粒；3 多光子共聚焦显微镜和 FRET 观察18 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）FRET 检测时间：CFP-A测 FRET。或 YFP-B转染细胞 12h、18h、24h、36h、48h、72h 后检FRET 图像：确定 FRET 配对的激发波长， 蓝宝石激光被调谐分别用于探测最大和最小的供体和受体信号， 最大供体信号和最小受体信号对应的波长用于收集双表达细胞的FRET 信号。标定 CFP （供体）和 YFP （受体），调整激光变化，以便获取最大 CFP 信号和最小 YFP 信号的激

39、发光波长，以此激发（CFP-YFP）双表达细胞，选择合适的滤镜组合和高灵敏的PMT，供体和受体图像，收集 FRET 信号，调整供体激光强度，固定用于激发供体，对受体激发波长也类似要求，注意调整能量，使用合适的中性密度滤光片，避免光漂白。每个细胞FRET 检测重复 3 次，每种转染至少完成 6 个细胞的 FRET 检测。FRET 数据处理： 去除 FRET 信号中DSBT 和 ASBT 的光谱串色信号； 受体通路的FRET 信号需要对供体受体光谱灵敏度的变化进行矫正、对自发荧光和光学噪声进行矫正； 利用矫正系数对双标定细胞进行象素匹配矫正。十. RT-PCR伯豪生物概述：RT- PCR（Reve

40、rse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录 PCR是将 RNA 的逆转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术 RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中表达水平，细胞中 RNA的含量和直接克隆特定的cDNA 序列等。目的：检测目的的转录产物 mRNA 的水平原理：提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，从而获得目的因的表达。或检测基步骤：1. 总 RNA 的提取（以细胞为

41、例）1.1 弃去培液，PBS 洗 2 遍，加入 1ml Trizol，轻轻吹打，直至细胞脱落，吸入 1.5 ml EP 管内，静置 5 min。（Trizol 量根据细胞密度可适当调整，建议：6 孔板细胞长满1ml Trizol）19 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）1.2 加入 200l 氯仿（三氯甲烷），用手剧烈震荡 15 秒，室温静置 2-3 分钟。（氯仿量为1/5 Trizol）1.3 12000g，4，离心 15min。1.4 仔细转移上层水相到 1 个新 EP 管中，不能贪多，约 400-500l。1.5 加等体积异丙醇，轻

42、柔混合 45 次，室温放置 10 分钟。1.6 12000g，4，离心 10min。1.7 轻轻倒去上清，用 20 l 枪轻轻吸去残液，沉淀用 1ml 75%乙醇（0.75ml 无水乙醇0.25ml DEPC 水，现配）洗 12 次，涡旋混匀。1.8 吸去上清，5-10 分钟空气干燥 RNA。（肉眼不能明显看到水分即可）1.9 加 15-20l DEPC 水，吹打数次，测浓度。注释：mRNA 不稳定，很容易讲解，因此 mRNA 提取过程中要尽量避免 RNA 酶污染。2.RT：（参照商品化试剂盒说明书）3.PCR：（参照商品化试剂盒说明书）4.电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。5.密

43、度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。伯豪生物十一. 第二代 DNA技术概述：第一代（缺点：通量低 1000 个核苷酸/反应，费用高） 化学降解法双脱氧链终止法（Sanger 法）高通量荧光自动技术杂交技术：（next-generation sequencing，NGS）第二代第二代技术的思想是边边(Sequencing by Synthesis)，即通过捕捉新的末端的标记来确定 DNA 的序列， 现有的技术平台主要包括 Roche/454 FLX 、Illumina/Solexa Genome Analyzer 和 Applied Biosystems SOLID

44、system。这三个技术平台各有优点，454 FLX 的片段比较长，高质量的读长(read)能达到 400bp；Solexa性价比最高，不仅的售价比其他两种低，而且运行成本也低，在数据量相同的情况下，成20 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）本只有 454的 1/10；SOLID的准确度高，原始碱基数据的准确度大于 99.94%，而在 15X 覆盖率时的准确度可以达到 99.999%，是目前第二代技术中准确度最高的。虽然第二代技术的工作一般都由专业的商业公司来完成，但是了解原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用，下文将以Illu

45、mina/Solexa Genome Analyzer为例，简述第二代技术的基本原理、操作流程等方面。原理：Illumina/Solexa Genome Analyzer的基本原理是边边。在 Sanger 等方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的 dNTP，当 DNA 聚合酶合成互补链时，每添加一种 dNTP 就会出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测 DNA 的序列信息。Illumina Solexa仪特点：桥式PCR边边可逆终止物伯豪生物Illumina Solexa流程：操作步骤：1)文库的构建(Library Constructio

46、n)21 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）组 DNA(虽然公司要求样品量要达到 200ng，但是 Gnome Analyzer 系统首先准备所需的样品量可低至 100ng，能应用在很多样品有限的实验中)，然后将 DNA 随机片段化成几百碱基或更短的小片段，并在两头加上特定的接头(Adaptor)。如果是转录组，则文库的构建要相对麻烦些，RN段化之后需反转成 cDNA，然后加上接头，或者先将RNA 反转成 cDNA，然后再片段化并加上接头。片段的大小(Insert size)对于后面的数据分析有影响，可根据需要来选择。对于组来说，通常会选

47、择几种不同的 insert size，以便在组装(Assembly)的时候获得的信息。2)锚定桥接(Surface Attachment and Bridge Amplification)Solexa的反应在叫做 flow cell 的管中进行，flow cell 又被细分成 8 个 Lane，每个Lane 的内表面有无数的被固定的单头。上述步骤得到的带接头的 DN段变性成单链后与通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。3)预扩增(Denaturation and Complete Amplification)添加未标记的dNTP 和普通 Taq 酶进行固相桥式PCR 扩增，单

48、链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性，出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在 Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。伯豪生物4)单碱基延伸(Single Base Extension and Sequencing)在的 flow cell 中加入四种荧光标记的 dNTP 、DNA 聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的 dNTP 就能出相对应的荧光，仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为峰，从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做 Base Calling，I

49、llumina 公司Base Calling 所用的软件是 Illumina's Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加，错误率也会随之上升。5)数据分析(Data Analyzing)这一步严格来讲不能算作操作流程的一部分，但是只有通过这一步，前面的工作才显得有意义。得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的 Contigs 甚至是整个组的框架，或者把这

50、些序列比对到已有的组或者相近物种组序列上，并进一步分析得到有生物学意义的结果。22 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）十二.概述：（又称 DNA、生物）技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400 ）探针固定于支持物上后与标记的样品进行杂交，通过检测每个探针的杂交信号强度进而获取样品的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微技术 ，将伯豪生物数以万计、乃至百万计的特定序列的 DN段（探针），有规律地排列固定于 2cm2的硅片、玻片 等支持物上的一个二维 DNA 探针阵列，与计算机的电子十分相似，所以被称为。主要用于检测工作 。目前主要被应

51、用的表达是美国昂飞公司和安捷伦两家公司的。美国Affymetrix 公司开发了世界上最第一款商业化，其发明的寡核苷酸原位光刻专利技术（light-controlled in situ synthesisof DNA microarrays）可在每 cm²片基上超过 400 万条探针，是世界上最高密度的探针技术。将片基羟基化保护后，通过光刻掩膜（photolithographic mask）的覆盖调控激光对片基的照射，从而促使相应片基部位脱羟基而活化。进而，与后续加入的 3端活化(5羟基末端连接光敏保护基团)单一核苷酸单体底物发生循环偶联反应，而实现原位寡核苷酸的。待检测样本利用体外转

52、录的方式进行扩增和生物素标记，标记后杂交、洗涤、染色、扫描获得原始图像文件安捷伦的制造工艺为享有专利的喷墨打印化学原位技术（ink-jet chemicalinsitusynthesis）。非接触式的探针技术保证了每一个探针样点的制作准确度，精度的高度均一化，极大地减少了间的差异和实验可以完整准确的60mer 的长寡核苷酸探针，极大地提高了检测的灵敏度，并且使的设计和生产具有无与伦比的灵活应用特性。23 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）目的：功能的研究。通过可以大规模，高通量地对成千上万个同时进行表达丰度检测。原理：的原理是利用碱基互补杂交，即以荧光或生物素标记的样品，借助碱基互补杂交原理，进行大量的表达研究。带有荧光或生物素标记的目的片段与固定在片基上序列互补的探针杂交后，通过扫描仪获得荧光或生物素信号强度，借以反应的表达丰度。伯豪生物的杂交原理图的原理图24 / 87技术服务Tel：/ Web：上海市张江高科技园区李冰路 151 号（201203）步骤：1. 样品的准备： 总RNA 抽提、逆转录、体外转录、标记2. 杂交、扫描获得信号强度。当前扫描仪主要是应用激光共聚焦显微扫描技术，以便于对高密度探针