氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性

1、9 实验三氮蓝四唑（NBT ）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性 一、 实验目的 1、 了解氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的 基本原理。 2、 掌握氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的 基本操作方法。 二、 实验原理 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于动、植物体内，是 一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑 （NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄 素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子 自由基，超氧阴离子自由基

2、可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在 560nm 处有最大吸收。而 SOD 可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。 于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。 据此可以计算出酶活性大小。 三、 材料、仪器设备及试剂 （一）材料 水稻或小麦等植物叶片。 （二）仪器设备 高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯（反应试管处照度为 4000LX），试 管或指形管数支。 （三）试剂 （1） 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8 ）。91.5ml0.05MNa2HPO4+8.5ml0.05M NaH2PO4 。 （2） 130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）

3、溶液：称 1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至 100ml。 （3） 750mol/L 氮蓝四唑溶液： 称取 0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至 100ml, 避光保存。 10 (4) 100mol/LEDTA-Na2 溶液：称取 0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定 容至 1000ml。 （5） 20 pmol/L 核黄素溶液：称取 0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至 1000ml，避 光保存。 四、实验步骤 1、 酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉） 0.52g 于预冷的研钵中，加 1ml 预冷 的磷酸缓 液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为 4

4、ml。取 4ml 于 4C 10000r/min 离心 20min 上清液即为 SOD 粗提液。 2、 显色反应 取 10mL 试管（要求透明度好）4 支, 2 支为测定管，另 2 支为对照管，按下表加入 各种溶液： 各溶液显色反应用量混匀后将 1 支对照管置暗处，其他各管于 4000IX 日光下反应 20min （要 各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。 3、 SOD 活性测定与计算 至反应结束后，全部移入暗处，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的 吸光度。 注意：用放在暗处的缓冲液代替酶液的空白管调零，各试剂按比例混合好 （3.5ml 缓冲液+0.5ml 甲硫氨酸+0.5

5、ml 氮蓝四唑+0.5ml EDTANa2+0.40ml 蒸馏 水），再加 100ul 酶液，核黄素 0.5ml 最后单独加入。总体积 6.0mL 表 10 SOD 活性测定的试剂量 试管编号 1 对照（不光 昭） 八、） 2 对照（光照） 3 4 缓冲液（mL） 3.50 3.50 3.50 3.50 11 甲硫氨酸 （mL） 0.50 0.50 0.50 0.50 12 氮蓝四唑 （mL） 0.50 0.50 0.50 0.50 EDTANa2 （mL） 0.50 0.50 0.50 0.50 蒸馏水（mL） 0.50 0.50 0.40 0.40 酶液 0 0 0.10 0.10 核黄素

6、 0.50 0.50 0.50 0.50 测定结果 0 Ack AE1 AE2 表 11 SOD 活性测定（平行测定 2 次）的 Abs 试管号 2 对照（光照） 3 4 平行测定次数 第一次 第二次 第一次 第二次 第一次 第二次 吸光度 A（ Abs） 0.203 0.251 0.055 0.199 0.035 0.140 五、结果计算 计算公式：SOD （ U/g.FW） =（Ack-AE）*VT/Ack/0.5/W/Vs 式中 VT-总酶液量（ml） Vs-所用酶液量（50ul） W-叶片鲜重 （g） Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度 AE-样品管吸光度 表 12 SOD 活性的计算 VT = 400uL Vs =