2022年《分子生物学》教案

1、精品word 名师归纳总结 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载分子生物学教案E DNA复制 教学目的和要求1 懂得 DNA 复制的半保留机制和半不连续复制2 把握细菌DNA 复制过程及有重要作用的酶和蛋白质3 明白细胞周期4 明白真核生物DNA 复制的特点E1 DNA 复制概述半保留机制DNA两条亲代链分别作为模板催化新生子链的合成，新生DNA的一条链是原先的旧链， 另一条是新合成的，为半保留复制； Meselson 和 Stahl 1958 年用试验证明白该机制（见教材P71）；亲代链分开及新生DNA 开头复制处称为复制叉；DNA合成的底物是脱氧核苷三磷酸 （d

2、NTP）:dATPdGTP、 dCTP、dTTP；合成的能量来自dNTP 的水解；复制子、复制起始与终点以单一单位复制的任一段DNA 都称为复制子；每个复制子都有固定的起始点，原核生物很多病毒的DNA呈环形，为单一复制子，通常两个复制叉从一个 起始点向两个方向复制，复制的起始和细胞生长周期调剂都在起始点处调剂；真核生物的线性染色体由多复制子构成，每个复制子都有自己的起始点，起始点在最初解链处富含AT 序列，它比富含GC 的起始点更易解链；半不连续复制由于 DNA 新链合成只答应以5/ 3/方向进行，而两条亲本链反向平行，因而一条新链从起始点按5/ 3/方向连续合成（前导链），另一条新链（后随链

3、）从复制叉开头按5/ 3/方向先合成一些短的DNA片段（冈崎片段） ，再由连接酶连成一条连续的 DNA ；即前导链连续合成为长链，后随链就是间断合成的，这种合成方式为半不连续复制；RNA 引导在每一片段的5/ 端先合成一小段RNA （引物），引导 DNA 合成；E2 细菌的 DNA 复制起始E.coli 的起始点位于遗传基因座oriC ，大肠杆菌编码的蛋白DnaA 第一识别和结合于oriC 的 9bp 重复序列形成复合物，约 45bp 成为单链，DnaB 进入，它是 DNA 解旋酶，利用 ATP 水解产生的能量解开双链DNA ，形成的单链泡被单链结合蛋白Ssb 所掩盖；DNA引发酶结合到DNA

4、 上并合成引物RNA ；解旋DNA解旋酶沿模板链前进，打开双螺旋使复制顺当进行，在闭环DNA中复制叉处解旋所形成的正超螺旋可通过型拓扑异构酶即DNA 旋转酶的作用而释放；延长DNA 聚合酶的全酶二聚体引发体和DNA 解旋酶结合成复合体（复制体），以每秒 900bp 的速率合成DNA ；引发体含有DnaB 解旋酶和DNA引物酶，在后续链上间断合 成 RNA 引物；DNA 聚合酶催化合成DNA ，该酶含有聚合酶亚基和一个3/ 5/外切核酸酶 亚基；DNA 聚合酶负责切除引物并填补缺口，该酶具有5/ 3/ 聚合酶、5/ 3/ 外切核酸酶及3/ 5/校正外切核酸酶活性；DNA 连接酶填补片段间的缺口；

5、终止与分别 两个复制叉在 oriC 约 1800 的对面相遇； 该区域有终止子位点， 它们与 DnaB 抑制剂（ tus 基因的产物）结合，阻挡复制叉移动；复制终止后两个相扣的子链 DNA 由拓扑异构酶（一种型拓扑异构酶）解联，安排到两个子细胞；E3细胞周期细胞周期细胞分裂为两个子细胞的全部过程为细胞周期，它包括DNA的复制和细胞分裂；细胞周期分4 个时期： G1 期细胞为复制作预备；S 期 DNA 复制； G2 期 S 期后有精选名师 优秀名师 - - - - - - - - - -第 1 页，共 4 页 - - - - - - - - - -精品word 名师归纳总结 - - - - -

6、- - - - - - -学习好资料欢迎下载丝分裂前的短暂期；有丝分裂期染色体对等安排到两个子细胞，它又有前、 中、后期之分；G1 、S、G2 共同组成间期；有丝分裂后，增殖的细胞进入下一个细胞周期的G1 期，也可脱离细胞周期进入非增殖的休眠状态G0 期（缄默期） ；检验点及其调控在 G1 期有打算细胞进入下一个分裂周期的限制点（R 点），细胞分裂周期起始仍需促细胞分裂原，如细胞在到达R 点之前缺乏促细胞分裂原，细胞将重进G0 期；细胞周期中终止细胞分裂的那些点叫检验点，它在间歇期发生以保证细胞分裂之前完成DNA 复制；细胞周期蛋白和CDK蛋白磷酸化是调控细胞周期进程的一个主要机制，由一个调剂

7、亚基（细胞周期蛋白）和依靠细胞周期蛋白的激酶（CDK ）来完成，细胞周期蛋白CDK复合物打算将被磷酸化的目标蛋白；E2F 和 RB 的调控 由 G1 期进入 S 期主要依靠对 E2F 这一转录因子的激活， E2F 的活性又受与其结合的蛋白 RB 的抑制，在 G1 中后期，细胞周期蛋白 CDK 复合物使 RB 磷酸化从而释放 E2F 进而激活转录；细胞周期的激活、抑制和癌症小的抑制蛋白如CIP 蛋白和 INK4 蛋白可通过抑制细胞周期蛋白 CDK 复合物的活性来推迟细胞周期的进程；细胞周期与癌症间有着根本的联系，G1 到 S 期的过渡受到原癌基因和抑癌蛋白的调控；B细胞的癌变与细胞周期蛋白D1

8、基因的过表达相关；人类癌症中两个重要的抑癌基因产物 抑癌蛋白RB 和 P53 均与细胞周期调控亲密相关，RB 调控 E2F 的活性，当DNA损耗时，P53 诱导 P21 WAF1/CIP1 的合成；E4真核生物的DNA复制试验系统仅有 400 个复制子的酵母，更为简洁的猿猴病毒（SV40 ）病毒都是很好的模型；非洲爪蟾卵提取物广泛用于外加DNA 或整个细胞核的复制；起始点和起始约 20 50 个复制子串联成簇在S 期同时开头复制，常染色质先复制，其次 为异染色质，最终是着丝粒和端粒；酵母的起始点都有一个11bp 长的保守序列（自动复制序列 ARS ），它可结合起始点识别复合体（ORC ），被

9、CDK 激活后引导DNA 复制；每个复制子仅起始一次，特许因子在作用后失活能防止复制的再次起始；复制叉真核生物复制叉移动速度为每秒50bp，该过程需要解旋酶、单链结合蛋白（复制蛋白 A ）和 3 种 DNA 聚合酶；聚合酶 引发复制的起始，聚合酶 延长前导链，聚合酶 完成后续链的复制； DNA 及复制所需的蛋白质均固定在核基质上；端粒的复制真核染色体末端（端粒）由多个简洁重复序列构成，不带遗传信息，且3/端突出于 5/端以防止半不连续复制不能复制线性染色体末端而造成遗传信息的丢失；端粒酶负责端粒DNA的复制，它带有与端粒重复序列互补的RNA 分子；该酶在体细胞中处于抑 制状态，但在很多癌细胞中

10、处于激活状态；F DNA 损耗、修复与重组教学目的和要求1 明白突变的种类和产生的因素2 懂得 DNA 复制忠实性的机制3 把握 DNA 修复的机制4 把握 DNA 重组的方式及原理F1 诱变突变指 DNA碱基序列发生的永久的可遗传的转变；一个单一碱基的转变为点突变，它包括转换（嘌呤与嘌呤，嘧啶与嘧啶间的互换）或颠换（嘌呤与嘧啶间的互换）；假如点突变精选名师 优秀名师 - - - - - - - - - -第 2 页，共 4 页 - - - - - - - - - -精品word 名师归纳总结 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载发生在 DNA 的非编码区、非调剂区

11、或密码子的第3 个碱基，它不会影响渗入蛋白质中的氨基酸， 为缄默突变； 假如发生氨基酸的转变，就为错义突变；形成新的终止密码的突变为无义突变，产生截短的蛋白质产物；一个或多个碱基的增加或丢失，会引起移码突变；群体中很多缄默突变及非致死性突变的积存会产生遗传多态性；复制忠实性 复制的精确性有 3 种机制：互补碱基配对原就（模板链和进入核苷酸在 DNA 聚合酶的作用位点正确配对） ；聚合酶的 3/ 5/外切酶活性有校对功能，它能回走从 3/端切掉错配核苷酸，引物是 DNA 聚合酶发挥自我校正功能的必要条件；逃脱校对的错误可被错配修复机制所订正；诱变剂常见的物理诱变剂为紫外线，它引起相邻嘧啶核苷酸产

12、生嘧啶二聚体；化学诱变剂种类很多，碱基类似物可转变碱基配对特性，诱发直接突变（如5溴尿嘧啶是胸腺嘧啶的类似物）；亚硝酸使胞嘧啶脱氨变成尿嘧啶，引起复制中A T 向 G C 转化；烷化剂能在DNA不同位置加上烷基，造成碱基脱落，经修复才能防止DNA损耗，细胞对损耗的处理有可能会由于间接诱变而导致突变；直接诱变和间接诱变DNA中存在稳固的、配对特性发生转变的碱基而导致的突变为直接诱变；在有些情形下，一些损耗DNA 聚合酶为了保证染色体的完整性在损耗对应的位点上插入错误的碱基， 导致间接诱变； 突变发生在损耗的位点上为定点突变， 发生在其它位点为非定点突变；原核生物中转移损耗 DNA 合成属于对 D

13、NA 损耗的 SOS 反应（有时也叫“易错修复”）F2 DNA 损耗碱基的损耗和丢失DNA的一些损耗是自发的，如胞嘧啶会自发水解脱氨变为尿嘧啶，它会在接下来的复制中与腺嘌呤配对；生理温度下， 哺乳动物的基因组每天约失去10000 嘌呤和几百个嘧啶；很多已转变的碱基会被专一性的DNA 糖基化酶所除去，形成无嘌呤和无嘧 啶位点或 AP 位点；氧化性损耗自由基可攻击DNA ，产生氧化产物造成氧化损耗烷基化烷化剂为亲电化学试剂，可将烷基加到核酸的各种位点，导致DNA 损耗；有些是致死性的，多数导致间接诱变损耗；聚化加合物紫外线使相邻嘧啶，特别是胸腺嘧啶形成环丁烷嘧啶二聚体；煤焦油中的苯并芘在肝脏产生的

14、一种产物可与鸟嘌呤残基共价结合；芳香族烷化剂、黄曲霉毒素B1 均可与DNA 共价结合；F3DNA 修复光复活DNA中的嘧啶二聚体可通过可见光的光解作用而复原为单体，催化此过程的酶是DNA 光解酶（光复活酶） ；E.coli 的光解酶有两个发色团：蝶呤和FAD ；这是一种无差错的“直接修复” ；烷基转移酶该酶可直接从突变的O6烷基鸟嘌呤上除去烷基，酶作用后即失活；它也属 于无差错直接修复；切除修复为普遍的无差错的修复机制；有两种形式：核苷酸切除修复（如E.coli中的UvrABC内切核酸酶识别并切除嘧啶二聚体和其他大块损耗，缺口可由DNA 聚合酶和连接酶填补）；碱基切除修复（专一的DNA糖基化酶

15、识别修饰碱基，切除修饰碱基与糖基间的 N 糖苷键，留下一个脱嘌呤或脱嘧啶的AP 位点， AP 内切核酸酶在该位点切开DNA ；错配修复是一种特别的切除修复，它是按模板的遗传信息来修复错配碱基的，因此修复时第一要区分模板链和新合成的DNA 链；它通过碱基的甲基化来实现的；大肠杆菌DNA的5/ GATC 序列中 A 的 N6 都是甲基化的（Dam 甲基化酶负责） ，复制后的一个短临时间内，新合成链的GATC 中的 A 未被甲基化，故子代DNA 临时是半甲基化的，这是识别的基础；错配的碱基被MutS 和 MutL 组合的复合体识别并与之结合，再与MutH 内切核酸酶结合，精选名师 优秀名师 - -

16、- - - - - - - -第 3 页，共 4 页 - - - - - - - - - -精品word 名师归纳总结 - - - - - - - - - - - -学习好资料欢迎下载后者在子代链GATC 邻近的位点上产生缺刻，启动对损耗区的切除修复；遗传性非息肉结肠癌就是一种错配修复酶突变丢失引起的；着色性干皮病 （XP）患者缺乏对紫外线引起的大块DNA 损耗的切除功能， 对阳光极度敏锐，易患皮肤癌F4重组同源重组也称一般重组，即两个双螺旋DNA 分子间同源序列进行交换；双倍体真核生物发生在减数分裂过程，非姐妹染色单体交换相对应的区域，产生的单倍体配子会包含父母本两方的遗传信息；单倍体细菌也

17、可重组，如发生在部分已复制DNA间或染色体DNA与外源 DNA （质粒或噬菌体）间；重组的过程和机制包括断裂复合、异源双链、分支迁移、Holliday 结构、拆分（见教材 P98 图）；大肠杆菌的核酸酶和 RecBCD 结合在 chi 序列上并产生切口形成单链末端，单链 DNA 被 RecA 蛋白包裹， 4 条单链形成 Holliday 结构；同源重组对 DNA 修复也很重要（复制后修复或重组修复） ；位点特异性重组非同源 DNA 的特异片段间的交换，它是在结合序列部位由特异的酶来催化断裂重接，而同源重组就是由能与RecA 蛋白结合的DNA序列随机断裂引发的；噬菌体可将自身基因组插入大肠杆菌染色体的特定位点，噬菌体编码的整合酶与细菌编码的整合 宿主因子（ IHF ）促成重组结果和DNA 进入宿主染色体； 噬菌体编码的切除酶被激活时，整合作用发生逆转， DNA脱离细菌基因组；在真核生物中，免疫球蛋白有3 个基因段编码重链和轻链的可变区：V 、D 和 J；这些基因段间的重组产生大量的不同重链和轻链基因序列，导致抗体种类的多样化；转座作用又称特别重组，一些短的DNA 片段（转座子或转座元件）可转移进基因组的几 乎任何位置； 转座子均有两个结构特点：两端有 2040bp 的反向重复序列；具有编码转座酶的基因，该酶催化转座子插入新的位置；E.coli 中的 IS 元