晚粳稻农垦58大田自然不育败育株分析研究 农业学专业

1、1973年，石松明在晚粳稻农垦58大田中寻找到自然不育败育株，根据分析可知，该材料具有长日照不育，短日照可育等特点, 不育期可以进行杂交制种,可育期可以自交繁殖，一系两用1-2。光温敏水稻的发现，开辟了杂种优势利用的新途径，拉开了我国两系杂交水稻育种的序幕。和三系杂交稻进行比较，两系杂交水稻主要表现出生产流程简单、杂交配组难度低、可以应对三系不育细胞质负效应与便于完成籼粳亚种间杂种优势利用等特征15。1987年，袁隆平提出从三系到两系之后到一系的杂交水稻战略规划3，当时，光温敏不育系和两系杂交水稻分析被顺利评选成国家自然科学基金重大研究与863 计划。起点温度不高，配合力好，开花习性、抗性好，

2、口米质佳，同时生育期适宜，是选择实用的光温敏核不育系主要标准，育性平稳是重点。杂交转育是目前培育两系不育系较常用的方法。但是由于常规杂交育种选育周期漫长，并且一些优良性状会丢失等缺点，难以实现日益提高的育种目标。CRISPR/Cas9 基因编辑技术是当前应用最广泛的基因编辑技术，可对作物内源基因进行定向改造，具备费用较低，科技要求低，操作方便，试验时间短等优势，为作物的遗传改良创造新的种质资源提供了新途径。斯华敏等对国内水稻光温敏雄性不育系的系谱研究得知，农垦 58S 和安农 S-1是大多数光温敏雄性不育系关键来源。分析指出，调控不育的重要基因是在水稻 12 号染色体的 pms3 、 p /t

3、12-1 与位于 2 号的 TMS5 基因。16 1966年，袁隆平首次提出，水稻雄性不育存在于自然界中。4由此拉开了我国水稻杂种优势利用的序幕，掀起了寻找雄性不育株的热潮。 雄性不育水稻通常被划分成细胞核质互作和细胞核雄性不育. 最初找到的雄性不育株都属于细胞核质互作雄性不育, 并由此发展出了三系杂交稻育种体系. 细胞核雄性不育大多属于隐性核不育, 难以找到保持系进行繁殖, 限制了其在育种上的应用. 直到1973年，石明松在晚粳品种农垦58的大田中发现一株天然不育株，这是第一个受环境影响的细胞核雄性不育水稻。此不育株在长日照环境中抽穗开花，花粉败育而雌蕊并没有问题, 造成雄性不育，自交无法结

4、实,然而可以进行异交 ; 在短日照环境中抽穗开花就可以自交结实，表现出对光照敏锐的特点1。 自此开启了光敏感核不育水稻的深入分析, 且在 1 985年经过省级判定顺利定名为“湖北光周期敏感核不育水稻( H S G M R ) 6。上述研究发现和现实应用，使育种家们开始把研究方向从细胞质雄性不育系转到细胞核雄性不育系上.受到石明松发现湖北光敏感核不育水稻的启发，1986年, 福建农学院发现了雄性不育株5460, 认为该雄性不育株属于光敏雄性不育, 温度对其育性有一定的影响, 因此命名为5460S7。湖南杂交水稻研究中心于1987年育成了不育系安农S-1 8. 19 8 9年7月下旬出现持续数日的

5、异常低湿,导致许多所谓的“光敏”不育系，发生育性恢复现象，才逐渐认识到温度对水稻育性的表达和转换起着至关重要的作用。农安S-1，5460S等原先认为的光敏不育系，经过人工气候室育性观察研究鉴定，最终认定为温敏不育系9。研究者开始认识到对两用核不育系育性的控制因素日长与温度结合起来考虑，纯光敏或纯温敏的是片面。水稻两用核不育材料主要是两个主要种类,也就是光敏型与温敏型 , 并且光、温还有互补作用2。光温敏水稻的发现和应用，在人类水稻种植历史上填下了厚重的一笔，开始进入产量高、质量好、效率不断提升的杂交水稻历史，保证我国杂交水稻科技在全球位于领军位置。此水稻的发现和使用给两系法杂交稻打开了更加良好

6、的发展空间。但是, 光温敏核不育性属于明显的生态遗传问题 ,遗传活动不仅受内部基因控制 此外也会受到外界多种生态因子的作用 ,甚至和身处的遗传环境紧密相关50-51。为高效使用光温敏核不育系, 选择更合适的、可以种植使用的光温敏不育系 ,需要对其遗传特点进行全面的研究。虽然贺浩华等早在1987就提出了温度对光敏不育性表达的影响12, 但直到经历了 1 9 8 9 年 的挫折之后, 温度对两用不育系育性转变的效应才引起了人们的足够重视 。1991年，张自国提出，光周期与温度在诱导育性转换中出现明显的互补功能，双方均存在临界值，在温度提高的时候, 诱导不育的临界光长缩短 ; 在光长增加时,临界温度

7、下降15,另外. 袁隆平等对光温作用方式开展进一步健全，光敏核不育系只能在一定温度范围内才具有光敏完全雄性不育的特性, 即长光照 诱导完全雄性不育, 短光照导致不同程度可育; 超过上述温度范畴, 光照长短对育性转换就不具备现实影响, 育性转换存在两个温度闲值, 即长光照完全雄性不育的下限温度和短光照不同程度可育的上限温度 ; 低于下限温 度, 无论长、短光照均 导致不同程度可育; 高于上限温度, 长、短光照均导致完全雄性不育。在光敏温度范畴内, 光长和温度之间互补,换句话说是温度提高, 造成不育临界光长缩短; 假如下降, 造成临界光长延长。13元生朝等利用众多科学研究, 揭示出光照长短是诱导

8、“ 农垦 58 S”育性转变的主导因子, 对光照敏感主要出现在幼穗分化的第二枝梗及颖花花原基分化期到花粉母细胞形成期和后两个时期对育性的诱导作用强于二次枝梗原基分化期, 还存在一定的累积效应11. 敏感部位是叶片, 光受体是光敏色素10安农 S-1是首个被寻找到的籼型水稻温敏不育系,花粉母细胞产生到减数分裂期是其对温度的重要敏感期49。此时是最敏感期。 温度敏感则是位于敏感期的幼穗48。 牟同敏等对5 个温敏核不育系开展对比研究得出多个材料的温敏核不育系其育性转换的温度敏感期与临界温度并不一样，即便是基因来源一样的不育系彼此间会出现显著不同,然而其均蕴含抽穗前的 10 8 d ,也就是众多不育

9、系育性在花粉母细胞减数分裂期对温度最敏感培矮 64S 是通过光敏核不育水稻农垦 58S 作不育基因转育产生的 ,然而其育性呈现出非常明显的温度敏感性。大量研究结果表明，由原始光温敏不育系品种为供体，培育出的一系列籼粳衍生系，它们的育性转换的临界光长和临界温度不尽相同, 并与原始供体相差较大, 说明遗传背景对育性转换条件存在一定的影响.。大部分专家将突出的光温敏核不育水稻农垦 58S 当做分析原料，对主要遗传情况开展研究，然而最终结论表现出不同。依照分析可知，其遗传方式相对繁杂，表现出下面几个类型: 单基因遗传;双 基 因 遗 传 ; 三 位 点 模式等多个遗传模式47 利用对温敏型核不育系安农

10、S -1 的相关分析可知 ，其不育基因属点突变种类, 其不育性受到 1 对隐性核基因管控,此外和农垦 58S 不育基因不等位，23-28.因为安农 S-1的不育性只受 1对隐性核基因影响 ,遗传行为单纯 ，容易转育城全新的优良不育系 ，此外其育性和细胞质没有关系 ,所以配组简单 ,方便选择强优组合斯华敏等。对国内水稻光温敏雄性不育系的系谱研究可知，大多数光温敏雄性不育系重点源自农垦 58S 和安农 S-1。前者被叫做含有光敏不育基因的不育系，重要基因出现在水稻 12 号染色体的 pms3 和 p /t12-1 。后者被叫做含有温敏不育基因的不育系，重要基因出现在 2 号染色体的 TMS5 基因

11、16。Jia 等将“安农 S -1 ×南京 11”F2 群体当做原料,在其中寻找到温敏核不育基因 TMS5 连锁的分子标记 ,且把其定位在第 2 染色体，在标记C365-1与G221-7范围内, 遗传距离主要是1.04 CM与2.08 cM 17 ， Wang等对安农S-1 温敏核不育基因 TMS5 开展深入分析和研究 ,最近标记 C36521 与 G22721 与 TMS5 距离是 1104 cM 与 2108 cM ,创建出 TMS5 所在地区高密度分子遗传图谱19。jiang等人对安农S-1 的温敏不育基因 TMS5 进行定位分析将该基因范围缩小至181 kb，.20 杨 庆

12、凯 等采用安农 S-1 /南京 11、Y58S /Q611 以及Y58S /广恢 122 三个组合的 F2 群体对 TMS5 开展精准定 位， 确定在分子标记4039 1 和4039 2 内19kb的 DNA片段内， ONAC023 基因被确定为 TMS5 的候选基因。182014 年，Zhou 等克隆了安农S-1 和株 1S 的温敏不育基因 TMS5，首次揭示了水稻温敏雄性不育的分子机理。48TMS5编码一个保守的短版本RNase ZS1。TMS5编码区第 71 位碱基由C 突变成 A，造成了株1S和安农S-1中RNase ZS1编码蛋白翻译的提起终止。RNase ZS1具有核酸内切酶活性，

13、可对tRNA前体的3端进行加工，促进tRNA的成熟，但成熟的tRNA丰度在不育系和正常品种间没有显著差异。研究发现RNase ZS1加工的底物为UbL40 ，UbL40基因受高温诱导并在花粉母细胞特异表达，RNase ZS1能将3个UbL40的mRNA加工成多个片段，在水稻温敏不育系中，由于RNase ZS1功能的缺失，使其不能正常加工UbL40，从而导致UbL40 mRNA，过度积累，引起了温敏不育。在常规品种中，RNase ZS1能对UbL40 mRNA降解，不会造成积累，育性正常48研究显示我国 25 个主要使用的两用光温敏核不育系中有 24 个均含有 TMS5 基因，表明 TMS5 基

14、因是控制我国温敏型不育系的主要不育基因，TMS5较PMs3应用更加广泛48。基因编辑技术指能够实现人类对目标基因组的特定基因片段进行插入、删除、替换或修饰的新兴分子生物学技术。该技术能定位点切割产生 DNA 双链断裂（DNA double strand breaks，DSBs），进而出现同源重组（Homology directed recombination repair，HR）与非同源末端连接（Non-homologous endingjoining，NHEJ）修复体制，完成对基因组的定点编辑。32CRISPR/Cas9基因编辑技术是继锌指核酸酶 ZFNs 和 TALENs 后的新型高效定点

15、编辑的新技术，具备费用较少，科技要求不高，方便直接，试验时间短等优势，被当做是目前发展空间良好的基因编辑科技。33CRISPR 结构从寻找到到功能明确总共经历二十年，近期其主要结构与作用特点开始更加清晰。1987 年，国外专家 Nakata等在大肠杆菌内寻找到的特定重复序列， 基因的编码序列附近存在5个高同源序列，此外每个都包含29个碱基，上述序列内被32个碱基分割，但当时他们还不清楚其具体功能23。Mojica等寻找到上述重复序列普遍出现在细菌与古细菌内。242002年， Jansen等人和Mojica共同同商议，把上述序列叫做Clustered Regularly In

16、terspaced Palindromic Repeats, 也就是CRISPR。262005 年 ，众多分析组织得出CRISPR间隔序列和噬菌体或质粒等外源DNA序相对应,他们也推测和假设这些CRISPR的spacers可能在执行防御机制.28-30直到2007,Barrangou 等表明CRISPR系统可以在细菌内具备获得性免疫的作用。27到2008年，美国西北大学的Luciano Marraffini等证实CRISPR的目标是DNA,CRISPR可以被设计后，利用在其他异源性系统内进而进行基因组编辑.2012年8月，Doudna与Charpentier两个团队合作,这利用CRI

17、SPR/Cas系统在体外对DNA进行精确切割,此分析把 CRISPR/Cas 从细菌的天然免疫系统发展成DNA编辑方式，为此科技的未来发展准备了良好的理论基础。342013年，Feng Zhang团队利用 CRISPR/Cas 系统对人类细胞进行基因组编辑。35至此，CRISPR/Cas9 基因编辑技术成为了人们瞩目的焦点，在生命科学领域掀起了新一轮的科技发展。分析得出，大概百分之四十的细菌与百分之九十的古细菌均包含CRISPR系统，也就是自身免疫系统，可降解进入的病毒或质粒 DNA25。CRISPR系统主要包含重复、间隔、Cas基因编码、前导四部分序列。重复序列(Repeats)由25-50

18、 个碱基对组成，可以产生发卡构造(Hair Loop)，间隔序列(Spacer)大概是26-72个碱基对，其具体位置在上述序列内。CRISPR位点上游萌生前导序列(Leader sequence)，被当做此序列的启动子负责进行CRISPR转录。此外，在上游也存在多态性的家族基因，和CRISPR序列区域共同发挥影响，被当做CRISPR关联基因（CRISPR associated，Cas）Cas 基因编码一类保守的核酸有关的蛋白，和CRISPR序列一起进化，形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。37-39Makarova 等系统发育及作用的分子机制把CRISPR/Cas系统划分成不同种

19、类（型、型和型）2：型系统内 Cas 蛋白较多，其重点是Cas3 蛋白，其具备 DNA 核酸酶与解旋酶作用，此外需要 Cas5、Cas7 等众多 Cas 蛋白辅助激发影响，型系统在细菌与古细菌中均能看到；型系统的突出特点是涵盖比较突出的Cas9 蛋白参加 crRNA的成熟和降解进入的噬菌体 DNA 或是外源质粒，型系统存在于细菌中，；型系统其特征性蛋白为具有 RNA 酶活性的 Cas10 蛋白，同时需要 Cas6 等多种蛋白，型系统多存在于古细菌中，只有少数的细菌是型系统。40CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵。在病毒或者外源质粒进入细菌与古细菌时，外

20、源核酸短片段被汇总到CRISPR 簇。在其第二次进入细菌时，CRISPR 被转录为 pre-crRNA，之后被 Cas 内切酶加工变成下 crRNA，继而和 Cas 蛋白融合产生 Cas/crRNA 作用复合体，通过不同机制引导 相关Cas 核酸内切酶对外源 DNA 序列进行切割降解。44-46II型CRISPR/Cas9系统是使用宽泛的CRISPR/Cas系统，只需Cas9 蛋白、crRNA 与反式激活crRNA三部分就可以对外源 DNA 进行靶向裂解。在外源DNA序列的原间隔序列( protospacer ) 下游出现比较保守的 基 序( protospacer adjacent moti

21、fs，PAMs) 参加 Cas 蛋白对外源 DNA 的辨别中31。 crRNA利用碱基配对和 tracrRNA结合形成 tracrRNA/crRNA双元复合体，此复合体引导内切酶 Cas9 蛋白在和crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA利用有关研发改变上述 RNA，可得到单个具备引导功能的sgRNA（single-guide RNA），足以引导 Cas9 核酸酶对 DNA 开展定点切割进而出现 双链断裂( DNA doublestranded break，DSB)通过细胞本身修复体系出现非同源末端连接 ( non-homologous end joining，NHJ ) 或 同 源 重 组 ( homology directe