高三尖杉酯碱对人白血病细胞JAK2-STAT5相关信号通路的影响及其机制的研究

1、.浙 江 大 学 医 学 院 2 00 6 级 硕 士 研 究 生 毕 业 论 文高 三 尖 杉 醋 碱 对 人 白 血 病 细 胞JA KZ一ST ATS信 号 通 路 的 影 响 及 其 机 制 的 研 究浙 江 大 学 医 学 院内科 学( 血 液 病 )20 06 级 硕 士 研 究 生任 艳 玲导师侮 红 艳副 主 任 医 师摘要许 多 细 胞 因 子 和 生 长 因 子 通 过 J AK / S TA T 途 径 传 导 信 号 ， 其 中 JA KZ 与 造 血 关 系 最 为 密 切 ，S T A TS ( 信 号 转 导 子 与 转 录 激 活 子 ) 是 JA KZ 最 主

2、 要 的 下 游 信 号 蛋 白 。 S T A T S 被 JA KZ 磷 酸 化 后 形 成 二 聚 体 ， 进 入 核 内 ， 调 节 相 关 基 因 的 转 录 ， 维 持 细 胞 的 生 长 分 化 与 增 殖 。急性 髓 系 白血 病 常 与 染 色 体 异 常 以及 致癌 蛋 白的形 成 密 切 相 关 ，它们 激 活恶 性 细 胞 存 活 与 增 殖 的 信 号 转 导 途 径 。在 这 些 信 号 转 导 途 径 中 ，某 些 基 因 的 过 渡 表 达 或 突 变 引 起 的 JA KZ 一ST AT S 信 号 途 径 的 持 续 激 活 对 髓 系 原 始 细 胞 的

3、恶 性 转 化 犹 为 重 要 ， 因 此 药 物 阻 断 J A KZ 一S TA TS 信 号 途 径 进 而 抑 制 A M L 细 胞 的 恶 性 增 殖 己经 成 为 A ML 靶 向 治 疗 的 重 要 组 成 部 分 。高 三 尖 杉 醋 碱 是 一 种 具 有 抗 白血 病 活 性 的 植 物 碱 ， 自二 十 世 纪 七 十 年 代 以 来 ，在 中 国 己经 广 泛 应 用 于 急 慢 性 白血 病 和 骨 髓 异 常 增 生 综 合 症 的 治 疗 ，并 取 得 显 著 疗 效 。尽 管 几 个 细 胞 学 事 件 己经 确 定 与 其 抗 白 血 病 效 应 相 关 ，

4、 包 括 : 抑 制 蛋 白合 成 和 端 粒 酶 活 性 ， 下 调 Mc l一1，S ur v iv in ， 内 皮 生 长 因 子 等 与 细 胞 的 恶 性 密 切 相 关 的 因 子 的 表 达 ，上 调 前 凋 亡 蛋 白 B a x 的 表 达 和 C as p as e 一3 介 导 的 PA 即 的 剪 切 等 等 ，但 H HT 对 J A K Z 一S T A T S 信 号 转 导 通 路 的 影 响 的 相 关 研 究 尚 未 见 报 道 。我 们 的 研 究 中 ， 分 离 A M L 病 人 骨 髓 单 个 核 细 胞 ， 与 0 ， 2 0 ， 4 0 ， 8

5、 0 n g / m l 的 H H T 共 同 培 养 4 8 小 时 后 采 用 M T T ( 3一 ( 4 ，5 一d 1m e t h y l t h ia z o l一2 一y l ) 一2 ， 5一d ip h e n y l t e lr a 一z o l iu m b r om id e ) 比 色 法 观 察 H H T 对 A M L 原 代 细 胞 的 生 长 抑 制 作 用 ， 结 果 发 现 : H HT 对 A M L 病 人 原 代 细 胞 具 有 显 著 生 长 抑 制 作 用 ， 呈 浓 度 依 赖：浙 江 大 学 医 学 院 2 0 0 6 级 硕 士 研

6、 究 生 毕 业 论 文性 (20 ， 4 0 ， 8 0 n g /m l 的 H H T 的 抑 制 率 分 别 为 16 .4 9 士 2 . 7 0 % ， 2 4 . 8 1 士 5 .4 9 % ， 47 .58 士4 . 3 1 % ) ，对 健 康 者 骨 髓 抑 制 作 用 不 明 显 (抑 制 率 分 别 为 5 .56 士 1. 37 % ，7.4 1 士2 . 13 % ，12 . 0 4 士 3 .2 1 % ) 。进 一 步 研 究 H HT 对 A M L 细 胞 株 H E L ，K 56 2 ，H L 一6 0 的 生 长 抑 制 作 用 :H H T 对 H

7、 EL 作 用 48 小 时 的 半 数 抑 制 浓 度 ( IC 50 )为 64 . 74 ng /m1 ， 对 K 5 6 2 细 胞 的 半 数 抑 制 浓 度 为 1 16 .s ng /m1 ，H L 一60 为 77 .3 ng /ml . 我 们 同 时 也 观 察 了 H H T 对 H E L 细 胞 的 诱 导 凋 亡 作 用 : 0 ， 10 ， 2 0 ， 4 0 ， 8 0 ， 16 O n g /m 1H H T 处 理H E L 48 小 时 后 ， 4 O n g /m l 的 H H T 作 用 即 开 始 产 生 D NA la d d er ， 随 着

8、H H T 浓 度 的 增 加 ， 产 生 的 条 带 越 多 . 流 式 细 胞 仪 检 测 发 现 : O ， 10 ， 20 ， 40 ， 8 0 ng / m1 HH T 作 用 H E L 细 胞 2 4 h 后 p l 及 A n n e x in v 染 色 ， H H T 诱 导 H E L 细 胞 凋 亡 呈 浓 度 依 赖 方 式 ， 10 ，2 0 ，4 0 ， 8 0 n g /m l 组 细 胞 凋 亡 率 分 别 为 5 . 14 士0 . 28% 、 10 . 58 士0 .2 2% 、 2 4 .4 士2 .0 1% 及 39 .61 士 2 . 6 6% ，

9、均 明 显 高 于 对 照 组 (l . 51 % ) .早 期 的 研 究 发 现 ， 慢 性 粒 细 胞 白 血 病 细 胞Bc r 一Ab l融 合 蛋 白 能 激 活 JA K Z 一ST A T S 信 号 途 径 ， 甚 至 MA P K ， P I 3K 等 生 长 途 径 。 JA K ZV 6 17 F 突 变 在 M PD 病 人 中 能 引 起 多 种 信 号 途 径 的 组 成 性 激 活 (JA K 一S TA T ，MA PK ，PI 3 K) 等 ， 其 中 主 要 是 ST AT S ，被 JA KZ 磷 酸 化 激 活 后 能 激 活 多 种 基 因 的 转

10、录 ， 包 括 B c l一x l，一 种 过 渡 表 达 于 PV 患 者 红 系 祖 细 胞 的 抗 凋 亡 蛋 白 ， 在 细 胞 增 殖 和 存 活 方 面 起 重 要 作 用 。我 们 假 设 H H T 主 要 在 蛋 白水 平 影 响 JA K Z一ST A T S 信 号 转 导 途 径 。W e st er n b l。t 检 测 了 H H T 对 JA KZ 一S TA TS 信 号 途 径 中 蛋 白表 达 的 影 响 。 结 果 显 示 : 不 同 浓 度 的 HH T 作 用 AM L 原 代 细 胞 ， H EL ，K 5 6 2 6 小 时 后 ， JA K Z

11、 ，S TA T S 总 蛋 白水 平 无 显 著 改 变 ， 但 其 磷 酸 化 水 平 明 显 下 调 ， 且 呈 浓 度 依 赖 性 (K 5 6 2 细 胞 中 ， J A KZ 表 达 也 下 调 )。 而 RT 一PC R 结 果 提 示 JA KZ ，S T A TS 在 mR NA 水 平 都 无 改 变 。 进 一 步 的 研 究 显 示 : 6 小 时 后 ，H E L 中 B c l一x L 的 表 达 无 变 化 ，而 将 时 间 延 长 致 24 小 时 后 ，B C I一xL 表 达 下 调 ， 在 m RN A 水 平 也 呈 浓 度 依 赖 性 下 调 。试 验

12、 结 果 初 步 提 示 : H HT 是 通 过 抑 制 蛋 白 酪 氨 酸 激 酶 ( P T K) 的 活 性 阻 断 J A K Z 一S T A TS 信 号 通 路 的 磷 酸 化 ，进 而 抑 制 与 细 胞 恶 性 增 长 相 关 的 通 路 达 到 抑 制 增 长 和 诱 导 凋 亡 的 。由 于 A M L 原 代 细 胞 及 细 胞 株 中 也 都 有 MA PK 和 P I3 K 途 径 的 激 活 ， 我 们 也 同 时 观 察 了 H HT 作 用 于 H EL ，K 5 6 2 细 胞 株 后 这 两 个 信 号 通 路 在 蛋 白 水 平 的 变 化 。 结 果

13、 发 现 : 不 同 浓 度 的 H H T 作 用 HE L ，K5 62 细 胞 后 ，在 A KT ，E RK I/2 总 水 平 恒 定 的 情 况 下 ， A K T 的 磷 酸 化 水 平 呈 剂 量 依 赖 性 下 调 ， 可 能 与 J A KZ 是 通 过 BC R 一A B L /.TA KZ / G ab Z / P I3 K / A K T 网 络 调 节 A K T 活 性 相 关 ，当 J A KZ 活 性 受 到 抑 制 时 ，浙 江 大 学 医 学 院 200 6 级 硕 士 研 究 生 毕 业 论 文AK T 的 磷 酸 化 水 平 也 下 调 。 但 E R

14、 K I/ 2 的 磷 酸 化 水 平 则 无 显 著 变 化 ， 具 体 机 制 尚 不 清 楚 ， 或 许 其 他 的 锚 定 蛋 白 如 Gr bZ ，G ab Z 等 也 参 与 E RK I/2 活 性 的 调 节 有 关 。 为 了 进 一 步 证 实 H HT 是 通 过 抑 制 J A K Z 一S T A TS 通 路 的 信 号 蛋 白 酪 氨 酸 磷 酸 化 实现 其 效 应 的 ， 我 们 观 察 J A KZ 特 异 性 抑 制 剂 A G 4 9 0 单 独 以 及 与 H HT协 同 作 用 HE L ，K5 6 2 细 胞 的 效 应 。结 果 发 现 :AG

15、490 单 独 以及 与 H HT 共 同 作 用 这 两 种 细 胞 后 ， 均 能 诱 导 凋 亡 ，wB 检 测 也 发 现 ， HE L 中 ， JAK Z ，ST AT S 磷 酸 化 水 平 下 调 ， 而 K 56 2 细 胞 株 中 ， J A K Z 磷 酸 化 水 平 下 调 ， 但 S T A TS 的 磷 酸 化 无 显 著 变 化 ， 可 能 与 K 5 6 2 细 胞 株 中 J A KZ 和 S T A T S 是 由 B c r / A bl 分 别 激 活 有 关 。 也 进 一 步 提 示 H HT 不 仅 只 作 用 于 J A KZ ， 而 是 作 为

16、一 种 广 谱 的 PTK 抑 制 剂 在 阻 断 JA KZ 一S T A T 相 关 信 号 通 路 中 发 挥 作 用 。综 上 所 述 ，我 们 的研 究 结 果 表 明 : ( 1 ) HH T 对 急 性 髓 系 白血 病 原 代 细 胞 以及 细 胞 株 H EL ，K5 62 和 HL 一60 细 胞 有 显 著 的 生 长 抑 制 作 用 。 这 种 生 长 抑 制 作 用 呈 剂 量 依 赖 性 。 (2 ) 10 n g / m 1H H T 即 可 诱 导 H E L 的 早 期 凋 亡 ， 10 ， 2 0 ， 4 0 ， 8 0 n g /m l 组 细 胞 凋 亡

17、 率 分 别 为 5 . 14 士 0 . 28% 、10 .5 8 士 0 .2 2% 、2 4 . 4 士 2 . 0 1% 及 3 9 .6 1 士2 .6 6% ，均 明 显 高 于 对 照 组 (1 . 5 1%).但 DN A la d d er 发 现 在 4 0 ng /m1 时 开 始 出现 凋 亡 条 带 ， 且 HH T 浓 度 越 大 ， 凋 亡 条 带 越 多 。 (3) 不 同 浓 度 的 H H T 作 用 A M L 原 代 细 胞 ， H E L ，K 5 62 6 小 时 后 ， J A K Z ，sT A T S 总 蛋 白水 平 无 显 著 改 变 ，

18、但 其 磷 酸 化 水 平 明 显 下 调 ， 且 呈 浓 度 依 赖 性 (K5 62 细 胞 中 ，JA KZ 表 达 也 下 调 )。 而 RT- PC R 结 果 提 示 JA K Z ，S TA T S 在 m RN A 水 平 都 无 改 变 。进 一 步 的 研 究 显 示 : 6 小 时 后 ，H E L 中 B c l一xL的 表 达 无 变 化 ， 而 将 时 间 延 长 致 24 小 时 后 ， B d 一xL 表 达 下 调 ， 在 mR N A 水 平 也呈 浓 度 依 赖 性 下 调 。此 外 ，经 不 同 浓 度 HH T 作 用 6 小 时 后 HE L 与 K

19、5 62 细 胞 中 A KT 的 磷 酸 化 水 平 都 下 调 ， 但 E RKI /2 磷 酸 化 无 显 著 变 化 。 (4) JA KZ 特 异 性 抑 制 剂 AG 49 0 单 独 以及 与 HH T 共 同 作 用 这 两 种 细 胞 后 ，均 能 诱 导 凋 亡 ，WB 检 测 也 发 现 ， H E L 中 ，J A K Z ，S T A T S 磷 酸 化 水 平 下 调 ，而 K 5 6 2 细 胞 株 中 ，J A K Z 磷 酸 化 水 平 下 调 ， 但 S TA TS 的 磷 酸 化 无 显 著 变 化 。关 键 词 : 急 性 髓 系 白 血 病高 三 尖

20、杉 醋 碱 JA KZ ， S T A T S ， AG 4 90 ， 酪 氨 酸 蛋 白激 酶浙 江 大 学 医 学 院 2 0 0 6 级 硕 士 研 究 生 毕 业 论 文H o m h a r r in g to n in e a ffe e ts th e JAKZ一S T A T S a s s o e ia te dP a th w a y in a e u te m y lo id le u k e m ia c e lls a n d its m o le e u la rm e C h a n is mA b s t r a e tD e P a r tm e n t o

21、f H e m a to lo gy， I n te r n a l Me d ie in e ，M ed iea l C o lleg e，Z h ejia n g U n iv ersityP o s tg r a d u a te :R e n Ya n lin gS u P e rv is o r :Vi e e P ro L To n g H o n gy a nM an y cyto k in e s an d g ro wt h fac to rs tran sd u et sig na l thro u g h JA Kj S IA1，(Janu sk in a se /sig

22、 n al tran sd u e ers an d aetiv ato rs o f tran seriP tio n ) P ath w ay， am o n g wh ieh ，J A K Z 15 m o s t re la tiv e to h e m a to P o ie s is . S lr A I，5 15 th e m a in d o w n st re a ms ig n a l P r o te in o f J A K Z ，a n d b e e n P h o sP h o r y la te d b y J A K Z ，th e n d im e r iz

23、 e a n d e n i e r in i o t h e e e lln u e le u s ，th u s re g u la tin g th e t ra n s e r iP tio n o f re le v a n i g e n e a n d su P P o r tin g th e g r o w t h ，d if fe re n i io n a n d P ro lif era tio n o f t h e e e lls .A M L 15 f re q u e n i ly a s so e ia te d w i t h e h r o m o so

24、m a l a b n o r m a litie s a n d o n e o g e n ie P ro te in s f o r m in g ， w h ie h a c tiv a te d s ig n a l t ra n s d u e tio n P a th w a y s in v o lv e d in th e su rv iv a l a n d P ro lif era tio n o f th e m a lig n a nt e e lls . A m o n g w h ie h ，e o n stit ut iv e a c tiv a tio no

25、f J A K Z 一S 护m L Tsb yo v e re x P re s s io no r m u t a tio nw a s e s P e c ia llyim P o r ta nttoth em a lig n a nttra n s f o r m a tio n o f A M L b la sts . P h a nna e o lo g ie in h ib itio n o f J A K Z 一S T A I，to a b r o g a te A M L e e ll P ro lif era tio n m a y t h e re f o re re P

26、r e s e n i a n im P o r ta n t P a rt o f ta rg e te dA M L t h e ra P y .H o m o h 盯 in gto n in e (H H T ) 15 a P lant a lk alo id w ith ant ileuk em ia activ ity th at h a sb e e n u s e d f o r t re a tm e n i o f a e u t e le u k e m ia ，e h r o n i e le u k e m ia ，a n d m y e lo d y sP la st

27、iesyn d rom e (M D S ) sin ee 19 7 0 ，5 in C hin a，an d b e 51加 fieanteffe ct. A ltho u gh sev eral e e llu la r e f fe e ts h a v e b e e n id e n i if ie d ，in e lu d in g t h e il ili ib itio n o f P r o te in s y n i h e s is a n d te lo m e ra s e a e tiv ity ，d o w n 一r e g u la tio n o f M C

28、L 一l ，S u rv iv in a n d V E G F w h ie h a r e e lo s er e le v a n t to th e m a lig n a n e y o f th e e e lls ， u P r e g u la tio n o f P ro 一a P o P to tie b a x a n d in d u e in g ea sP a se 一3 一m ed iated e le av ag e o f P o ly (A D P 一rib o se) P o ly m erase (PA RP ). B ut th e in f lu e

29、 n e e o n J A K Z 一5 1 A I2 P a th w a y o f H H T h a s n o t b e e n re P o r te d .In o u r st u d y ， th e P r im a ryb la sts o f A e u t e m y lo g e n o u s le u k e m ia P a tie n i s h a v eb e en seP erate d an d th en in e u b ated w ith H H T wi th d iffe reni c o n ce niratio n (0 ，2 0

30、 ，4 0 ，浙 江 大 学 医 学 院 2 0 0 6 级 硕 士 研 究 生 毕 业 论 文8 0 n g /m l) for 4 8 hr， the ee ll surv iv a l rate s we re te sted b y M T T . We foun d that: H H T o b v io u s ly in hi b ite d t h e P r o lif er at io n o f A M L P r im a ry e e lls a n d s h e w a c o n e e n tra tio n 一d e P e n d e n t m a n

31、n e r ( t h e in hi b itio n r at e s w e re 1 6 . 4 9 士 2 . 7 0 % ， 2 4 . 8 1士 5 . 4 9 % ， 4 7 . 5 8 士 4 . 3 1 % r e s p e e t i v e l y i n e a e h e o n e e r n t r a t i o n g r o u p ) ，b utn o t sig n ifeant effe et o n h ealt抑 B M eells(the inh ib itio n rates we re 5 . 5 6 土 1. 3 7 % ，7 . 4

32、1 士 2 . 13 % ，12 . 0 4 士 3 . 2 1 % in t h e 2 0 ，4 0 ，8 0 n g / m l g r o u p r e s p e e t i v e l y ) .Wea lso o b s e r v e d t h e e f fe e t o f H H T o n A M L e e ll lin e s H E L ，K 5 6 2 a n d H L 一6 0 ，W 七 f o u n d th at 5 0 % inh ib itin g co n een tratlo n (IC 5 0 ) o f H H T o n H E L

33、，K 5 6 2 an d H L 一6 0 are 64 .74 n 留m l，116 .sn 岁m l an d 7 7 .3n g加 1 resPeetiv ely for 4 8 hr. A t th e sam e tim e，a P o P to s is in d u e tio n o f H H T o n H E L a lso b e e n o b s e r v e d : a f te r b e in g in e u b a te d w ith H H T at o ，10 ，2 0 ，4 0 ，80 ，16 0n 留m l，帅 ieal D N A lad

34、d er aP P eare d at 4 0 n 留m l，an d w ith th e in e rea se o f the e o n e e 血 atio n o f H H T，D N A lad d e r in c rea se d to o . W h ile inth e o uteo m e o f F C inv e stig ation ，0 ，10 ，2 0 ，4 0 ，80 n 留m l H H T we re ad d ed inio theH E L ee lls an d eu ltur ed for 2 4 hr， an d the n b e sta

35、in ed b y A n n ex in一v an d P l，th e 即 o pto sis Sh ew a co n cen tratio n 一d ep en d eni m ann er，in 10 ，2 0 ，4 0 ，s on 岁m l g ro即 ，the a P o P to s is r at e w e r e 5 .1 4 士0 .2 8 % 、 1 0 .5 8 士0 .2 2 % 、 2 4 .4 士2 .0 1 % a n d 3 9 .6 1 士2 .6 6 %resp ectiV el苏 an d all w ere h igh er than th e e

36、oniro l(1.5 1% ). (p < 0 .0 5 )In t h e e a rl y stu d y ， r e s e a rc h e rs f o u n d t ha t t h e in f u sio n P ro te in B e r /A b l e o u ld a c tiv a te d J A K Z 一S 飞A 1，5 P a th w a y， e v e n M A P K a n d P I3 K P a th w a y in v o lv e d in th e g r o w t h in t h e e h r o n ie m y

37、e lo id le u k e m ia e e lls ， a n d J A K Z V 6 1 7 F m u t a tio n in t he P a tie n ts w i th m y e lo P ro lif era tiv e d ise a se e o u ld a lso e o n stit ut iv e a c tiv a te d m u ltiP le e e llsig n al P ath w a y in v o lv ed in the g rowt h (JA K 一5 1A1几M A P K an d P I3 K an d 50 o n )

38、，a m o n gw h ie h ， 5 1 A I515 th em a inP r o te in ， a n de o u lda e tiv a te a n dre g u la te t he tra n s c riP tio n o f m u ltiP le g e n e s a f te r b e in g a c tiv a te d b y J A K Z ，in e lu d in g B c l一x L ，a ant iaP o P to tie P ro te in o v e rex P resse d in th e P ro g e n ito r

39、e e lls o f P atie nis w ith P o lyth e m ia v e r a a n d P la y e d a n im P o r ta n t ro le in t h e s u rv ia l a n d P r o lif er at io n o f t h e e e lls . W e su P P o se d th atH H T a f fe e t th e J A K Z 一5 1 谈L TS P a th w a y m a in ly a t th e P ro te in le v e l a n d u s e d W e st

40、e mb lo t to in v e stig a te g t h e in f lu e n e e o f H H To n P r o te in e x P r e s s io n o fJ A K Z 一S 毛 灯 5 . T h e re s u lts sh e w t h a t : a f te r A M L P r im a ry e e lls ，H E L a n d K 5 6 2 e e lllin e s b e in g e u ltu r e d w it h d if fe r e n i e o n e e n tr a tio n o f H H

41、 T f o r 6 h o u r s ，th e to ta l P r o te in le v e l o f J A K Z a n d 5 1 A 1，5 d id n o t e h a n g e ， b u t t h e P h o sP h o r y la tio n d e c re a s e do b v io u sly an d in a eo nc entr atio n-d eP en d ent m a n n er(in K 5 6 2 e e lls， JA K Z a lsod e erea se d ). W h ile in R l-P C R

42、 ，We foun d that there we re n o ch an g e s in the e x P re ssio n浙 江 大 学 医 学 院 2 0 06 级 硕 士 研 究 生 毕 业 论 文o f J A K Z a n d s 毛 钉 5 m R N A . B e s id e s ，B c l一x l a ls o sta b le a f te r b e in g a f fe c td b y H H T in H E L ，b ut wh e n it h a s b een P ro lo n g ed to 2 4 hr， B e l一x L d ee

43、 rea sed ，50 d id in m R N A le v e l. T h e se re su lts P r ilim in a ri ly su g g e s te d t h a t H H T b lo e k s t h e P h o sP h o r y la tio n o fJA K Z 一5 1 A1，5 thr o u g h inh ib itin g the P ro te in tyr o sin e k in a se ac tiv ity， thu s inh ib itingt h e tra n sd u e tio n o f t h e e

44、 e ll sig n a 1 P a th w a y a s so e ia te d w it h m a lig n a nt P ro lif er at io n o fe e lls a n d in d u e in g a P o P to s is .A s M A P Ka n d P I3 KP a th w a y s a ls o a e tiv a te d in m o st A M LP a tie n i s a n d a r eim P o r ta nt tra n sd u e tio n P a th w a y in v o lv e d in

45、th e su rv iv a l a n d P ro lif er at io n o f m a lig n a nt e e lls ，W e st u d ie d th e e f fe e t o f H H T o n P h o sP h o r y la te d a n d to ta l E R K I /2 an d A k t a e tiv ity in th e m y e lo id le uk e m ia e e ll lin e s.即 d we fo un d that P 一A k t alsod ownr eg u lated wh ile th

46、e total A k t wa s eo n stant . S o m e researeh ers foun d th at jakZp lay s a critical ro le in the 51助 al transd u etion thro u gh b er-ab l/ jakZ /g ab Z/Pi3k/akt n etwo rk，an d that wh en the aetiv ity o f jak Z wa s inh ib ited ，th at o f aktw as restri eted s im u lta n e o u s ly . W h ile n

47、 o a P P re c ia b le sP e e if ie e f fe e ts o f H H T o n E R K I /2 in H E L ， K 5 6 2 a n d P r im a ry e e lls ，t h e e le a r m e c h a n ismr e m a in s u 川 m o w n ，m a y it b e a s s o e ia te dwi th th e in v o lv em eni o f o th er ad aP tor P rotein s su eh as G ab Z an d G rbZ in regul

48、 atin gth e ac tiv ity o f E R K I/2 .In o rd e r to c o n f ir mt h e 即 o P to s is e f fe c t o f H H To n A M L e e lls w e r e th ro u g h in h ib itin g th e P h o sP h o r y la tio n o f J A K Z 一S T A T S ，A G 4 9 0 w asu s e d in H E L a n d K 5 6 2e e lls to s e e if J A K Z in h ib itio n

49、b y u s in g sP e e if ic J A K Z k in a s e il ili ib ito r e o u ld in d u e e sim ila r le v e ls o f a P o P to s is s e e n w it h t h e H H T . W e f o u n d t h a t : A G 4 9 0 a lo n e a n d b e c o m b ine d w ith H H T b o th e o u ld in d u c e aP o Pto sis. hi w e ste m b lo t test， the

50、P h o sP h o r y la tio n o f J A K Z a n d S T A T S d e e r e a s e d in H E L . W h ile in K 5 6 2 ， t heP h o sP h o r y la te d 一J A K Z d o 姗 e g u la te d b u t P h o sP h o r y la te d 一S T A T S w a s sta b le ，it e o u ld b e e a n s e in K 5 6 2 e e lls J A K Z a n d S T A T S w e re a e

51、tiv a te d b y B e r /A b l s e P e r at e ly . T h i sresu lt eon firm s that H H T acts as a wi d e sP eetru m P TK inhi b ito r n o m o re than jakZk in a s e in h ib ito r in o u r s t u d y .B ased o n the resu lts ab o v e ，co n elu sio n s co u ld b e b rou g ht forward . (l) H H T eo u ldn o

52、 ta b ly in hi b it t h e g r o w t h o f A M L P r im a ry e e lls a n d H E L ，K 5 6 2 ，H L 一6 0 e e ll lin e s ，an d this g rowt h inh ib itio n wa s tim e an d d o se d eP en d ent. (2 ) 10 n g 加 IH H T eo u ldin d u e e t he a P o P to s is o f H E L e e lls ，t h e 即 o P to s is ra te o f H E L

53、 in 1 0 ，2 0 ，4 0 ，8 0 n g /m l g ro u P ， th e a P o P to s is ra te s w e r e 5 .1 4 士0 .2 8 % ， 1 0 .5 8 土0 .2 2 % ， 2 4 .4 士2 .0 1 % a n d3 9 .6 1士2 .6 6 % resP eetiv e ly， an d all we re h ig h er than th e co ntr o l (1.5 1% )(P < 0 .0 5 ).W h ile inv e stig atin g th e aP o Pto sis b y D N A lad d er o b serv atio n ，W e foun d th at浙 江 大 学 医 学 院 2 00 6 级 硕 士 研 究 生 毕 业 论 文ty P ie a l D N A la d d e