生物检定定量技术

1、生物检定定量技术 抗生素药物在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有抗生素药物在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用，与化学药物相比，具有化学纯度较低、活性特异抑制作用，与化学药物相比，具有化学纯度较低、活性组分易发生变异、稳定性差等特点组分易发生变异、稳定性差等特点 。微生物检定法是在适宜。微生物检定法是在适宜的条件下，通过检测抗生素药物对微生物的抑制作用，计算的条件下，通过检测抗生素药物对微生物的抑制作用，计算抗生素效价的方法。该方法的测定原理能直接表示抗生素对抗生素效价的方法。该方法的测定原理能直接表示抗生素对微生物的作用，是其他物理学方法或化学方法所不能达到的，微生物的作用，

2、是其他物理学方法或化学方法所不能达到的，目前各国药典仍多数采用这一方法。依据设计原理不同，可目前各国药典仍多数采用这一方法。依据设计原理不同，可分为稀释法、浊度法和琼脂扩散法。后二者被列为抗生素微分为稀释法、浊度法和琼脂扩散法。后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。生物检定的国际通用方法。中国兽药典中国兽药典首选方法是管碟首选方法是管碟法。法。 一、生物检定法概述一、生物检定法概述二、管碟法二、管碟法 当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散的中心浓度高而边缘浓度由高到低的自然梯度，即扩散的中心浓度高而边缘浓度低

3、。在抗生素浓度高于度低。在抗生素浓度高于MIC（最低抑制浓度）时，试（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。抗验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（或面生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（或面积）呈线性关系。积）呈线性关系。 1.原理原理生物检定定量技术二、管碟法二、管碟法 将未知效价供试液与已知效价的标准液，在同一条将未知效价供试液与已知效价的标准液，在同一条件下，抗生素在培养基内的扩散到达适当范围内产生了件下，抗生素在培养基内的扩散到达适当范围内产生了抑制试验菌生长的透明抑菌圈，经比较供试液和标准液抑

4、制试验菌生长的透明抑菌圈，经比较供试液和标准液两者产生的抑菌圈直径（面积）的大小，计算出供试品两者产生的抑菌圈直径（面积）的大小，计算出供试品的效价。的效价。2.方法方法生物检定定量技术二、管碟法二、管碟法 二剂量法是最常用的一种方法，系将供试品和标准二剂量法是最常用的一种方法，系将供试品和标准品分别配制成高低两个浓度，高低浓度的比值（称为剂品分别配制成高低两个浓度，高低浓度的比值（称为剂距）为距）为21或或41，在每个双碟内放置，在每个双碟内放置4个小钢管，对个小钢管，对角的两个小钢管内分别滴装高浓度和低浓度的标准品溶角的两个小钢管内分别滴装高浓度和低浓度的标准品溶液，其余两个小钢管分别滴装

5、高浓度和低浓度的供试品液，其余两个小钢管分别滴装高浓度和低浓度的供试品溶液，在规定条件下培养后进行测定比较。溶液，在规定条件下培养后进行测定比较。2.方法方法生物检定定量技术 供试品效价相当于标示量或估计效价的百分数为：供试品效价相当于标示量或估计效价的百分数为：%100log112212121ISTSTSSTTP P P为供试品效价（相当于标示量或估计效价的百分数）；为供试品效价（相当于标示量或估计效价的百分数）；S S2 2为高浓度标准品溶液所致抑菌圈直径（或面积）总和；为高浓度标准品溶液所致抑菌圈直径（或面积）总和；S S1 1为低浓度标准品溶液所致抑菌圈直径（或面积）总和；为低浓度标准

6、品溶液所致抑菌圈直径（或面积）总和；T T2 2为高浓度供试品溶液所致抑菌圈直径（或面积）总和；为高浓度供试品溶液所致抑菌圈直径（或面积）总和；T T1 1为低浓度供试品溶液所致抑菌圈直径（或面积）总和；为低浓度供试品溶液所致抑菌圈直径（或面积）总和；I I为高浓度与低浓度比值的对数值（即剂距的对数值）。为高浓度与低浓度比值的对数值（即剂距的对数值）。生物检定定量技术 将此百分数乘以供试品估计的效价数，即得供试品将此百分数乘以供试品估计的效价数，即得供试品每每1mg1mg中所含的单位数（中所含的单位数（U/mgU/mg）。）。供试品的效价数（供试品的效价数（Pr）估计效价数（）估计效价数（Ar

7、）P 本法计算所得效价，如低于估计效价的本法计算所得效价，如低于估计效价的90或高于估计效价或高于估计效价的的110时，则应调整其估计效价，予以重试。时，则应调整其估计效价，予以重试。生物检定定量技术（1 1）称量）称量 （2 2）稀释）稀释 （3 3）双碟的制备）双碟的制备 培养基底层的制备培养基底层的制备培养基菌层的制备培养基菌层的制备（4 4）放置小钢管）放置小钢管 （5 5）滴加抗生素溶液）滴加抗生素溶液 （6 6）培养）培养 （7 7）抑菌圈测量）抑菌圈测量 （8 8）记录与数据处理）记录与数据处理 （9 9）结果判定）结果判定 制备制备双碟双碟检检定定步步骤骤配制抗生配制抗生素溶液

8、素溶液 生物检定定量技术（1 1）称量）称量 标准品与供试品的称量均为标准品与供试品的称量均为一次取样一次取样称取称取 。生物检定定量技术二、管碟法二、管碟法3.二剂量法步骤二剂量法步骤生物检定定量技术（2）稀释）稀释 采用容量瓶采用容量瓶 取样量不得少于取样量不得少于2ml 稀释步骤一般不超过稀释步骤一般不超过3步步 从从“0”刻度开始放溶液。刻度开始放溶液。 标准品溶液取出须至室温后方可稀释标准品溶液取出须至室温后方可稀释 剂距为剂距为2 1或或4 1。 平行原则平行原则 生物检定定量技术培养基均匀摊布培养基均匀摊布 （3）双碟的制备）双碟的制备 台面必须水平台面必须水平 生物检定定量技术平稳落在培养基上平稳落在培养基上（4）放置小钢管）放置小钢管小钢管经干热灭菌小钢管经干热灭菌生物检定定量技术滴加溶液的顺序为滴加溶液的顺序为SHTHSLTL。 （5）滴加抗生素溶液）滴加抗生素溶液 成对角滴加标准品（成对角滴加标准品（S）及）及供试品（供试品（T）高（）高（H）、低（）、低（L）两种浓度的溶液。两种浓度的溶液。 生物检定定量技术（6）培养）培养生物检定定量技术（7）抑菌圈测量）抑菌圈测量 游标卡尺或抑菌圈测量仪游标卡尺或抑菌圈测量仪生物检定定量技术（8）记录、数据处理）记录、数据处理 及结果判断及结果判断 包括试验日期、称量时天平室温度、相对湿度，供试品包括试