微生物限度检验操作规程(2015年版)

1、精选文档1 目的规范微生物限度检验操作，确保检验结果精确、牢靠。2 依据中国药典2015版。3 范围本标准适用于微生物限度检验。4 责任中心化验室负责人：对本规程的实施负责。中心化验室检验人员：严格依据本规程执行检验操作。5 程序5.1 执行标准：中国药典2015版。5.2 抽样：照取样标准操作规程进行。6 内容6.1 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（MPN法）。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。6.1.1 设备、仪器及用具6.1.1.1 设备微生物限度检测室、净化工作台、生化培育箱（30350C）、生化培育箱

2、（20250C）、电热恒温水浴锅、烘箱、脉动真空灭菌柜、紫外灯等。6.1.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培育皿、量筒、试管及塞、移液枪及吸头、薄膜过滤器等。6.1.1.3 用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。6.1.2 试液6.1.2.1 消毒液 A0.1% 新洁尔灭溶液 B75%乙醇溶液6.1.2.2 稀释液、试剂及配制ApH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g，加纯化水1000ml，微温溶解

3、，滤清，分装，1210C灭菌15分钟。B聚山梨酯80C无菌十四烷酸异丙酯DpH6.8无菌磷酸盐缓冲液6.1.3 培育基胰酪大豆胨琼脂培育基、胰酪大豆胨液体培育基、沙氏葡萄糖琼脂培育基6.1.4 操作方法6.1.4.1 试验前预备6.1.4.1.1 将供试品及全部已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、移液枪吸头（1ml、10ml）、量筒、稀释液、培育基等移至传递窗内。每次试验所用物品必需事先方案，预备足够用量，避开操作中出入操作间。6.1.4.1.2 开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。6.1.4.1.3 操作人员进入一更，用洗手液或肥皂洗手，烘干。进入二更，用0.1% 新洁

4、尔灭溶液洗手，穿戴洁净无菌服、口罩、手套。6.1.4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处四周，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。6.1.4.2 供试液的制备依据供试品的理化特征与生物学特性，实行适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45。供试液从制备至加入检验用培育基，不得超过1小时。常用的供试液制备方法如下。假如下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。6.1.4.2.1 水溶性供试试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培育基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调整供试液pH

5、值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。6.1.4.2.2 水不溶性非油脂类供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培育基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调整供试液pH值至68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。6.1.4.2.3 油脂类供试品 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过

6、40（特殊状况下，最多不超过45），当心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成1：10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。6.1.4.2.4 肠溶及结肠溶制剂供试品取供试品10g，加入pH6.8无菌磷酸盐缓冲液，置45水浴中，振摇，使溶解，制成1：10的供试液。6.1.4.3 供试液的稀释取1:10均匀供试液1ml，加入装有9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中混匀，即为1:100供试液。以此类推，依据供试品污染程度，可稀释至1:1000、1:10000等适宜稀释级。每递增1稀释剂，必需另换一支吸管。6.1.4.4 检查法6.1.4.4.1 检验量检验量即一次

7、试验所用的供试品量（g、ml、cm2）。一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品。6.1.4.4.2 平皿法6.1.4.4.2.1 取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液的制备和菌数测定，每稀释级每种培育至少制备2个平板。6.1.4.4.2.2 阴性对比 以稀释液代替供试液进行阴性对比试验，阴性对比试验应无菌生长。假如阴性对比有菌生长，应进行偏差调查。6.1.4.4.2.3 倾注培育基将预先配制

8、好的培育基（需氧菌总数计数用胰酪大豆胨琼脂培育基，霉菌和酵母菌总数计数用沙氏葡萄糖琼脂培育基）熔化，置45。C水浴中，备用。将45。C左右的琼脂倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速转动平皿（勿使培育基溢出）使供试液与培育基混匀，放置，待凝。6.1.4.4.2.4 培育和计数需氧菌总数计数平板倒置于3035培育箱中培育35天。霉菌和酵母菌总数计数平板倒置于2025培育箱中培育5天，必要时可延长至7天。观看菌落生长状况，点计平板上生长的全部菌落数，计数并报告。菌落集中生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规章报告菌数。若同稀释级两个平板的菌

9、落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。6.1.4.4.2.5 菌数报告规章需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告的依据。以最高的平均菌落数，计算1g、1ml或10cm2供试品中所含的微生物，取两位有效数字报告。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 6.1.4.4.3 薄膜过滤法6.1.4.4.3.1 薄膜过滤法所接受滤膜孔径应不大于0.45µm，直径约为50mm，若接受其他直径的滤膜，冲洗量应进

10、行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留。滤器及滤膜使用前应接受适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应留意保持供试品溶液及冲洗液掩盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml，以避开滤膜上的微生物受损伤。6.1.4.4.3.2 取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤。若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液

11、1ml,过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培育基和沙氏葡萄糖琼脂培育基上培育。每种培育基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上是不得有空隙或气泡，否则影响微生物的生长。6.1.4.4.3.3 阴性对比 取试验用的稀释液1ml照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对比。阴性对比不得有菌生长。6.1.4.4.3.4 培育和计数 培育条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。6.1.4.4.3.5 菌数报告规章 以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以<1报告菌数（每张滤膜过滤1g或

12、1ml供试品），或<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。6.1.4.4.4 MPN法MPN法的精密度和精确度不及薄膜过滤法和平皿法，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的状况下使用，本法不适用霉菌计数。取供试液至少3个连续稀级，每一稀释级取3份1ml分别接种至3管装有910ml胰酪大豆胨液体培育基中。必要时可在培育基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。接种管置3035培育3天，逐日观看各管微生物生长状况。假如由于供试品的缘由使得结果难以推断，可将该管培育物转种至胰酪大豆胨液体培育基或胰酪大豆胨琼脂培育基，在相同条件下培育12天，观看是否有微生物生长。依据微生物生长的管数从表1查被测供试品每1g

13、或1ml中需氧菌总数的最可能数。 表1 微生物最可能数检索表生长管数需氧菌总数最可能数95置信限每管含样品的g或ml数MPN/g或ml下限上限0.10.010.001000309.400130.19.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.5352011443520220538210154382112053821227994220215402212899422235994230299942

14、3136994300235943013891043026416181310439181311751719931212030360313160303803209318360321150303803222103040032329090990330240409903314609019803321100200400033311006.1.4.4.5 结果推断需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培育基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数）；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培育基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。若因沙氏葡萄糖琼脂培育基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯

15、霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培育基或其他选择性培育基（如玫瑰红钠琼脂培育基）进行霉菌和酵母菌总数测定。使用选择性培育基时，应进行培育基适用性检查。若接受MPN法，测定结果为需氧菌总数。若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项上的规定，判供试品符合规定；若基中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。把握菌检查把握菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在物定的物生物。当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验、包括样品取样量和结果推断等。供试品检出把握菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。

16、供试液制备及试验环境要求同需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数应为内容，这个排列成子项。假如供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中种。供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生对无毒性。供试液制备假如使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。阳性对比试验方法同供试品的把握菌检查，对比菌的加量应不大于100cfu。阳性对比试验应检出相应的把握菌。阴性对比试验：以稀释剂代替供试液照相应把握菌检查法检查，阴性对比试验应无菌生长，如阴性对比有菌生长，应进行偏差调查。6.2 大肠埃希菌6.2.1 设备、仪器及用具6.2.1.1 设备微生物限度检测室、阳性菌检测

17、室、生物平安柜、净化工作台、生化培育箱（30350C、42440C）、电热恒温水浴锅、烘箱、灭菌柜、紫外灯等。6.2.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培育皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。6.2.1.3 用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。6.2.2 试液指示液PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液、革兰染色液、碘液、95%乙醇。6.2.3 培育基 胰酪大豆胨液体培育基、麦康凯琼脂培育基、麦康凯液体培育基等

18、。6.2.4 操作方法6.2.4.1 供试液制备和增菌培育 取供试品，照“6.1.4.2”制成1：10供试液。取相当于1g或1ml供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，在3035培育1824小时。6.2.4.2 选择和分别培育 取上述培育物1ml接种至100ml麦康凯液体培育基中， 4244培育2448小时。取麦康凯液体培育物划线接种于麦康凯琼脂培育基平板上，3035培育1872小时。6.2.4.3 结果推断 若麦康凯琼脂培育基平板上有菌落生长，应进行分别、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培育基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但

19、鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。6.2.4.4 若麦康凯琼脂培育基平板上有菌落生长，应进行分别、纯化及适宜的鉴定试验。以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培育物，应选择23个以上疑似菌落，分别接种养分琼脂斜面，培育1824小时，作以下检查。6.2.4.4.1 革兰染色、镜检 以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上,取上述疑似菌落的养分琼脂斜面新颖培育物少许,制成均匀涂片,自然或微温干燥,再通过火焰23次(载玻片不烫手)固定。滴加结晶紫染液,染色1min,水洗,滴加碘液,媒染1min,水洗,以滤纸吸干余水。滴加95%乙醇,脱色2030s,水洗。滴加沙黄染液,复染1min,待干后,镜检

20、。6.2.4.4.2 染色结果 革兰阳性菌呈蓝紫色;革兰阴性菌呈红色,大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌,或球杆菌状,亦有杆菌状。6.2.4.4.3 留意事项6.2.4.4.3.1 玻片必需洁净，涂片菌量宜少，菌不行浓。否则，菌细胞成堆或连成片。染色反应难于推断，菌细胞形态难于观看。6.2.4.4.3.2 培育物的菌龄以16-24h为宜。培育时间过长的革兰阳性菌易染成红色。6.2.4.4.3.3 脱色是关键，脱色时间不足，菌细胞易染成阳性，脱色时间过长易染成阴性。6.3 耐胆盐革兰阴性菌6.3.1 设备、仪器及用具6.3.1.1 设备微生物限度检测室、阳性菌检测室、生物平安柜、净化工作台、生化培育箱（

21、30-350C）、电热恒温水浴锅、烘箱、灭菌柜、紫外灯等。6.3.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培育皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。6.3.1.3 用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。6.3.2 试液、指示液 PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液等。6.3.3 培育基 胰酪大豆胨液体培育基、肠道菌增菌液体培育基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培育基等6.3.4 操作方法6.3.4.1 供试液制备和预培育 取供试品

22、，用胰酪大豆胨液体培育基作为稀释剂照“6.1.4.2”制成1：10供试液，混匀，在2025培育，培育时间应使供试品中的细菌充分恢复但不增殖（约2小时）。6.3.4.2 定性试验 除另有规定外，取相当于1g或1ml供试品的上述预培育物接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培育基中，3035培育2448小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培育基平板上，3035培育1824小时。假如平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性菌。6.3.4.3 定量试验 6.3.4.3.1 选择和分别培育 取相当于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml、0.001ml）供试品

23、的预培育物或其稀释液分别接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）肠道菌增菌液体培育基中，3035培育2448小时。和述每一培育物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培育平板上，3035培育1824小时。6.3.4.3.2 结果推断 若紫红胆盐葡萄糖琼脂培育基平板上有菌落生长，则对应培育管为阳性，否则为阴性。依据各培育管检查结果，从表2查1g或1ml供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数。表2 耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数（N）各供试品量的检出结果每1g（或1ml）供试品中可能的菌数cfu0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001mlN103102N10310N102N10注：

24、（1）+代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长；代表紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上无菌落生长。 （2）若供试品量削减10倍（0.01g或0.01ml，0.001g或0.001ml，0.0001g或0.0001ml），则每1g（或1ml）供试品中可能的菌数（N）应相应增加10倍。6.4 沙门菌6.4.1 设备、仪器及用具6.4.1.1 设备微生物限度检测室、阳性菌检测室、生物平安柜、净化工作台、生化培育箱（30-350C）、电热恒温水浴锅、烘箱、灭菌柜、紫外灯等。6.4.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培育皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。6.

25、4.1.3 用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。6.4.2 试液、指示液 PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液等。6.4.3 培育基胰酪大豆胨液体培育基、RV沙门菌增菌液体培育基、木糖赖氨酸脱氧酸盐琼脂培育基、三糖铁琼脂培育基等。6.4.4 操作方法6.4.4.1 供试液制备和增菌培育 取10g或10ml供试品直接或处理后接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，3035培育1824小时。6.4.4.2 选择和分别培育 取上述培育物0

26、.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培育基中， 3035培育2448小时。取少量RV沙门增菌液体培育物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上，3035培育1848小时。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色、透亮或半透亮、中心有或无黑色。用接种针选择疑似菌落于三糖铁琼脂培育基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培育1848小时，或接受基他适宜方法进一步鉴定。 6.4.4.3 结果推断 若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培育基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培育基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面黄色、底层黄色或黑色，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌

27、。假如平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培育基的斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层未见黄色或黑色，判供试品未检出沙门菌。 6.5 铜绿假单胞菌6.5.1 设备、仪器及用具6.5.1.1 设备微生物限度检测室、阳性菌检测室、生物平安柜、净化工作台、生化培育箱（30-350C）、电热恒温水浴锅、烘箱、灭菌柜、紫外灯等。6.5.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培育皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。6.5.1.3 用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子

28、、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。6.5.2 试液、指示液PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液等。6.5.3 培育基胰酪大豆胨液体培育基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培育基等。 6.5.4 操作方法6.5.4.1 供试液制备和增菌培育 取供试品，照“6.1.4.2”制成1：10供试液。取相当于1g或1ml供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培育基中，混匀，在3035培育1824小时。6.5.4.2 选择和分别培育 取上述培育物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培育基平板上， 3035培育1872小时。取上述平板上生长的菌落进行氧化酶

29、试验，或接受其他适宜方法进一步鉴定。6.5.4.3 氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的 1%二盐酸N，N二-甲基对苯二胺试液，在30秒内若培育物呈粉红色并渐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。6.5.4.4 结果推断 若溴化十六烷基三甲铵琼脂培育基平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌。假如平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。6.6 金黄色葡萄球菌6.6.1 设备、仪器及用具6.6.1.1 设备微生物限度检测室、阳性菌检

30、测室、生物平安柜、净化工作台、生化培育箱（30-350C）、电热恒温水浴锅、烘箱、灭菌柜、紫外灯等。6.6.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培育皿、量筒、试管及塞、吸管、注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、薄膜过滤器等。6.6.1.3 用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。6.6.2 试液、指示液PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液等。6.6.3 培育基胰酪大豆胨液体培育基、甘露醇氯化钠琼脂培育基等。6.6.4 操作方法6.6.4.1 供试液制备和增菌培育 取供试品，照“6.1.4.2”制成1：10供试液。取相当于1g或1ml供试液，接种至适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培育基中，混匀。在3035培育1824小时。6