一些固定液及方法介绍

1、一些固定液及方法介绍前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简 要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB）,加热至60c左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许 1N NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml ,充分混匀。该固定剂较适于光

2、镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后， 继续浸泡固定224h。另外,该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸播水400mlB 液：Na2HPO4?2H2O16.88g蒸播水300mlC液：NaOH3.86g蒸播水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注 意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中, 混合后再加入A液，以1N NaOH或1N HCl将pH调至7.27.4 ,最后，补充蒸播水至1000ml充分混 合

3、，4 c冰箱保存备用。该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4 c冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。3. Bouin's 液及改良 Bouin's 液试剂：饱和苦味酸40% 甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4 c冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin's液即不加冰醋酸。该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因

4、偏酸（pH为33.5）,对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。4. Zamboni's（Stefanini's）液试剂：多聚甲醛20g饱和苦味酸150mlKarasson-Schwlt's PB 至 1000ml配制方法：称取多聚甲醛20g,加入饱和苦味酸150ml,加热至60 c左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，力口 Karasson-Schwlt's PB至1000ml充分混合（Karasson Schwlt's磷酸缓冲液的配制配 制方法见后）。该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微

5、结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为 618h。5. PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液(Periodate-Lysine-paraform-alde hydefixative )试剂：过碘酸钠赖氨酸盐酸盐(或盐酸赖氨酸)：多聚甲醛蒸播水配制方法：(1)贮存液 A (0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/L Na3PO4,pH7.4 ):称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸 储水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐

6、酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L ,将pH调至7.4,补足0.1mol/L的PB至100ml,使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4 c冰箱保存，最好两周内使用。此溶液的渗 透浓度为 300 mOs mmol/L/kg 。(2)贮存液B (8%多聚甲醛溶液)：称8g多聚甲醛加入100ml蒸播水中，配成8%多聚甲醛液(方 法见前)。过滤后4 c冰箱保存。(3)临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠(NaIO4),使NaIO4终浓度为2%。 由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2 ,故固定时不需再调pH值。固定时间为618h。该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结

7、构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是借助于过碘酸 氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。由于组织抗原 绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成,一抗原决定簇位于蛋白部分，一故该固定剂有选择性地使糖类固二| 定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。6. Karnovsky's 液(pH7.3)试剂：多聚甲醛 30g25% 戊二醛 80ml0.1mol/L PB 至 1000ml配制方法

8、：先将多聚甲醛溶于 0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml ,混 匀。该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4c短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定1030min,用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。7. 0.4% 对苯醍(Parabenzoquinone)试剂：对苯醍4.0g0. 01mol/L PBS 1 000ml配制方法：称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L 的PBS即可。对苯醍对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影

9、响，故常与醛类固定剂混合使用。一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。此外，对苯醍有剧毒，使用时避免吸入或与皮肤接触。8. PFG液(Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG )试剂：对苯醍20g多聚甲醛15g25% 戊二醛40ml0.1mol/L二甲酸钠缓冲液至1000ml配制方法：先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醍及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二 甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。对苯醍与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗

10、原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多 种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。9. 碳二亚酰胺-戊二醛(ECD-G)液试剂：0.05mol/L PB500ml0.01mol/L PBS500mlTris约 14g浓HCl少许ECD10g25% 戊二醛3.5ml配制方法：先以约500ml的PB与相同体积的PBS混合，加入Tris (使其终浓度为1.4%)溶解，以浓 HCl调pH至7.0,再将事先称取好的ECD和戊二醛加入混合液，振摇后计时，用 pH计检测，约2 3min时，pH降至6.6,再以1N的NaOH在4min内调pH至7.0 ,此时，将该混合固定液加入盛有细 胞(经PBS漂洗

11、过)的器皿中，在23 c固定7min后，以PBS洗去固定液，即可进一步处理。ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi - imide hydrochloride,简称乙基-CDI,常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。ECD单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研 究的很好的固定剂。10. 四氧化钺(钺酸 Osmic Acid, OsO4 )配制：将洗净装有O

12、sO4的安甑中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安甑遇冷自破。也可用 钻石刀在安甑上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安甑，待其破后加溶剂稀释。为保证 充分溶解，应在用前几天配制。(1) 2% OsO4水溶解：取Os041g溶于重蒸水中。此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。(2) 1% OsO4-PB :试齐1J: A、2.26%NaH2PO4?2H2O4.15mlB、2.52% NaOH 8.5mlC、5.4%葡萄糖5mlD、OsO40.5g配制方法：先分别配好 A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH调至7.37.4, 取AB混合液45ml再与5ml

13、C液混合即为0.12mol/L PBG。(3) 1% OsO4/0.1mol/L 二甲肿酸钠缓冲液(pH7.27.4):试剂：2% OsO4水溶液10ml0.2mol/L二甲肿酸钠缓冲液(pH7.27.4) 10ml配制方法：取2%OsO4储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.27.4的二甲肿酸钠缓冲液充分混合即可。 OsO4是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。尽管OsO4主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。过氧化物酶的反应产物经 OsO4处理后，电子密度增高，适 于电镜研究。但由于 OsO4的反应产物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前 常需去除，去钺在光镜水平常用1%的高镒酸钾，在电镜水平则常用 H2O2来处理。以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。关于固定液种类还很多，如 70%90%的酒精、 丙酮、醋酸酒精(含0.1%1%醋酸的70%90%的酒精等)，这些溶液都能促使蛋白质凝固。它们 最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。总之，