昆明医学院第二附属医院检验科

1、 昆明医学院第二附属医院检验科 杨红英 酶免疫技术酶免疫技术放射免疫技术放射免疫技术发光免疫技术发光免疫技术酶免疫技术酶免疫技术三大经典标记技术酶免疫技术酶免疫技术-三大经典标记技术之一三大经典标记技术之一三大经典标记技术：三大经典标记技术： 主要试剂主要试剂: : 酶标记的抗体或抗原酶标记的抗体或抗原 酶标物特点：酶标物特点： 免疫学活性免疫学活性 酶对底物的催化活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性酶高效催化反应的专一性酶免疫技术的酶免疫技术的原理及特点原理及特点酶免疫技术的原理酶免疫技术的原理 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶标

2、抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析 特点特点 抗原抗体反应的特异性与抗原抗体反应的特异性与酶高效催化反应的专一性酶高效催化反应的专一性 相结合相结合 灵敏度高、特异性强、准确性好灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联，衍生出适用范围更广的新方易与其它技术偶联，衍生出适用范围更广的新方法法。酶及作为标记酶的要求酶及作为标记酶的要求 活性高：低浓度底

3、物，高催化反应 有与抗原、抗体共价结合的集团 标记后不影响稳定 显色信号易于判断和测量显色信号易于判断和测量 底物易于配制保存且对人体无害底物易于配制保存且对人体无害 酶及底物价廉酶及底物价廉常用酶常用酶- -辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP） 来源于植物来源于植物 特点：特点： 糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）的结合糖蛋白（主酶）和亚铁血红素（辅基）的结合物纯度用纯度数（物纯度用纯度数（RZRZ）表示，与酶的活性无关，）表示，与酶的活性无关，酶活性以单位酶活性以单位U U表示。酶变性后表示。酶变性后RZRZ不变但活性不变但活性降低。降低。 优势：容易获得、价廉、稳定优势：容易获

4、得、价廉、稳定 常用于常用于ELISAELISA常用酶常用酶- -碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP） 来源于大肠杆菌或小牛肠黏膜，二者的理化性质不同。来源于大肠杆菌或小牛肠黏膜，二者的理化性质不同。 特点：特点： 敏感性高于敏感性高于HRPHRP，本底低。，本底低。 不容易获得高纯度制剂，稳定性低、价格高。不容易获得高纯度制剂，稳定性低、价格高。 多用于均相酶免疫测定多用于均相酶免疫测定 邻苯二胺邻苯二胺 OPDOPD四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMBTMB5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸

5、-6)-6)铵盐铵盐 ABTSABTS常用底物常用底物常用底物常用底物 邻苯二胺邻苯二胺 OPDOPD： OPDOPD反应后显橙黄色，加酸终止反应反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长后呈棕黄色，测定波长492nm492nm。 缺陷：不稳定，致癌。缺陷：不稳定，致癌。常用底物常用底物 四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMBTMB反应后显蓝色反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变，加酸终止反应后变为黄色为黄色, ,测定波长测定波长450nm 450nm 。 优势：稳定，无致癌性，优势：稳定，无致癌性， ELISAELISA中应用最广泛的底物。中应用最广泛的底物。 需注意在溶液中不稳定需注意在溶液中

6、不稳定酶免疫技术的核心组成部分酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物酶结合物（conjugateconjugate）酶标记物酶标记物 通过化学反应或免通过化学反应或免疫学反应，让酶与疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的抗体或抗原形成的结合物结合物 酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原抗原要求纯度高，抗原性完整抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。产，易纯化。 制备方法要求制备方法要求酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原制备方法要求制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性技术方法简单、产率高，重

7、复性好好标记反应不影响酶和抗原或抗体标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性的活性酶标记物稳定酶标记物稳定 ，不形成聚合物，不形成聚合物酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原制备方法制备方法戊二醛交联法戊二醛交联法酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原 改良过碘酸钠法改良过碘酸钠法戊二醛交联法戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRPHRP和蛋白质分子中的氨基结合和蛋白质分子中的氨基结合 该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。步法高，酶标记物质量较均一。 改良过碘酸钠法 过碘酸钠氧化酶的多

8、糖羟基为醛基，醛基+抗体蛋白中的游离氨基Schiff 碱， Schiff 碱 + 硼氢化钠稳定的酶标志物 常用于HRP标记抗体或抗原纯化及鉴定纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法：常用的纯化方法：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-200/G-150G-200/G-150过柱层析纯化过柱层析纯化50%50%饱和硫

9、酸铵沉淀提纯饱和硫酸铵沉淀提纯酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面到固相载体的表面 固相载体固相载体要求要求 结合抗体或抗原的容量大结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性不影响免疫反应性 利于反应充分进行利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济固相方法简便易行，快速经济种类种类塑料制品塑料制品 微颗粒微颗

10、粒膜载体膜载体 固相载体固相载体将抗原或抗体结合于固相载体将抗原或抗体结合于固相载体用用1%1%5%5%的牛血清白蛋白或的牛血清白蛋白或5%5%20%20%小牛血小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附特异性吸附包被包被coatingcoating封闭封闭blockingblocking包被与封闭包被与封闭酶免疫技术分类酶免疫技术分类 酶酶免免疫疫技技术术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均均 相相非均相非均相固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标本中抗原的定位组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中

11、抗原或液体标本中抗原或抗体的定性和定量抗体的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理原理均相酶免疫测定均相酶免疫测定最具代表性的两种技术最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术EMITEMITenzyme-mutiplied immunoassay tec

12、hnique克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析 CEDIACEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫测定均相酶免疫测定EMITEMIT示意图示意图(enzyme-multiplied immunoassay technique(enzyme-multiplied immunoassay technique）CEDIACEDIA示意图示意图（cloned enzyme donor immunoassaycloned enzyme donor immunoassay）分类：分类：液相酶免疫测定液相酶免疫测定 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料

13、作为固相载体的酶联免疫吸以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（附试验（ELISAELISA） 是目前最为常用的固相酶免是目前最为常用的固相酶免疫测定疫测定与均相不同与均相不同之处之处需分离游离与结合的酶标记物需分离游离与结合的酶标记物非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assyenzyme-linked immunosorbent assy，ELISAELISA） 底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或

14、抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复合物的抗原抗体复合物与未结合的分离与未结合的分离1234一、基本原理一、基本原理固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物酶反应的底物 三个必要试剂三个必要试剂 二、方法类型及反应原理二、方法类型及反应原理双抗体夹心法双抗体夹心法方法：方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色标抗体，加底物显色应用：应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定二价或二价以上的较大分子抗原测定 常用于检测乙型肝炎表面抗原和常用于检测乙型肝炎表面抗原和e e抗原等抗原等

15、ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E竞争法竞争法 方法：方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法竞争法测抗原竞争法测抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE E2 2、加待检物、加待检物抗原与酶标抗抗原与酶标抗原竞争与抗体原竞争与抗体结合结合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不显色

16、的底物不显色或显色弱或显色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物显色的底物显色1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面2 2、加待测物、加待测物和酶标抗原，和酶标抗原，酶标抗原与抗酶标抗原与抗体结合体结合E E特 点 应用：应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）物、激素等） 酶标记抗原与样品中的非标记抗原具有相同的与固相酶标记抗原与样品中的非标记抗原具有相同的与固相抗体结合的能力抗体结合的能力 反应体系中固相抗体和酶标抗原是固定限量，且前者反应体系中固相抗体和酶标抗原是固

17、定限量，且前者的结合位点少于酶标记和非标记抗原的分子数量和的结合位点少于酶标记和非标记抗原的分子数量和 判读结果：结合于固相载体上复合物中被测定的酶标判读结果：结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原的量与样品中非标记抗原的浓度成反比抗原的量与样品中非标记抗原的浓度成反比1 1、间接法、间接法方法方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgGIgG（抗（抗抗体或二抗）加底物显色。抗体或二抗）加底物显色。优点优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用应用 常用于常用于HCVHCV抗体、抗体、HIVH

18、IV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法间接法测抗体间接法测抗体- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E2 2、双抗原夹心法、双抗原夹心法原理：原理：类似双抗体夹心法类似双抗体夹心法操作步骤操作步骤：类似类似 应用：应用：乙型肝炎表面抗体乙型肝炎表面抗体ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法3 3、竞争法、竞争法 原理原理：抗原抗原+ +固相载体固相载体 固相抗原固相抗原+ +待测标本待测标本/ /酶标抗体酶标抗体 待测标本待测标本/ /酶标抗体竞争与固相抗原结合酶标抗体竞争与固相抗原结合 显色显

19、色 颜色深浅与待测物含量成反比颜色深浅与待测物含量成反比 应用应用：乙型肝炎病毒核心抗体乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)(HBcAb)和乙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒e e抗体抗体(HBeAb)(HBeAb)的检测的检测 ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法4 4、捕获法、捕获法 应用：应用： 病原体急性感染诊断中的病原体急性感染诊断中的IgMIgM型抗体型抗体 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗体抗体 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心HBc-IgMHBc-IgM抗体抗体ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法捕获法捕获法 原理：原理：抗人抗人IgMIgM链抗体包

20、被链抗体包被捕获待测标本中捕获待测标本中IgMIgM类抗体类抗体加入特异性抗原和酶标记特加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体异性抗原的抗体 底物显色底物显色 捕获法原理捕获法原理+ +- -E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待测物、加待测物特异性特异性IgMIgM与与非特异性非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性、加特异性抗原，与特异抗原，与特异性抗体结合性抗体结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体与特异性抗原结与特异性抗原结合，加底物显色合，加底物显色2 2、加待测物、加待

21、测物只有非特异性只有非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性抗、加特异性抗原，不能与非原，不能与非特异性特异性IgMIgM结合结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体无抗原结合，无抗原结合，加底物不显色加底物不显色ELISA应用中的质量控制应用中的质量控制 酶标仪滤光片波长精度检查 用紫外可见光分光光度计对滤光片进行扫描，检测值与标定值之差即滤光片波长精度，应1.0nm 。通道差检测：取一只酶标板小孔，以酶标板架做载体，内加200l甲基橙溶液，吸光度值调至0.500A左右，先后置于8个通道的相应位置，蒸溜水调零，于490nm 处连续测3次，观察其不同通道的检测器测量结果的

22、一致性，可用极差值来表示，应0.015。孔间差的测量：选择同一厂家同一批号酶标板分别加入200l甲基橙溶液，先后置于同一通道，蒸溜水调零，于490nm 处检测，其误差大小用士1.96S衡量， 0.1，试剂空白应该不加酶而加了酶：参考阴性OD值； 如其整个反应板均有浅颜色，本底0.1 时应作如下处理：1）增加洗板次数；2）缩短孵育时间；3）缩短显色时间；4）请试剂厂家协助调整试剂的生产工艺。 质控血清的制备: 室内质控血清可以参考国内、国际权威定值标准品自己制备其步骤为:收集阳性血清(无明显溶血、黄疽、脂肪血或污染血清)，累积到一定数量(够本室使用 3一6个月的量); 传染性病毒阳性血清需经56、lO小时灭活后使用; 过滤去除纤维沉降物; 用正常人血清或10%小牛血清PBS溶液稀释; 测定值与定值参考品进行对比、求值，一般选择在C.O附近的阳性值; 分装小瓶(每日用量)，加盖、贴签，-2O冻存备用。无质控血清的室内质控:定性试验可以用试剂盒内的阴阳性对照(内对照)作参考，阴性对照0.05，空白对照0.03，阳性对照0.80，阳性A值-阴性A值08为试验合格定量试验可以用试剂盒提供的标准系列作参考，每板标准品A值应在2S范围内