第六次课分子遗传学研究方法和应用

1、分子遗传学研究技术和应用分子遗传学研究技术和应用刘雅萍刘雅萍北京协和医学院基础学院北京协和医学院基础学院医学遗传学系医学遗传学系纲要纲要 一般的基因检测工作需要用到的分子遗传学技术 要解决一个科学问题时（科研课题）需要使用的分子遗传学技术 （以一篇今年八月发表在PNAS上的关于视网膜色素变性的文章为例） 美国医学遗传学大学 关于基因检测的公共网络资源关于基因检测的公共网络资源 临床分子遗传学学会 （ )关于基因检测的公共网络资源关于基因检测的公共网络资源问题的提出问题的提出 视网膜色素变性 50-60% 常染色体隐性遗传 已知31个致病基因 4个定位到某染色体区段，未找到致病突变 30-40%

2、 常染色体显性遗传 已知21个致病基因 5-15% X连锁遗传 已知2个致病基因 4个定位到X染色体区段，未找到致病突变PNAS Aug 2011 vol. 108 no. 34 EE569-E576 患者是否有能解释其疾病的某种基因突变？ 患者存在可能导致其疾病的某个特定基因突变吗？筛查突变 患者是否有一个特定基因中的一个特定突变，例如：CFTR基因第508位编码苯丙氨酸密码子的三碱基缺失吗？检测特有序列的变化需要回答的问题需要回答的问题受检材料的选择：受检材料的选择：DNA， RNA，蛋白质，蛋白质 一切有核细胞 外周血（最好的DNA来源） 口腔上皮细胞、发根细胞 皮肤、肌肉，等组织 培养

3、的皮肤成纤维细胞或其他细胞 羊水细胞或者绒毛膜细胞 （产前诊断） 母血中的胎儿DNA （只用于检测父源等位基因）受检材料的选择：受检材料的选择：DNA 还是还是RNA？ RNA优于DNA，但更难以获得与操作 当一个基因必须被筛查未知的突变时，用RT-PCR进行检测有以下优点： 对于含有许多外显子的基因，可通过更少的反应完成RT-PCR产物的检测 只有RT-PCR能可靠地检测出异常剪接，此异常很难从DNA序列变化进行预测 RNA非常不便于获得与操作 为避免降解，样品需及其小心处理及快速操作 目的基因可能在易于获得的组织中不表达，许多突变导致不稳定的mRNA，因此，杂合个体的RT-PCR产物可能只

4、显示正常等位基因DNA提取提取 原理原理SDS是一种阳离子去污剂，破坏细胞的脂质膜，使蛋白质变性蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，能消化各种蛋白质、脂类和胺类物质酚、氯仿（脂溶剂）抽提剔除所有蛋白，使DNA纯化无水乙醇在离子存在的条件下将DNA沉淀常规方法酚-氯仿抽提去蛋白盐析除蛋白蛋白酶K消化蛋白SDS 裂解细胞乙醇沉淀DNA分离白细胞or试剂盒DNA提取提取 从外周血提取从外周血提取方法方法优点优点缺点缺点Southern印迹 cDNA探针杂交检测大的缺失和重排唯一的方法费力、昂贵，需几gDNA测序测序检测全部改变，突变可完全定性检测全部改变，突变可完全定性昂贵昂贵杂合双链凝胶泳动度非常简单

5、，价廉仅适用于小于200bp序列，灵敏度有限，不能显示突变的位置dHPLCdHPLC迅速高通量设备昂贵，不能显示突变位置SSCPSSCP简单价廉仅适用于小于200bp序列，不能显示突变的位置DGGE高灵敏度引物的选择很关键，引物昂贵，不能显示突变的位置PTT对链终止突变，其灵敏度高，能显示突变的位置仅对链终止突变，昂贵，技术困难，通常需要RNA定量定量PCRPCR检测杂合子缺失昂贵芯片迅速高通量可能检测到和确定全部改变昂贵，待检测基因范围有限常规诊断检测方法的优缺点常规诊断检测方法的优缺点PCR原理原理凝胶电泳凝胶电泳 原理原理带电物质在电场中向相反电极移动的现象称电泳在pH8.0时，核酸分子

6、的磷酸全部解离，DNA分子带负电荷，向正极泳动不同核酸分子的电荷密度大致均一，在无支持物的自由电场中，各DNA分子迁移率差别很小，很难分开在凝胶电泳中，凝胶孔隙起着分子筛的作用，DNA分子大小或构象不同，适当浓度凝胶介质中，迁移率会出现较大差异，达到分离目的电泳是鉴定（大小）、分离/纯化（切胶）DNA片段的简便、快速的方法。根据电泳支持介质的不同，常分为琼脂糖凝胶（agarose gel）电泳和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG）电泳，后者凝胶孔径更小，分辨率更高。凝胶电泳凝胶电泳 小分子可从较小的孔中穿行，而较大分子则必须饶道经大孔隙通过，因而迁移速度减慢。这样调

7、节凝胶的浓度，便可将不同大小的DNA分子分离开15电泳电压一般为10V/cm胶长 琼脂糖（agarose）是从海藻中提取的长链状多聚物，当加热至90左右时，形成清亮、透明的液体，冷却至45以下时，即可固化形成凝胶染色剂：琼脂糖凝胶电泳一般用溴化乙锭（EB），在紫外光下显示荧光条带。EB是一种化学致癌物，操作要小心。指示剂：溴酚蓝（蓝紫色），二甲苯青（蓝色）。1%（2%）琼脂糖凝胶中，溴酚蓝的迁移率与300bp（150bp）双链DNA类似；二甲苯青慢，与4kb的DNA相似分子量标记：标记大小、浓度。DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳染色剂染色剂 EB

8、琼脂糖凝胶电泳适用于分离200bp50kb大小的DNA片段，可区分相差1/10长度（最小约差20bp）的DNA片段。凝胶浓度（%）分离DNA的有效范围（kb）0.36050.62010.8100.81.070.51.260.41.53/40.22.02/30.1DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳分离线性分离线性DNA分分子的有效范围子的有效范围聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）单体丙烯酰胺在过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)与TEMED(N,N,NN-四甲基乙二胺)的催化与诱

9、导下聚合成长链；当有N,N-亚甲双丙烯酰胺参与聚合反应时，长链与长链之间就交联成凝胶，其孔径由链长与交联度决定。当DNA分子进入凝胶，在电场下进行泳动时，因大小和构象而迁移率不同，而得以分离。分辨率更高些，用于分离较短的、差别较小的DNA片段凝胶电泳后通过银染或放射自显影检测DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳的聚丙烯酰胺凝胶电泳 变性PAGE变性胶中含有一定浓度的变性剂（尿素、甲酰胺或两者合用），可以消除DNA分子不同构象对迁移率的影响。在变性胶中，单链DNA片段的泳动速度仅与其长度相关，而与核苷酸组成/构象无关。6%凝胶长距离电泳可以显示1个核苷酸的长度差别。以前用于测序（单链DNA分子的分离），现

10、在常用于DNA片段长度多态性分析中性PAGE非变性胶，不含变性剂。可用于双链DNA分子的分离。不仅反应长度差异，还保留构象差异，因此还可用于单链DNA的构象分析DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳的聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNA的的PAGE凝胶电泳凝胶电泳分离线性分离线性DNA分子分子的有效范围的有效范围 分子杂交是应用碱基互补配对原理，同源的两条DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA 链，在一定条件下能结合形成双链。 用带有放射性或非放射性标记的DNA或RNA分子做探针，可检测靶细胞基因组中的同源序列。分子杂交分子杂交 原理原理 Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 原位杂交 克隆菌

11、落原位杂交 组织切片的原位杂交 染色体原位杂交 斑点杂交 gDNA斑点杂交 ASO标点杂交 反向斑点杂交 DNA芯片 Array-CGH分子杂交分子杂交 类型类型CCGTAC3553primerdNTPddATPGGCAddTTPGGCATddCTPGGCGddGTPGGGGCATG A T C G 反应体系：反应体系：缓冲液缓冲液模板：模板： 纯化后纯化后PCR产物产物引物：单向引物引物：单向引物DNA聚合酶：聚合酶： 测序酶测序酶dNTP少部分少部分ddNTP 某种某种ddNTP掺入，掺入，DNA合成合成终止在终止在3相应的核苷酸处。相应的核苷酸处。DNA测序基本原理（测序基本原理（San

12、ger末端终止法）末端终止法）DNA测序基本原理测序基本原理DNA测序结果测序结果 大多数突变是以杂合形式出现，即使对常染色体隐性疾病，非近亲婚配的双亲所生受累个体很可能是复合杂合子，携带两种不同的突变 利用杂合双链的特性检测两条序列间的差异 将杂合性的PCR产物加热使之变性，然后缓慢降温即可形成杂合双链 若为纯合性突变或男性X连锁突变，必需要加入一些野生型DNA作为参照基于检测错配或杂合双链的方法基于检测错配或杂合双链的方法杂合双链杂合双链 （heteroduplex） 单链构像多态性(single strand conformation polymorphism, SSCP) 变性梯度凝胶

13、电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 变性高效液相层析（Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC）基于检测错配或杂合双链的方法基于检测错配或杂合双链的方法 指单链DNA 在溶液中形成链内局部双链，而形成一定的立体构像，等长的DNA 片段因其序列中核苷酸的组成和排列顺序不同，形成的构像不同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为电泳速度的差别 单链DNA 的构像对DNA 序列的改变非常敏感，常常一个碱基的差别都能显示出来SSCP 正常样品一般出现两条带，为正链和负链

14、不是所有的核苷酸序列改变都引起单链构象的改变，因此SSCP方法还不能鉴别所有的突变，其鉴别能力只有80%左右 SSCP的结果判定是通过与正常样品对比，观察条带位置的改变 不能显示突变的位置SSCPSSCP结果结果CFTR基因外显子3扩增后SSCP1，正常对照2，正常对照3，G85E4，L88S5，R75X6，P67L7，E60X8，R75Q经测序表明单链DNA 1 2 3 4 5 6 7 8 1995年由Stanford大学人类基因组技术中心的Oefner和Underhill建立，现已有商业化的检测仪器。 原理：利用在部分变性条件下同源、异源双链DNA解链特征的差异进行变异检测。 敏感性和特异

15、性：96%100%DHPLCDHPLC原理原理DHPLC举例举例 dHPLC筛查筛查DMD突变突变抗肌萎缩蛋白基因外显子6 PCR扩增产物，受累男性（蓝色）和正常对照（红色）有不同的模式。测序显示剪接位点突变。因为这是一个X连锁的疾病，对于男性，待检DNA必须与同等量正常DNA混合，以促成杂合双链的形成检测缺失的方法检测缺失的方法 纯合性或半合性缺失易于检测：缺失的序列将不被PCR扩增 多重PCR 探针连接多重扩增（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA） 在同一PCR反应体系中，加入多对引物，同步扩增彼此不相重叠的DNA片

16、段 内对照片段，以防止扩增的假阴性并确定目标序列的基因剂量（拷贝数） 致病基因有多个缺失热点区域，设计多重PCR 反应，通过一次PCR 反应确定基因缺失的位置和范围 检测基因片段缺失 检测个体性别多重多重PCR38 多重PCR 中应用的各PCR 引物应具有相同或相近的扩增条件，并且相互间不发生非特异性扩增 多重PCR 产物的电泳检测须用分辨率较高的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。因此各个片段的长度应在设计时安排好，以便较好的分离 自动化分析时，可使用不同的荧光标记一侧引物。由于标记的荧光不同，相近的片段通过不同的波长采集信号，可以彼此分辨多重多重PCR多重筛查男性抗肌萎缩蛋白基因缺失多重多重PCR

17、对九个外显子进行多重PCR扩增的产物。设计PCR引物使得每个含有某些旁侧内含子序列的外显子会扩增出不同大小的PCR产物1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MLPA原理原理 MLPA应用举例应用举例 MLPA检测抗肌萎缩蛋白基因外显子的缺失合重复 检测特定序列的变化检测特定序列的变化 对一种已知序列改变存在与否的检测 通过测序确定其基因型 如果仅检测一个核苷酸位点，传统的测序不是高效的方法 有限的等位基因异质性疾病的诊断 例如镰状细胞贫血症中的E6V突变 CFTR中的F508del（80北欧群体囊性纤维化） 家系内诊断 通过突变筛查已确定突变 家系其他成员用此方法 检测对照样本 验证在患者

18、中发现的突变是否为可能的致病突变 SNP基因分型 检测特定序列变化的典型应用检测特定序列变化的典型应用 检测特定序列变化方法检测特定序列变化方法方法方法注释注释PCR扩增的DNA经限制酶消化；检测凝胶中产物的大小只有当突变产生自然限制酶切位点，或使其消失或采用特殊PCR引物制造一个自然限制酶切位点时，该方法才有效将PCR扩增的DNA与等位基因寡核苷酸（ASO）在斑点印迹或基因芯片上杂交特异点突变的一般方法大规模阵列可筛查几乎任何突变采用等位基因特异引物PCR点突变的一般方法，引物设计关键可与芯片技术结合采用TaqMan技术，可提供实时定量寡核苷酸连接分析（OLA）检测特定点突变的一般方法PCR

19、，引物位于易位断点任意一侧扩增成功表明存在可疑的缺失或特定的重排焦磷酸测序高通量方法SNaPShot通过引物延伸的小测序质谱高通量方法 检测特定序列的变化方法检测特定序列的变化方法 简便、低通量检测方法 检测限制性位点的存在和缺如(PCR/RFLP) 等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO) 等位基因特异性PCR扩增(ARMS) 寡核苷酸连接分析(OLA) 通过引物延伸进行小测序 高通量SNP基因分型 焦磷酸测序 (Roche/454超高通量测序的基础) 质谱测定法 基于微阵列的大规模平行SNP基因分型 当某一碱基替换产生一个识别位点或使一个限制酶识别位点消失时，用PCR 扩增该位点周围区域的DN

20、A 片段，然后用相应的限制性内切酶进行酶解，电泳后可通过DNA 片段的变化来判断PCR/RFLP用途用途PCR/RFLP -人为引入限制酶切位点人为引入限制酶切位点当突变碱基周围的序列与某种限制性内切酶识别序列只有一个碱基差别时，在引物3端引入错配碱基，产生人为的限制酶切位点，使正常或突变等位基因的的PCR产物能够被这种限制性内切酶切断 ASO (allele specific oligonucleotide) ASO探针杂交是最早用来检测点突变的方法 突变基因位点特异的寡核苷酸探针，一般为19个碱基，与被测定的突变所在区域的正常（或异常） DNA序列互补 探针特异性以避免基因组中的其他同源序

21、列ASO探针斑点杂交原理探针斑点杂交原理 在严格的杂交洗脱温度下，只要有一个碱基不匹配，正常探针便只能与正常基因序列杂交 通常为两份样品 一份与正常基因序列杂交 一份与突变序列杂交 通过控制洗脱温度，使正常探针只能与正常基因杂交而不与突变序列杂交，反之亦然。ASO探针斑点杂交实验过程探针斑点杂交实验过程TCAGATCGASO探针斑点杂交举例探针斑点杂交举例应用应用ASO杂交原理的杂交原理的DNA芯片芯片 引物3端与目标片段完全匹配，才能顺利延伸，是PCR反应成功的关键。 在两个反应中，设计特异的PCR引物，选择性地扩增目标等位基因： 一个通用引物 一个是正常序列特异引物 另一个是突变序列特异引

22、物等位基因特异等位基因特异PCR原理原理琼脂糖电泳突变引物正常引物共有引物错配完全匹配用来诊断由单核苷酸取代所致的突变多重ARMS实验检测29种囊性纤维化突变等位基因特异等位基因特异PCR举例举例四个多重突变特异PCR反应（ABCD）来检测四个样本每个泳道的上部和下部条带为对照序列如果存在29种突变中的一种，就会出现多余的一条带寡核苷酸连接分析寡核苷酸连接分析(OLA)原理原理OLA检测碱基替换突变时，所构建的两个寡核苷酸与靶基因的邻近序列杂交，连接点位于突变位的位置。除非两个寡核苷酸能够完全杂交，否则DNA连接酶不能将二者共价相连寡核苷酸连接分析寡核苷酸连接分析(OLA)举例举例用来诊断由单

23、核苷酸取代所致的突变用OLA检测29种已知的囊性纤维化突变通过引物延伸进行小测序通过引物延伸进行小测序利用Sanger测序的原理。测序引物的3端位于待确定基因分型核苷酸的直接上游区易于转换成适合阵列型研究的方式单核苷酸引物延伸检测11个BRCA1基因的特异突变多重PCR扩增受检个体BRCA1基因大规模大规模SNP基因分型基因分型 利用基于等位基因特异的寡核苷酸的DNA芯片大规模大规模SNP基因分型基因分型 利用Illumina GoldenGate 方法分子遗传学技术的主要进展分子遗传学技术的主要进展外显子组测序的工作流程外显子组测序的工作流程外显子组测序寻找致病突变的策略外显子组测序寻找致病

24、突变的策略确定共享区域确定共享区域 -大规模大规模SNP基因分型基因分型技术技术 在筛查疾病的基因突变时，一定要考虑地域之间的变化（种族特异性） 检测具有很大的位点异质性的疾病的基因突变是一个大的挑战 例如视网膜色素变性 100 致病基因，还有许多？ 是否某一基因中某一特定突变可以解释很大一部分病例？ 用户订制的芯片 Exome sequensing其他一些重要的其他一些重要的 在考虑使用哪种方法进行基因检测时，首先要判断是否应该筛查一个或更多基因的突变 检测可以使用DNA或RNA。RNA要从候选基因所表达的组织中提取，而且在处理样本时需要特别注意。但是，相比DNA，对于包含许多小外显子的基因来说，用RNA比较省时，经济，而且还会发现异常的剪接 进行基因检测的第一步几乎总是PCR或RT-PCR（如果RNA是检测样本） 在筛选一个基因的突变时，正常的程序为逐个外显子测序，或测序一个RT-PCR产物要点要点 几种方法可以快速筛查包含多个外显子的每个外显子来鉴定它们是否包含任何变异。主要目的是尽量减少未