第七章基因结构与表达分析的基本策略ppt-hylogen

1、第七章第七章基因结构与表达分析的基本策略基因结构与表达分析的基本策略Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes主讲人：罗志勇主讲人：罗志勇 教授教授1 1. DNA双螺旋结构发现双螺旋结构发现（Watson Crick,1953）概概 论论The Nobel Prize in Physiology or Medicine 19622Presentation Speech by Professor A. Engstrm Dr. Francis Crick, Dr. James Watson, Your discovery of

2、the molecular structure of the deoxyribonucleic acid, the substance carrying the heredity, is of utmost importance for our understanding of one of the most vital biological processes. Practically all the scientific disciplines in the life sciences have felt the great impact of your discovery. The fo

3、rmulation of double helical structure of the deoxyribonucleic acid with the specific pairing of the organic bases, opens the most spectacular possibilities for the unravelling of the details of the control and transfer of genetic information.3 Central Dogma2.中心法则提出中心法则提出（Crick，1958）Crick,1916-20044反

4、转录机制阐明反转录机制阐明（ Temin 1970 ）补充的中心法则补充的中心法则5中心法则：中心法则： 代表了大多数代表了大多数生物遗传信息贮存和表达生物遗传信息贮存和表达的规律，的规律，奠定了从分子水奠定了从分子水平研究生命科学关键问题平研究生命科学关键问题的理论基础。的理论基础。63.基因表达基因表达（gene expression）：）： 从从DNADNA到蛋白质，通过到蛋白质，通过转录转录和和翻译翻译，用基因的遗传信息在，用基因的遗传信息在细胞内合成有功能意义的各种细胞内合成有功能意义的各种蛋白质。蛋白质。74.4.基因结构与表达分析基因结构与表达分析技术：技术： Northern

5、blot Real -time RT PCR 基因芯片基因芯片DNA序列分析序列分析 Southern blot FISHDNARNAWestern blot 蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质蛋白质8讲授内容：讲授内容：( () )DNADNA序列分析序列分析()()核酸分子杂交核酸分子杂交() 聚合酶链式反应聚合酶链式反应() 基因芯片和微阵列基因芯片和微阵列 () Western免疫印迹免疫印迹9（一）（一）双脱氧链末端终止法双脱氧链末端终止法 (Sanger ,1977)（二）化学裂解法（二）化学裂解法 (Maxam Gilbert ,1977 )（三）（三）DNA自动化序列分析自动化序列分析

6、一、一、DNA序列分析序列分析10DNA测序技术基础：测序技术基础： 高分辨率变性聚丙烯酰胺高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术技术 PAGE能分离长度为能分离长度为300-500个碱基个碱基,差别仅差别仅1个碱基个碱基的单的单链寡核苷酸链寡核苷酸DNA片段。片段。 11(Sanger, UKMaxam Gilbert, USA)共同分享共同分享Nobel化学奖化学奖(1979)12( (一）双脱氧链末端终止法一）双脱氧链末端终止法（dideoxy chain termination） 以以DNA合成合成

7、反应为基础。反应为基础。(Sanger)13 ATP、dATP和和ddATP的结构的结构ATPdATPddATP14 DNA合成反应合成反应掺入掺入N个核苷酸个核苷酸掺入掺入N+1个核苷酸个核苷酸151. 双脱氧末端终止法原理双脱氧末端终止法原理 DNADNA合成反应中，合成反应中，ddNTPddNTP不存不存在在3-OH3-OH末端末端，故不能与下一个，故不能与下一个核苷酸的核苷酸的5-P5-P端形成端形成33，5-5-磷酸二酯键，导致磷酸二酯键，导致DNADNA新链的延伸新链的延伸提前终止于提前终止于ddNTPddNTP 。16 末端终止部位末端终止部位DNADNA单链模板单链模板引物引物

8、延伸的新合成链延伸的新合成链 掺入掺入ddNTPddNTP172. DNA2. DNA测序主要步骤测序主要步骤 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 单链单链DNADNA模板的制备模板的制备 DNADNA模板与测序引物退火模板与测序引物退火 掺入法标记反应掺入法标记反应 延伸延伸- -终止反应终止反应 放射自显影放射自显影 阅读测序结果阅读测序结果18测序步骤测序步骤1920G G反应管反应管A A反应管反应管C C反应管反应管G G反应管反应管T T反应管反应管21 G A T C22 与末端终止法不同，与末端终止法不同，化学化学降解法是建立在对原有降解法是建立在对原有DNADNA的

9、的化学降解过程基础上。化学降解过程基础上。 （二）化学裂解法（二）化学裂解法23 将待测将待测DNADNA片段片段33或或55端进行端进行同位素标记，标记的同位素标记，标记的DNADNA片段分成四片段分成四个反应，分别用不同的化学试剂处个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使理，造成碱基特异性切割，使DNADNA片片段分别于某一种碱基处断裂。段分别于某一种碱基处断裂。1.1.化学裂解法化学裂解法原理原理24 化学降解化学降解G G反应模式图反应模式图 硫酸二甲酯硫酸二甲酯哌啶哌啶MetMetMetMet25（三）（三）DNA测序自动化原理测序自动化原理 采用采用4种不同的荧光分

10、别标种不同的荧光分别标记记4种种ddNTP终止反应产物，终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。测序自动化的基础。261. DNA自动测序步骤：自动测序步骤： 4种带有不同荧光染料标种带有不同荧光染料标记的终止物记的终止物ddNTPsSanger测序反应测序反应反应产物毛细管电泳分离反应产物毛细管电泳分离27 荧光信号采集、计算机分析荧光信号采集、计算机分析与与DNA自动排序自动排序。 激光激发不同大小激光激发不同大小DNA片段片段上的荧光分子，发射出四种上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光不同波长的荧光282. DNA自动测序结果自动测序结

11、果29()核酸分子杂交核酸分子杂交Nucleic Acid Hybridization 30 细胞原位杂交细胞原位杂交（Pardue et al， 1969) Southern印迹杂交印迹杂交: 检测检测DNA（Southern EM ，1975） Northern印迹杂交印迹杂交: 检测检测RNA（Stark GR，1977）核酸分子杂交技术的建立核酸分子杂交技术的建立31核酸分子杂交原理核酸分子杂交原理 标记的标记的单链核酸探针单链核酸探针与待与待检测的靶单链检测的靶单链DNA或或RNA局部局部互补结合形成杂交双链。互补结合形成杂交双链。 应用：应用：核酸靶核酸靶DNA或或RNA序列的定性

12、与定量分析。序列的定性与定量分析。3233一、一、Southern印迹杂交印迹杂交(Southern blot hybridization) 将电泳分离的将电泳分离的待测待测DNA片段结片段结合到一定的固相支持物上，然后与合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。杂交的过程。 34Paper TowelsSouthern Blotting1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHSpin35Agarose Gel Electrophoresis_+336二、二、Northern印迹杂交印迹杂交(Northern b

13、lot hybridization) 指将指将RNA变性及电泳分离变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中杂交反应来鉴定其中特定特定mRNA分子的含量及其大小。分子的含量及其大小。 37RNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18S应用举例应用举例38GAPDH0d 2d 4d 6d 8dNorthern blot 杂交分析杂交分析mRNA的表的表达达靶靶 mRNA39三、其他杂交技术三、其他杂交技术(一一)斑点杂交斑点杂交 (dot blot hy

14、bridization）: 将将RNA或或DNA变性后变性后直接点样于硝酸纤维素膜直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，或尼龙膜上，用于基因组用于基因组中特定基因及其表达的定中特定基因及其表达的定性及定量研究。性及定量研究。40（二）原位杂交（二）原位杂交（in situ hybridization） 用标记的核酸探针与组织切用标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序列片或细胞中的待测核酸互补序列杂交，可对核酸进行定性、定位杂交，可对核酸进行定性、定位和相对定量分析。和相对定量分析。 41（三）液相杂交（三）液相杂交 (solution hybridization) 1核酸酶核酸酶S1 保

15、护分析法保护分析法 (nuclease S1 protection assay） 单链单链DNA探针与待测探针与待测RNA形成形成DNA/RNA杂交双链，加入核酸酶杂交双链，加入核酸酶S1专一性地降解未形成杂交体的专一性地降解未形成杂交体的DNA或或RNA单链，单链，DNA/RNA杂交双链则杂交双链则受到保护而不被降解。受到保护而不被降解。 422RNA酶保护分析法酶保护分析法 （RNase protection assay，RPA）43RPA基本程序：基本程序：待测待测RNARNA的分离的分离体外转录标记体外转录标记RNARNA探针探针待测待测RNARNA与探针与探针RNARNA进行液相杂交

16、进行液相杂交 RNA酶消化酶消化不同大小杂交片段凝胶电泳分离不同大小杂交片段凝胶电泳分离44 3. 3.抑制消减杂交原理抑制消减杂交原理（suppression subtractive hybridization，SSH） 以杂交为基础，并与以杂交为基础，并与PCR技术技术结合的结合的cDNA消减杂交方法。消减杂交方法。 应用：应用：差异表达新基因的筛选与克隆。差异表达新基因的筛选与克隆。45SSHSSH原理原理46 cDNA Chip and Microarray () 基因芯片和微阵列基因芯片和微阵列47 基因芯片上的阵列是由有规基因芯片上的阵列是由有规则排列的则排列的cDNA或寡核苷酸等

17、样或寡核苷酸等样本所组成的本所组成的 。 基因表达高通量分析法基因表达高通量分析法。48DNA微阵列：微阵列： cDNA微阵列（微阵列（cDNA microarray） 寡核苷酸微阵列（寡核苷酸微阵列（oligomicroarray）49cDNA微阵列微阵列: 在一微小的基片（硅片等）表面在一微小的基片（硅片等）表面集成了大量分子识别探针，能够平行集成了大量分子识别探针，能够平行分析大量基因转录表达，因此又被称分析大量基因转录表达，因此又被称为为cDNA芯片。芯片。50基因表达谱芯片主要技术流程：基因表达谱芯片主要技术流程：样品荧光标记样品荧光标记芯片制备芯片制备 芯片杂交芯片杂交芯片洗涤和扫

18、描芯片洗涤和扫描 扫描图像分析扫描图像分析10251核酸杂交技术和微阵列芯片核酸杂交技术和微阵列芯片克隆克隆DNADNAcDNAcDNA标记标记阵列阵列(Array,Macroarray)杂交、显影杂交、显影高密度高密度微阵列微阵列( Microarray )10352CBACy5-标记标记cDNACy3-标记标记cDNACBACBACBACBACBACBA样品样品1样品样品2Cy5/Cy3荧光标记荧光标记RNARNA提取提取竞争性杂交显示竞争性杂交显示基因表达量差异基因表达量差异二种样品竞争性杂交示意图二种样品竞争性杂交示意图基因表达谱芯片的原理10453生物学问题提出，表达基因分析，生物学

19、问题提出，表达基因分析，样本分类与实验预测样本分类与实验预测 .实验设计实验设计基因芯片实验基因芯片实验图象分析图象分析结果标准化结果标准化基因表达谱芯片研究应用思路基因表达谱芯片研究应用思路10554某些基因表达异常或存在差异某些基因表达异常或存在差异生物学确证和解释分析生物学确证和解释分析下一步实验设计下一步实验设计55 cDNAcDNA芯片可定量芯片可定量监测大量基因表达水监测大量基因表达水 平，阐述基因功能，探索疾病原因及平，阐述基因功能，探索疾病原因及 机制、发现诊断及治疗靶基因机制、发现诊断及治疗靶基因等。等。cDNAcDNA芯片在医学中的应用芯片在医学中的应用 Northern

20、blot或或RT-PCR验证。验证。 基因表达基因表达数据的生物信息学分析。数据的生物信息学分析。56() Western免疫印迹免疫印迹 Western blot原理与核酸分原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。到固相支持物上的蛋白质分子。5758Western blot程序：程序： 蛋白质样品制备蛋白质样品制备 SDS-PAGE分离分离 蛋白质转膜蛋白质转膜 标记抗体与膜上蛋白质抗原杂交标记抗体与膜上蛋白质抗原杂交 检测并分析标记物信号检测并分析标记物信号59Western免疫

21、印迹信号检测原理免疫印迹信号检测原理60 Luminol化学发光原理化学发光原理 61 另一种信号显示方法是在另一种信号显示方法是在洗去一抗后，加入碱性磷酸酶洗去一抗后，加入碱性磷酸酶标记的二抗，再用标记的二抗，再用BCIPBCIPNBTNBT在在膜上直接显色。膜上直接显色。62免疫沉淀技术免疫沉淀技术 是一种抗原抗体反应技术，只是将抗是一种抗原抗体反应技术，只是将抗体分子先结合到固相载体如磁珠上，然后体分子先结合到固相载体如磁珠上，然后与含目标蛋白的细胞裂解液进行液相杂交与含目标蛋白的细胞裂解液进行液相杂交反应，利用磁场或离心等技术将结含在抗反应，利用磁场或离心等技术将结含在抗体上的蛋白质收

22、集起来，电泳分离，用于体上的蛋白质收集起来，电泳分离，用于Western blot分析。分析。63() 聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction64引言引言 PCR技术发明技术发明（1985，Mullis K.） PCR及其相关技术及其相关技术发展速度惊人、发展速度惊人、 应用迅速广泛应用迅速广泛（分子生物学、医学、生物学、考古学等学科领域）（分子生物学、医学、生物学、考古学等学科领域） 获获Nobel 化学奖化学奖（1993， Mullis K. ）65讲授内容提要讲授内容提要:一、一、PCRPCR技术原理技术原理二、耐热二、耐热DNADNA聚合酶聚合酶

23、三、三、PCRPCR引物及设计原则引物及设计原则四、四、PCRPCR条件的优化条件的优化 五、五、PCRPCR改进技术改进技术66聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR) :一、一、PCRPCR技术原理技术原理 Mullis K. 1985年年发明的一种模拟天然发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸复制过程的核酸体外扩增技术。体外扩增技术。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 67DNA复制复制半保留复制半保留复制半不连续复制半不连续复制冈崎片段冈崎片段领头链领头链随从链随从链68引物的化学本质是什么？引物的化学本质是什么？单链寡核苷酸单链寡核苷酸DNA或或RNA

24、片段。片段。DNA复制引物：单链复制引物：单链RNA片段片段PCR引物：引物： 单链单链DNA片段片段69（一）（一）PCR基本过程基本过程1. PCR循环由三步组成：循环由三步组成： 变性变性（denaturation）退火退火（annealing）延伸延伸（extension）70PCR原理原理低温退火低温退火高温变性高温变性中温延伸中温延伸71 在模板在模板DNA、引物、引物、4种种dNTP存在条件下，依赖存在条件下，依赖DNA 聚聚合酶合酶催化一对引物间特异催化一对引物间特异DNA片片段合成段合成的体外扩增技术。的体外扩增技术。 2. PCR定义：定义：723. PCR扩增终产物大小扩

25、增终产物大小: 介于两条退火引物介于两条退火引物55末末端之间的端之间的双链双链DNA片段片段。734.4.什么叫什么叫引物延伸产物引物延伸产物？ 比两引物限定区长的延比两引物限定区长的延伸产物。伸产物。仅发生在以原始模仅发生在以原始模板板DNA为模板的扩增过程中为模板的扩增过程中，以倍数形式扩增以倍数形式扩增(2n)。74 Y=A（1+E）n Y: 扩增产物的量扩增产物的量 A: 最初靶最初靶DNA分子数分子数 E: PCR扩增效率扩增效率 n: 循环次数循环次数 5. PCR产量产量 当当E100, A=1时时 Y=2n 2n(引物延伸产物的量）引物延伸产物的量）75PCR thermal

26、 cyclerRotor-Gene76PCRPCR产物的产物的琼琼脂糖凝胶电泳分析脂糖凝胶电泳分析77（二）平台期与平台效应（二）平台期与平台效应1. 平台效应平台效应（plateau effect）：）： PCR经过一定数量的循环后，经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是片段不再呈指数累积，而是进入静止期进入静止期即平台期即平台期。78PCR平台效应平台效应792. 平台期平台期影响因素：影响因素： 引物及引物及dNTP底物浓度降低。底物浓度降低。 酶与模板比例下降。酶与模板比例下降。 实际应用提示实际应用提示： 定量定量PCR应考虑平台期效应，应考虑平台期效应，选择最适循环次

27、数。选择最适循环次数。80二、耐热二、耐热DNA聚合酶聚合酶（三）高保真的耐热（三）高保真的耐热DNA聚合酶聚合酶（二）（二）Taq DNA聚合酶聚合酶（一）（一）PCR耐热耐热DNA聚合酶的发现聚合酶的发现81（一）一） PCR耐热耐热DNA聚合酶的发现聚合酶的发现 2.T4 与与T7 DNA聚合酶聚合酶:热稳定性差。热稳定性差。1. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段 ： 热稳定性差，不耐高温。热稳定性差，不耐高温。 反应温度偏低，产生非特异扩增。反应温度偏低，产生非特异扩增。3.3.TaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶: :实现了实现了PCR自动化自动化82（二）

28、（二）Taq DNA聚合酶聚合酶 从嗜热水生菌从嗜热水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分离出来。株中直接分离出来。 基因全长基因全长:2,496 bp 编码蛋白质编码蛋白质: 832个个AA, 94 kd C端结构域端结构域: 53外切酶活外切酶活性性 N端结构域端结构域: 聚合酶活性聚合酶活性HOOCNH2831.1.较高的热稳定性较高的热稳定性 95的半衰期的半衰期: 40 min 最适温度最适温度: 72 80 催化反应催化反应速率速率: 150300核苷酸核苷酸 / 秒秒/ 酶分子酶分子84Taq DNA聚合酶特性：聚合酶特性： 53聚合酶活性；聚合酶活性； 53

29、外切酶活性；外切酶活性； 逆转录酶活性；逆转录酶活性； 较弱的非模板依赖性；较弱的非模板依赖性； 缺乏缺乏35外切酶活性。外切酶活性。852. 无机离子及抑制剂无机离子及抑制剂 Taq DNA聚合酶的活性聚合酶的活性对对Mg 2+ 浓度和单价离子（浓度和单价离子（K+或或NH4+）的性质和浓度较敏感。）的性质和浓度较敏感。 最适最适Mg 2+浓度浓度：2 mmol/L K+浓度浓度：50 mmol/L863. 保真性保真性DNA聚合酶聚合酶35 外切外切酶活性酶活性核苷酸的错核苷酸的错误掺入率误掺入率T4 DNA聚合酶聚合酶1/260 000T7 DNA聚合酶聚合酶1/190 000Kleno

30、w片段片段1/140 000Taq DNA聚合酶聚合酶1/41 00087如何提高如何提高PCR DNA聚合酶的保真性？聚合酶的保真性？ 使用使用Taq DNA聚合酶时，聚合酶时，掺入少量具掺入少量具有有35外切酶活性的耐热外切酶活性的耐热DNA聚合聚合酶酶,错配率可降为原来的错配率可降为原来的1/10； 使使四种四种dNTP底物浓度相等底物浓度相等； MgCl2浓度尽可能低；浓度尽可能低； 减少循环数。减少循环数。88（三）几种高保真的耐热（三）几种高保真的耐热DNA聚合酶聚合酶 1. Tth DNA聚合酶聚合酶 2. Vent DNA聚合酶聚合酶 3. Pfu DNA聚合酶聚合酶89三、三

31、、PCR引物及设计原则引物及设计原则（一）引物设计原则（一）引物设计原则（二）引物用量计算（二）引物用量计算90（一）引物设计原则（一）引物设计原则 引物序列及其与模板特引物序列及其与模板特异性结合异性结合是决定是决定PCR反应结反应结果的关键。果的关键。911 1.引物设计原则引物设计原则: :引物之间引物之间：避免：避免3端互补端互补92引物自身引物自身：不应形成二级结构：不应形成二级结构引物引物5末端碱基末端碱基:可不与模板可不与模板 DNA互补互补引物引物3末端碱基末端碱基：最好选：最好选T、 C、 G，不选，不选A93引物引物5端修饰技术端修饰技术附加核酸序列附加核酸序列 用用 途途

32、 限制酶位点限制酶位点 克隆（如定向克隆）克隆（如定向克隆）噬菌体启动子噬菌体启动子 合成合成RNA探针、测序探针、测序蛋白质结合序列蛋白质结合序列 产物纯化、检测产物纯化、检测核糖体结合序列核糖体结合序列 高效表达高效表达加错配加错配碱基造成突变碱基造成突变 定点诱变定点诱变942. 简并引物简并引物（degenerate primers）: 针对某一基因编码蛋白的针对某一基因编码蛋白的氨基酸区域设计的一组碱基序氨基酸区域设计的一组碱基序列不同，但有相同碱基数的寡列不同，但有相同碱基数的寡核苷酸混合物。核苷酸混合物。95 简并引物设计及简并引物设计及应用：应用： 对纯化的未知蛋白测定一段短对

33、纯化的未知蛋白测定一段短 氨基酸序列。氨基酸序列。 不同物种某一基因编码的保守不同物种某一基因编码的保守 氨基酸区域。氨基酸区域。应用应用：基于简并引物：基于简并引物PCR策略克隆策略克隆 新基因新基因963.3.引物设计缺陷而引起的后果引物设计缺陷而引起的后果97 4.4.优化的引物设计实例优化的引物设计实例上游引物序列：上游引物序列： 5GAGAACATGGTGCGCAGGTT 3下游引物序列：下游引物序列：5TGCCCATCATCATGACCTGG 3985 CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGA

34、GCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG GGTCCAGTACTACTACCCGT AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCGGAGCCC

35、AACTGCGCCGACCCC 399100四、四、PCR条件的优化条件的优化(一一) Taq DNA聚合酶浓度：聚合酶浓度： 1.02.5 U/100 l反应液反应液 (二二) dNTP浓度：浓度：20200 mol/L (三三) Mg2+浓度：浓度：0.52.5 mmol/L (四四) 引物浓度：引物浓度：0.10.5 mol/L101PCR应用举例应用举例遗传病遗传病诊断：镰状细胞贫血诊断：镰状细胞贫血 6 Glu Val (GAG GUG) PCR扩增扩增6 DNA区域区域传染病传染病诊断：诊断：HBV和和HIV肿瘤分子标志肿瘤分子标志诊断诊断: bcr-abl PML/RAR个体识别

36、个体识别: 亲子鉴定与刑事侦破亲子鉴定与刑事侦破生物生物考古考古102五、五、PCR改进技术改进技术（一）（一）RT-PCR (reverse transcription PCR) 以以mRNAmRNA为模板逆转录合成为模板逆转录合成cDNAcDNA，再以此，再以此cDNAcDNA为模板进为模板进行行PCRPCR反应反应。103RT-PCR原理原理104逆转录酶逆转录酶 AMV（avian myeloblastosis virus） 酶活性最适温度酶活性最适温度42 MMLV（Moloney murine leukemia virus）：最适温度）：最适温度37 105（二） 定量定量RT-P

37、CR（QRT-PCR） PCR扩增指数期内极小的扩增效率扩增指数期内极小的扩增效率改变会极大地影响产量。改变会极大地影响产量。1. 半定量半定量RT-PCR 以样本以样本mRNA为模板逆转录为模板逆转录合成合成cDNA，在不同引物对引导，在不同引物对引导下共同下共同PCR扩增扩增“看家看家”基因基因和和目的基因目的基因cDNA 。106 选择内对照基因选择内对照基因 组织中普遍表达、表达量比组织中普遍表达、表达量比较恒定的较恒定的“看家看家”基因基因mRNA。如如GAPDH和和 -actin mRNA等。等。 半定量标准半定量标准 计算计算PCR 产物产物 ： 靶靶cDNA /GAPDH cD

38、NA107 RT-PCR验证验证G-Rh2诱导诱导TNFmRNA表达上调表达上调25mol/L G-Rh2 12 h 24 h 48 h 72 h + + + + TNFGAPDH 举例举例1082. Real-time RT-PCR原理：原理： PCR体系加入一种体系加入一种双色荧光双色荧光标记的寡核苷酸探针标记的寡核苷酸探针，根据探针，根据探针上荧光信号的变化，计算模板上荧光信号的变化，计算模板DNA的含量。的含量。 109 实时实时PCR应用：应用：用于基因用于基因DNA拷贝数和拷贝数和mRNA表达定量分析。表达定量分析。110定量检测定量检测PCR产物的指示系统产物的指示系统: TaqMan和和Molecular Beacon，均 依 赖均 依 赖 荧 光 共 振 能 量 转 移荧 光 共 振 能 量 转 移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）。）。111 TaqMan Probe 寡核苷酸探针寡核苷酸探针的的5端标记一个报端标记一个报告荧光染料（告荧光染料（reporter fluorescence dye），），3端标记一个淬灭染料端标记一个淬灭染料（quencher dye）。）。112 当光源照射到探针时，被当光源照射到探针时，被激激发的报告荧光染料发的报告荧光染料将能量转移给将能量转移给