生化试验理论课第五章诊断酶学new

1、郑州大学第一附属医院郑州大学第一附属医院第五章第五章 诊断酶学诊断酶学 退出退出 卫生部卫生部“十一五十一五” 规划教材规划教材 全国高等医药教材建设研究会规划教材全国高等医药教材建设研究会规划教材检验科检验科 敬明辉敬明辉 主要内容 六、六、 同工酶和亚型的测定同工酶和亚型的测定 一、酶的一般特征一、酶的一般特征 二、血清酶二、血清酶 三、酶促反应动力学三、酶促反应动力学 四、酶活性浓度测定技术四、酶活性浓度测定技术 五、五、 酶的免疫化学测定酶的免疫化学测定 七、工具酶及其临床应用七、工具酶及其临床应用 八、临床常用血清酶及其同工酶八、临床常用血清酶及其同工酶 第一节第一节 酶的一般特征酶

2、的一般特征 返回章返回章 1. 1. 酶、核酶。酶、核酶。2. 2. 酶的催化特性酶的催化特性：极高的催化效率、高度的特异性、：极高的催化效率、高度的特异性、催化作用的可调节性。催化作用的可调节性。3. 3. 酶促反应：酶促反应：酶所催化的反应。酶所催化的反应。 酶活性：酶活性：酶催化反应的能力。酶催化反应的能力。 底物底物(S)(S)：酶所作用的物质。酶所作用的物质。 产物产物(P)(P)：酶促反应的生成物。酶促反应的生成物。 酶的激活剂酶的激活剂: : 加速酶促反应的物质。加速酶促反应的物质。 酶的抑制剂酶的抑制剂: : 减慢或终止酶促反应的物质。减慢或终止酶促反应的物质。一、基本概念一、

3、基本概念 返回节返回节 二、酶的结构与催化作用二、酶的结构与催化作用 单纯酶和结合酶单纯酶和结合酶 单纯酶：单纯酶：只含多肽链，是单纯蛋白质。只含多肽链，是单纯蛋白质。 结合酶：结合酶：由酶蛋白和辅因子组成。由酶蛋白和辅因子组成。 两者结合后形成的复合物称为全酶。两者结合后形成的复合物称为全酶。 与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。 与酶蛋白结合牢固的称为辅基。与酶蛋白结合牢固的称为辅基。 酶的活性中心酶的活性中心 酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特定区域。一个特定区域。 酶的催化作用机制酶的催化作用机制 诱导契合

4、学说。诱导契合学说。 返回节返回节 三、酶的命名、分类及编号三、酶的命名、分类及编号 返回节返回节 临床应用酶临床应用酶ECEC编号编号习惯用名习惯用名英语缩写英语缩写ECEC编号编号习惯用名习惯用名英语缩写英语缩写1.1.1.271.1.1.27乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶LDLD、LDHLDH2.7.3.22.7.3.2肌酸激酶肌酸激酶CKCK、CPKCPK1.1.1.371.1.1.37苹果酸脱氢酶苹果酸脱氢酶MDMD、MDHMDH3.1.1.33.1.1.3脂肪酶脂肪酶LPSLPS1.1.1.411.1.1.41异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶ICDICD、ICDHICDH3.1.1.83.1.1

5、.8胆碱酯酶胆碱酯酶CHECHE1.1.1.491.1.1.496-6-磷酸葡萄糖脱氢酶磷酸葡萄糖脱氢酶G6PDHG6PDH3.1.3.13.1.3.1碱性磷酸酶碱性磷酸酶ALPALP、AKPAKP1.4.1.31.4.1.3谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶GLDGLD、GLDHGLDH3.1.3.23.1.3.2酸性磷酸酶酸性磷酸酶ACPACP1.4.3.41.4.3.4单氨氧化酶单氨氧化酶MODMOD3.1.3.53.1.3.55-5-核苷酸酶核苷酸酶5-NT5-NT2.1.3.32.1.3.3鸟氨酸氨甲酰基转移酶鸟氨酸氨甲酰基转移酶OCTOCT3.2.1.13.2.1.1-淀粉酶淀粉酶AMYAM

6、Y、AMSAMS2.3.2.22.3.2.2-谷氨酰基转移酶谷氨酰基转移酶-GT-GT、GGTGGT3.2.1.303.2.1.30-N-N-乙酰乙酰( (基基)-)-D D氨基葡萄糖苷酶氨基葡萄糖苷酶NAGNAG2.4.1.12.4.1.1糖原磷酸化酶糖原磷酸化酶GPGP3.2.1.513.2.1.51-L-L-岩藻糖苷酶岩藻糖苷酶-FU-FU、AFUAFU2.5.1.182.5.1.18谷胱甘肽转移酶谷胱甘肽转移酶GSTGST3.4.23.13.4.23.1亮氨酸氨基肽酶亮氨酸氨基肽酶LAPLAP2.6.1.12.6.1.1门冬氨酸氨基转移酶门冬氨酸氨基转移酶ASTAST、GOTGOT4.

7、1.2.134.1.2.13果糖二磷酸醛缩酶果糖二磷酸醛缩酶ALDALD2.6.1.22.6.1.2丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶ALTALT、GPTGPT1.类别 1，亚类 1，亚-亚类 27，编号顺序 第二节第二节 血清酶血清酶 返回章返回章 血浆特异酶血浆特异酶 为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入，催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入，在一定条件下被激活起作用。与凝血有关的酶或酶在一定条件下被激活起作用。与凝血有关的酶或酶原、原、ChEChE、CpCp及及LPLLPL等。等。非血浆特异酶非血浆

8、特异酶 外分泌酶：外分泌酶：由外分泌腺合成并分泌进入血浆的由外分泌腺合成并分泌进入血浆的酶酶, ,包括包括P-AMYP-AMY、P-LPSP-LPS、前列腺、前列腺ACPACP等。等。 细胞内酶：细胞内酶：存在于细胞内进行物质代谢的酶，存在于细胞内进行物质代谢的酶，随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。当其随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。当其大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受大量出现于血清中时，提示酶的来源组织细胞受损，最常用于临床诊断。损，最常用于临床诊断。ASTAST一、血清酶的来源一、血清酶的来源 返回节返回节 二、血清酶的去路二、血清酶的去路 血清酶的半寿期血清酶的半

9、寿期 (T1/2) (T1/2) 定义：定义： 酶失活至原来一半时所需时间。酶失活至原来一半时所需时间。 半寿期半寿期代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶，代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶，在血清中持续时间长。在血清中持续时间长。 ALT ALT大于大于ASTAST 血清酶的失活和排泄血清酶的失活和排泄 酶的清除酶的清除主要是在血管内失活或分解。主要是在血管内失活或分解。 血清酶血清酶经蛋白酶水解产物（多肽或氨基酸）经蛋白酶水解产物（多肽或氨基酸） 可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨基可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨基酸后被重吸收，其中大部分可被组织利用，不能酸后被重吸收，其中大部分

10、可被组织利用，不能利用的氨基酸则随尿排出体外。利用的氨基酸则随尿排出体外。 返回节返回节 三、血清酶的生理变异三、血清酶的生理变异 1 1.性别性别 少数酶如CK、ALP及GGT等有性别差异，与血清酶的 来源组织有关; 女性雌激素原因LD升高, 男性肌肉发 达CK升高 。2.年龄 血清酶的活性随年龄而变化，ALP和GGT到老年时可有 轻度升高。年龄差异也见于同工酶; ALP在骨骼中与成 骨细胞有关儿童升高 。3.进食 过量饮酒可使血清GGT明显升高。4.运动 多种血清酶活性升高，如CK、LD、AST、ALD和ALT 等，其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及 骨骼肌所含的酶量有关。5.妊娠

11、 胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、 LD、LAP和ALT（少数）等，引起血清中这些酶活性升 高,妊娠由于血容量升高血液稀释血浆蛋白下降肠道吸 收脂肪能力增加APOB,APOA,TG,TC升高妊娠中后期由于 雌激素G升高分娩时由于肌肉强烈收缩CK升高 。6.其他 一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变 化及家庭因素有关。 返回节返回节 酶合成异常酶合成异常u合成减少合成减少 慢肝凝血酶减少慢肝凝血酶减少PTPT延长延长 铜氧化酶减少铜氧化酶减少u合成增多合成增多 增殖性疾病增殖性疾病 骨骼疾病骨骼疾病ALP ALP 前列腺癌前列腺癌ACP ACP 酶释放增加酶释放增加:

12、: 大多数血清酶增高的主要原因大多数血清酶增高的主要原因u细胞内外酶浓度差异细胞内外酶浓度差异 LD LD 红细胞比血清红细胞比血清100100倍倍u酶蛋白分子量的大小酶蛋白分子量的大小 LDCKLDCK当心梗当心梗CKCK升高早于升高早于LDLDu酶的组织分布酶的组织分布 AST,ALT,CKAST,ALT,CK分别以心肝骨最丰富分别以心肝骨最丰富 u酶在细胞内定位和存在形式酶在细胞内定位和存在形式 在细胞容易释放入血在在细胞容易释放入血在 线粒体线粒体ASTAST难释放等到细胞出现坏死病变才能释放入血难释放等到细胞出现坏死病变才能释放入血 GGT GGT存在肝毛细胆管上皮细胞，肝胆疾病就上

13、升存在肝毛细胆管上皮细胞，肝胆疾病就上升 酶的清除异常酶的清除异常 不同疾病和不同的酶从血中清除时间和机制不同。不同疾病和不同的酶从血中清除时间和机制不同。 如如AMYAMY和和ALPALP经肾脏或胆道排出异常而致血清酶升高。经肾脏或胆道排出异常而致血清酶升高。 返回节返回节 第三节第三节 酶促反应动力学酶促反应动力学 返回章返回章 Michaelis Michaelis 和和MentenMenten提出的酶作用的中间产物学说提出的酶作用的中间产物学说: : maxSKmSVV一、米曼氏方程一、米曼氏方程 E+SK1K2K3 返回节返回节 19131913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关

14、系的年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的 方程式，即米方程式，即米- -曼氏方程曼氏方程(Michaelis-Menten (Michaelis-Menten equation):equation):E+PES二、二、KmKm与与Vmax Vmax KmKm值：值：等于酶促反应的初速率为最大速率等于酶促反应的初速率为最大速率VmaxVmax一半一半 时的底物浓度，即时的底物浓度，即V VVmaxVmax时，则时，则KmKmSS。KmKm 在临床上的应用：在临床上的应用： 反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。反映酶与底物的亲合力，且与亲合力成反比。 用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相

15、当于最用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的百分率。大反应速度的百分率。 根据根据KmKm值选择酶的最适底物值选择酶的最适底物, ,几种低物几种低物KMKM最小此酶最最小此酶最 适底物适底物 确定工具酶用量。确定工具酶用量。 确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依据确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依据, ,寻寻 找代谢的限速步骤找代谢的限速步骤KMKM最大的酶所催化的反应最大的酶所催化的反应 VmaxVmax：酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一酶完全被底物饱和时的反应速度，代表了在一 定酶量下的最大反应速率定酶量下的最大反应速率。 返回节返回节 三、酶促反应进程

16、曲线三、酶促反应进程曲线 如将酶反应过程中测得的产物如将酶反应过程中测得的产物PP或底物或底物SS变化量对时间作图，可得酶促反变化量对时间作图，可得酶促反应时间进程曲线。图中产物应时间进程曲线。图中产物PP或底物或底物SS变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。延滞期延滞期线性反应期线性反应期底物耗尽期底物耗尽期必须根据线性反应期必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算的反应速率才能准确计算出酶活性浓度。出酶活性浓度。 返回节返回节 四、影响酶促反应的因素四、影响酶促反应的因素 底物浓度对酶促反应的影响底物浓度对酶促反应的影响（1 1）当）当SKmSKm SKm

17、时时，反应速率，反应速率与底物浓度与底物浓度SS无关，无关， V VVmaxVmaxK EK E 称为称为零级反应零级反应，反应速率反应速率与酶浓度与酶浓度EE成正比成正比。酶学测。酶学测定时一般底物浓度可选择为定时一般底物浓度可选择为KmKm的的10102020倍。倍。 返回节返回节 四、影响酶促反应的因素四、影响酶促反应的因素 1.1.酶浓度过高过早或过多消耗底物酶浓度过高过早或过多消耗底物肝炎肝炎ALTALT升高需生理盐水稀释升高需生理盐水稀释2.2.底物底物 KM KM值小，足够溶解度，特值小，足够溶解度，特异性高，稳定性好异性高，稳定性好3.pH 3.pH 植物酶植物酶4.5-6.5

18、4.5-6.5，动物酶，动物酶6.5-6.5-8 8，选择与生理环境接近。，选择与生理环境接近。ACP ACP pH4-7 ALP pH9-10pH4-7 ALP pH9-104.4.温度温度 动物酶动物酶35-4035-40度，植物酶度，植物酶40-6040-60度，升高度，升高1010度反应速度增度反应速度增加加1-21-2倍，倍，3737度误差小于度误差小于0.10.1度度5.5.激活剂抑制剂激活剂抑制剂 返回节返回节 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度（v v）达到最大速度）达到最大速度VmaxVmax，即在过量底物存在下的，即在过量底物存在下

19、的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度EE之之间存在线性关系。间存在线性关系。第四节第四节 酶活性浓度测定技术酶活性浓度测定技术 返回章返回章 1.1.按反应时间分类按反应时间分类: : 定时法定时法 不能保证整个反应都在零级反应期进行，因为需不能保证整个反应都在零级反应期进行，因为需要终止反应。要终止反应。 连续监测法连续监测法 2.2.按检测方法分类按检测方法分类： 量气法、分光光度法、荧光法量气法、分光光度法、荧光法 其它方法（其它方法（ 放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极谱法、极谱法、HPLCHPLC或

20、生物发光法等）。或生物发光法等）。一、酶活性浓度测定方法一、酶活性浓度测定方法 返回节返回节 Ex Ex 为待测酶，为待测酶，A A为底物，为底物，B B为中间产物。为中间产物。 A A、B B二物质的变二物质的变化无法直接监测，此时可外加第二个酶化无法直接监测，此时可外加第二个酶Ei(Ei(为指示酶为指示酶) )，其，其底物为底物为B B，反应产物为，反应产物为P P可直接测定。可直接测定。PBAEiEx二、酶偶联法二、酶偶联法 返回节返回节 酶偶联反应酶偶联反应 最简单的模式为：最简单的模式为： 辅助反应辅助反应 如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直

21、接偶联，此时还可在始发反应和指示反应之间加其直接偶联，此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。模式为：模式为：PCBAEiEaEx 返回节返回节 其中，其中，B B、C C均为中间产物，均为中间产物，EaEa、EiEi都为工具酶。都为工具酶。最后最后一个酶称指示酶一个酶称指示酶EiEi，其他外加的酶都为辅助酶（，其他外加的酶都为辅助酶（EaEa）。）。酶偶联法测定酶偶联法测定ALTALT的吸光度变化图的吸光度变化图 返回节返回节 方法条件的选择方法条件的选择 尽可能采用连续监测法；减少步骤尽可能采用连续监

22、测法；减少步骤, , 化学试剂有一定纯度化学试剂有一定纯度, ,双蒸水双蒸水, ,使用双试剂。使用双试剂。 测定参数的设置测定参数的设置 方法类型、波长、样品量与试剂量、方法类型、波长、样品量与试剂量、 稀释水量、试剂吸光度上下限、空白速率、反应孵育时稀释水量、试剂吸光度上下限、空白速率、反应孵育时 间、延迟间、延迟, ,监测时间、底物耗尽限额、线性范围及计算监测时间、底物耗尽限额、线性范围及计算 因子因子F F值。值。 标本的采集、运输与保存标本的采集、运输与保存 影响因素：溶血、抗凝剂、温度等。影响因素：溶血、抗凝剂、温度等。 干扰因素的控制干扰因素的控制 反应干扰。污染。底物自行发生反反

23、应干扰。污染。底物自行发生反 应。应。三、血清酶活性浓度测定条件的选择三、血清酶活性浓度测定条件的选择 返回节返回节 测定参数的选择测定参数的选择u方法类型 终点法 连续监测法u波长 吸光度最大的波长 双波长注明主波长次波长双波长能有效的消除干扰的影响u样品量与试剂量 考虑灵敏度和测定上线 样品:试剂=1:10 比例降低灵敏度下降 过高测定线性下降样品需稀释后复检机会增多 返回节返回节 u稀释水量稀释水量 目的:洗出粘附在采样针内壁上的微量血清 减少加样误差同时避免试剂间的交叉污染（酸性试剂）u试剂吸光度上线下线试剂吸光度上线下线 上线正向反应求得比色杯的光径如上线为0.5 0.7设置为0.3

24、5 下线负向反应ALT下线为1.2 0.7比色杯设置为0.8u试剂空白速率试剂空白速率 试剂每批空白吸光度波动0.015A试剂在监测过程中底物自动降解得到的结果以水为空白监测样品测定结果能自动扣除试剂空白数据u孵育时间孵育时间 自动分析仪应选择最大反应时间一般为5分钟终点法G,CHO,TG,TC必须测定酶试剂反应达到终点时间因37度反应慢u延迟试间延迟试间 连续监测与终点法相同酶与底物混合后需要一定时间使酶激活直到线性反应时间才能开始监测（有时用工具酶将内源性代谢物耗尽如ALT先试剂1将样品中所含的丙酮酸消耗完然后加试剂2）单试剂法需30秒 辅酶越过，就越长u监测时间监测时间 90-120秒至

25、少4个点 少于3个点A不能称为连续监测法 不能计算线性度（不知是否为线性反应）监测时间过长容易发生低物耗尽 可测范围变窄稀释样品过多u低物耗尽限额低物耗尽限额 两法相同l 零点与监测第一点吸光度的差额l 吸光度上升或下降至指定吸光度的数值超过限额说明样品酶活性非常高低物耗尽随后监测吸光度不可靠应稀释样品5-10倍u线性范围线性范围 按试剂质量而定 超过范围应需样品稀释或增加样品u线性度线性度 连续监测法用线性大说明A之间不成线性超过限额说明低物不足监测结果会变低 应稀释后重作 一般15仪器说明书uK K因子值因子值 升高线性范围宽重复性差，降低线性范围窄精密度好，与酶升高线性范围宽重复性差，降

26、低线性范围窄精密度好，与酶的参考值，测定时间和噪音有关，如的参考值，测定时间和噪音有关，如K K等于等于80008000，噪音，噪音0.001/0.001/分结果分结果误差误差8U/L8U/L，对于值比较低的结果，影响较大。，对于值比较低的结果，影响较大。 返回节返回节 标本的采集、运输与保存标本的采集、运输与保存u溶血溶血l 红细胞内红细胞内LDH,ACP,AST,KLDH,ACP,AST,K分别比血浆高分别比血浆高160160，6868，6 6，2323倍，倍，释放释放HBHB会影响比色法原理检测方法注明样品溶血会影响比色法原理检测方法注明样品溶血 u采集时间采集时间l 固定时间消除血液成

27、分昼夜变动n心梗肌红动态监测CK-MB48-72小时后恢复正常 u 采血体位采血体位l 站立时血管内水会进入组织液相对增高 大分子物质与此相同 如ALB,TP,TG,TC,LDL,AST,ALP升高5-15，应坐位5分后采集 返回节返回节 标本的采集、运输与保存标本的采集、运输与保存u压脉带压脉带 l pHpH下降下降K K+ +从细胞内移出结果升高，应时间为从细胞内移出结果升高，应时间为1 1分分 u采血针采血针 l 20号以上过小容易引起溶血 u抗凝剂抗凝剂 EDTA可去除CA等离子l 肝素锂， 草酸盐可抑制AMY ACP活性 标本的采集、运输与保存标本的采集、运输与保存u空气光线影响空气

28、光线影响 l 血气分析不能有气泡，空气中氧高于动脉血，二氧化碳低于动脉血气分析不能有气泡，空气中氧高于动脉血，二氧化碳低于动脉血，胆红素吸收可见光发生分解作用，样品在光线中血，胆红素吸收可见光发生分解作用，样品在光线中9 9小时总胆红小时总胆红素直胆红素下降素直胆红素下降4040，阳光直射，阳光直射1 1小时下降小时下降5050u样品的唯一性标志样品的唯一性标志 l 条码、送检应分离血清3小时否则K升高G下降大部分酶在低温中较稳定u温度温度 l 反应温度37度，保存大部分酶室温保存1-3天，但ACP37度1小时活性下降50 标本的采集、运输与保存标本的采集、运输与保存u干扰因素干扰因素 样品是

29、体液（血清或血浆） l 其他酶和物质的干扰ALT产物旁路效应ALT催化生成的产物丙酮酸在LD催化下被消耗掉从而影响结果（赖氏法手工法）l 酶的污染试剂酶从动物或细菌中提取易污染其他酶l 非酶反应低物不稳定没有酶的作用自行反应l 分析容器的污染 金属离子l 沉淀形成（脂类血清）酶活性单位酶活性单位惯用单位惯用单位 惯用单位是酶活性测定方法的建立者所规定的单惯用单位是酶活性测定方法的建立者所规定的单位。由于单位定义不同，参考范围差别很大，难以进行比较。位。由于单位定义不同，参考范围差别很大，难以进行比较。国际单位国际单位（IUIU） 在特定的条件下，每分钟转化在特定的条件下，每分钟转化1 1 mo

30、lmol底物底物的酶量为一个国际单位。的酶量为一个国际单位。 以以IUIU表示，表示，1IU=11IU=1 mol.minmol.min-1-1。KatalKatal单位单位 在规定条件下，每秒钟转化在规定条件下，每秒钟转化1mol1mol底物的酶量为底物的酶量为1kat1kat， 1kat=1mol.s 1kat=1mol.s-1-1。常用单位为。常用单位为 katalkatal或或 nkatal nkatal。 Kat Kat与与IUIU的换算关系为：的换算关系为： 1IU=11IU=1 molmolminmin-1-1=16.67nmol=16.67nmols s-1-1= 16.67n

31、katal= 16.67nkatal四、酶活性浓度的单位四、酶活性浓度的单位 返回节返回节 酶活性浓度单位酶活性浓度单位 临床上酶活性浓度采用每单位体积（升）所含的酶活临床上酶活性浓度采用每单位体积（升）所含的酶活性单位数表示。性单位数表示。 酶活性浓度单位的计算酶活性浓度单位的计算 连续监测法根据摩尔消光系数进行酶活性浓度的计算。连续监测法根据摩尔消光系数进行酶活性浓度的计算。 公式如下：公式如下：LvVALU610min/ 返回节返回节 用自动生化分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上用自动生化分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上来讲来讲V V、v v和和L L均为固定值，均为固定值，

32、为常数，则将公式为常数，则将公式 简化为简化为 如如LDLD活性浓度，已知活性浓度，已知NADHNADH的的 为为6.226.22 10103 3cmcm-1-1.mol.mol-1-1，血，血清量为清量为5050 l l，底物液为，底物液为1ml1ml，比色杯光径为，比色杯光径为1cm1cm，则，则 F=1.05F=1.05 10106 6/6.22/6.22 10 103 3 0.050.05 1=33761=3376FALUmin/LvVF610LvVALU610min/五、系数五、系数K K值的计算与应用值的计算与应用 返回节返回节 使用推荐方法和参考方法使用推荐方法和参考方法使用公认

33、的酶校准物或酶参考物使用公认的酶校准物或酶参考物标准化途径标准化途径l 建立原级参考方法建立原级参考方法 l 制备原级参考物制备原级参考物 l 建立参考实验室网络建立参考实验室网络 酶活性浓度测定的参考系统酶活性浓度测定的参考系统六、临床酶学测定的标准化六、临床酶学测定的标准化 返回节返回节 酶的免疫化学测定方法酶的免疫化学测定方法 放射免疫测定（放射免疫测定（RIARIA）、免疫抑制法、化学发光免）、免疫抑制法、化学发光免疫测定（疫测定（CLIACLIA）、酶免疫测定（）、酶免疫测定（EIAEIA）、荧光酶免疫测）、荧光酶免疫测定（定（FEIAFEIA）。）。 免疫化学法的结果报告方式免疫化

34、学法的结果报告方式 （1 1）用酶活性浓度单位，结果以）用酶活性浓度单位，结果以U/LU/L表示。表示。 （2 2）用质量浓度单位，结果直接用）用质量浓度单位，结果直接用ng/mlng/ml或或 g/Lg/L表示。表示。 血清酶活性与酶质量的变化的关系血清酶活性与酶质量的变化的关系 注意两者之间的差异，如注意两者之间的差异，如CK-MBCK-MB活性与质量不平行。活性与质量不平行。 第五节第五节 酶的免疫化学测定酶的免疫化学测定 返回章返回章 第六节第六节 同工酶及亚型的测定同工酶及亚型的测定 返回章返回章 概念：概念： 同工酶同工酶是催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、是催化相同的化学反

35、应，而酶蛋白的分子结构、 理化性质不同的一组酶。理化性质不同的一组酶。 亚型亚型指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异形成的指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异形成的 多种形式的一类酶。往往在基因编码产物从细胞内释入多种形式的一类酶。往往在基因编码产物从细胞内释入 血浆时因肽酶作用降解而形成。血浆时因肽酶作用降解而形成。分类：分类： 简单分类简单分类原级同工酶和次级同工酶。原级同工酶和次级同工酶。 基因分类基因分类单基因决定的同工酶、复等位基因同工单基因决定的同工酶、复等位基因同工 酶、多基因决定的同工酶和修饰的同工酶等四类。酶、多基因决定的同工酶和修饰的同工酶等四类。 一、同工酶的概念及分

36、类一、同工酶的概念及分类 返回节返回节 第七节第七节 工具酶及其临床应用工具酶及其临床应用 返回章返回章 概念概念 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。的酶称为工具酶。工具酶参与的指示反应工具酶参与的指示反应 偶联偶联H H2 2O O2 2工具酶及指示反应：工具酶及指示反应：如常用的如常用的TrinderTrinder反应即被测物质通过酶作用产生过氧化反应即被测物质通过酶作用产生过氧化氢，在氢，在4-4-氨基比林，过氧化氢酶存在下，生氨基比林，过氧化氢酶存在下，生成红色醌亚胺化合物成红色醌亚胺化合物 NAD(P)+NAD(P)+或或NAD(P)

37、HNAD(P)H偶联的脱氢酶及其指偶联的脱氢酶及其指示反应：示反应：利用氧化利用氧化- -还原酶反应使其连接到还原酶反应使其连接到NAD(P)-NAD(P)HNAD(P)-NAD(P)H的正的正/ /逆反应后，直接测定逆反应后，直接测定NAD(P)HNAD(P)H的变化量。的变化量。一、工具酶一、工具酶 返回节返回节 二、代谢物的酶法测定二、代谢物的酶法测定 终点法终点法概念：概念： 在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐在代谢物酶促反应中，随着时间的延续，待测物浓度逐渐减少而产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反减少而产物逐渐增多，一定时间后待测物全部转化为产物，反应趋

38、于平衡，测定反应完全后待测物或产物变化的总量，即终应趋于平衡，测定反应完全后待测物或产物变化的总量，即终点法（又称平衡法）。点法（又称平衡法）。测定的基本条件：测定的基本条件： 待测物浓度待测物浓度SS应远小于其米氏常数应远小于其米氏常数KmKm，此时任何时刻的，此时任何时刻的反应速度反应速度 v=VS / Km v=VS / Km，呈一级反应。，呈一级反应。 反应配方中所用酶量（反应配方中所用酶量（V V）应足够大，而）应足够大，而KmKm应小，以保证应小，以保证有较快的反应速度完成测定。有较快的反应速度完成测定。 返回节返回节 与终点法相比，动态法与终点法相比，动态法测定中待测物无需完全转

39、化，故工具酶测定中待测物无需完全转化，故工具酶的用量较少，为了保证有足够的测定线性，所用酶的的用量较少，为了保证有足够的测定线性，所用酶的KmKm应足够应足够大。大。两者对于测定仪器的要求不同两者对于测定仪器的要求不同。终点法测定对于仪器的电噪声。终点法测定对于仪器的电噪声和温控要求不严，而动态法要求仪器的电噪声小，吸光度应读和温控要求不严，而动态法要求仪器的电噪声小，吸光度应读准到准到0.00010.0001，温度变化，温度变化0.120ULN)(20ULN)的疾病：病毒性肝炎、中毒性肝炎。的疾病：病毒性肝炎、中毒性肝炎。 返回节返回节 u注意事项 手工法手工法 l 丙酮酸标准液的配制,其不

40、稳定见空气易发生聚合反应,不会出现显色反应,应干燥器中过夜后再使用,基质液称量准确,每批试剂的空白吸光度不应超过0.015A,在室温可保存2天,在4C冰箱可保存1周,一般血清中内源性酮酸含量很少,成批标本只需作一个空白,严重脂血黄疸溶血糖尿病酮症酸中毒病人血中因含大量酮体引起吸光度增加应作空白,赖氏法线性小于150卡门单位,ALT增高应稀释,加入试剂要准速度一致.u注意事项注意事项连续监测法连续监测法 l空白测定值应小于5U/L,血清不宜反复冰冻保存,血液混浊可影响测定结果或无法测定,应避免溶血。ALT存在两个副反应， 血清中存在 a-酮酸能消耗NADH 血清中谷氨酸脱氢酶增高，在有氨存在条件

41、下能消耗NADH，在使用双试剂法应温育期长，能有效消除干扰。 二、二、 - -谷氨酰转移酶及其同工酶谷氨酰转移酶及其同工酶 生化特性生化特性 -GT-GT或或GGT GGT 是一种含巯基的线粒体酶。是一种含巯基的线粒体酶。组织分布组织分布 分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织分布于肾、胰、肺、肝、肠和前列腺等多种组织中，其中以肾脏含量最多。中，其中以肾脏含量最多。 GGT GGT在细胞中有膜结合型（疏水型）和可溶型（亲在细胞中有膜结合型（疏水型）和可溶型（亲水型）两种。水型）两种。 血清中血清中GGTGGT主要来源于肝胆系统。主要来源于肝胆系统。 返回节返回节 GGTGGT的测定方法的测

42、定方法 以往国内多以以往国内多以L-L- - -谷氨酰谷氨酰- - - -萘胺或萘胺或L-L- - -谷氨酰谷氨酰- -对硝基苯胺等人工合成底物进行比色法测定（即重氮对硝基苯胺等人工合成底物进行比色法测定（即重氮试剂法）。由于底物水溶性差，缓冲液和试剂法）。由于底物水溶性差，缓冲液和 pH pH 对结果对结果影响较大，现已较少应用。目前国内外多采用连续监影响较大，现已较少应用。目前国内外多采用连续监测法测定血清测法测定血清 -GT-GT活性。活性。 返回节返回节 IFCCIFCC国际临床化学学会国际临床化学学会 参考方法参考方法 采用采用L-L- - -谷氨酰谷氨酰-3-3-羧基羧基- -对硝

43、基苯胺对硝基苯胺(GCNA)(GCNA)作为底物，作为底物，以甘氨酰甘氨酸（双甘肽）作为以甘氨酰甘氨酸（双甘肽）作为 - -谷氨酰基的受体。在谷氨酰基的受体。在pH7.7pH7.7的条件下，的条件下， -GT-GT催化底物生成催化底物生成 - -谷氨酰双甘肽和黄谷氨酰双甘肽和黄色的色的2-2-硝基硝基-5-5-氨基苯甲酸，在氨基苯甲酸，在410nm410nm波长处直接连续监测，波长处直接连续监测，吸光度的增高速率与吸光度的增高速率与 -GT-GT活性成正比关系。活性成正比关系。甘氨酰甘氨酸谷氨酰氨基苯甲酸硝基双甘肽 LGCNAGGT52 返回节返回节 GGTGGT测定的临床意义测定的临床意义(

44、1)(1)胆道疾病胆道疾病 胆石症、胆道炎症、肝外梗阻等升高明显。胆石症、胆道炎症、肝外梗阻等升高明显。(2)(2)肝实质疾病肝实质疾病 肝炎、脂肪肝、肝硬化时中度升高。肝炎、脂肪肝、肝硬化时中度升高。 慢性肝炎活动期慢性肝炎活动期GGTGGT多增高，非活动期则多正常。多增高，非活动期则多正常。 原发性或转移性肝癌时不同程度的增高。原发性或转移性肝癌时不同程度的增高。(3)(3)诱导作用诱导作用 对乙醇性中毒的判断有一定的价值。对乙醇性中毒的判断有一定的价值。 长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者升高。长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者升高。(4) (4) 同工酶同工酶 用醋酸纤维薄

45、膜电泳可将用醋酸纤维薄膜电泳可将GGTGGT同工酶分为同工酶分为GGTGGT1 1、GGTGGT2 2、GGTGGT3 3和和 GGT GGT4 4四种，正常人只有四种，正常人只有GGTGGT2 2和和GGTGGT3 3。 重症肝胆疾病和肝癌时有重症肝胆疾病和肝癌时有GGTGGT1 1出现；乙醇性肝坏死、胆总管结出现；乙醇性肝坏死、胆总管结 石及胰腺炎时石及胰腺炎时GGTGGT2 2增加；增加；GGTGGT4 4与胆红素增高相关。与胆红素增高相关。 返回节返回节 三、肌酸激酶及其同工酶三、肌酸激酶及其同工酶 生化特性生化特性 肌酸激酶为巯基酶，易受金属离子肌酸激酶为巯基酶，易受金属离子CaCa

46、2 2、CuCu2 2、ZnZn2 2、MnMn2 2等的抑制，等的抑制，MgMg2 2是是CKCK的必需激活剂。由两种不同亚基（的必需激活剂。由两种不同亚基（M M和和B B亚基）组成的二聚体。亚基）组成的二聚体。 按电泳速率的快慢分为：按电泳速率的快慢分为：CK-BBCK-BB（CKCK1 1）、）、CK-MBCK-MB（CKCK2 2）、）、CK-MMCK-MM（CKCK3 3）和）和CKCKMt(CKMt(CK4 4) )四种同工酶。四种同工酶。组织分布组织分布 广泛分布于全身，骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑组广泛分布于全身，骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑组织。织。 CK-BB CK-

47、BB在脑和脊髓内含量最高称为脑型同工酶。分为氧化在脑和脊髓内含量最高称为脑型同工酶。分为氧化型、中间型和还原型型、中间型和还原型3 3种亚型。种亚型。 CK-MB CK-MB主要存在于心肌细胞内称为心型同工酶。分为主要存在于心肌细胞内称为心型同工酶。分为CK-MB1CK-MB2CK-MB1CK-MB2亚型。亚型。 骨骼肌中几乎全部为骨骼肌中几乎全部为CK-MMCK-MM，称为肌型同工酶。分为，称为肌型同工酶。分为CK-MM1CK-MM2CK-MM3CK-MM1CK-MM2CK-MM3亚型。亚型。 返回节返回节 CKCK的测定方法的测定方法 有比色法、紫外分光光度法和荧光法等。由于以磷酸有比色法

48、、紫外分光光度法和荧光法等。由于以磷酸肌酸为底物的逆向反应速度快，约为正向反应速度的肌酸为底物的逆向反应速度快，约为正向反应速度的6 6倍，倍，所以采用逆向反应进行测定较为普及。如肌酸显色法和酶偶所以采用逆向反应进行测定较为普及。如肌酸显色法和酶偶联法，其中以后者最常用，有两种工具酶及指示酶参与反应。联法，其中以后者最常用，有两种工具酶及指示酶参与反应。 IFCCIFCC测定测定CKCK的参考方法为酶偶联法。的参考方法为酶偶联法。HKHK己糖激酶己糖激酶 G6PD6 G6PD6磷酸葡磷酸葡萄糖脱氢酶萄糖脱氢酶 HNADPHPDGNADPADPHKATPATPCKADP磷酸葡萄糖内酯葡萄糖磷酸葡

49、萄糖磷酸葡萄糖肌酸磷酸肌酸6666 返回节返回节 CKCK同工酶和亚型的测定方法同工酶和亚型的测定方法 临床常规测定临床常规测定CKCK同工酶多用电泳和免疫抑制法，但二同工酶多用电泳和免疫抑制法，但二法均会受溶血和巨法均会受溶血和巨CKCK的干扰，免疫抑制法还会受到的干扰，免疫抑制法还会受到CK-BBCK-BB的的干扰。干扰。 现推荐用免疫化学方法直接测定现推荐用免疫化学方法直接测定CK-MBmassCK-MBmass，可不受溶，可不受溶血和巨血和巨CKCK的干扰。的干扰。 CK CK同工酶亚型（同工酶亚型（CK-MMCK-MM亚型和亚型和CK-MBCK-MB亚型）多用琼脂糖亚型）多用琼脂糖凝

50、胶高压电泳和等电聚焦电泳等。凝胶高压电泳和等电聚焦电泳等。 返回节返回节 正常和病理状况时琼脂糖凝胶电泳分析正常和病理状况时琼脂糖凝胶电泳分析血清血清CKCK同工酶可能出现的酶带同工酶可能出现的酶带 返回节返回节 CKCK及其同工酶测定的临床意义及其同工酶测定的临床意义诊断诊断AMIAMI依据依据 表现胸疼，心电图表现胸疼，心电图Q Q波出现，血清酶变化。波出现，血清酶变化。主要用于早期诊断主要用于早期诊断AMI AMI （1 1） 血清血清CKCK总活力总活力 AMI AMI后后2 24h4h开始升高，开始升高，101024h24h达峰值，达峰值，3 34 4天恢复正天恢复正常。常。（2 2

51、）CKCK同工酶及亚型同工酶及亚型 AMI AMI胸痛发作后，血清胸痛发作后，血清CK-MBCK-MB的上升先于其的上升先于其CKCK总活性，总活性，CK- MB/CKCK- MB/CK0.030.03可诊断为可诊断为AMIAMI。 CK-MM CK-MM亚型的测定：以亚型的测定：以CK-MMCK-MM3 3/CK-MM/CK-MM1 11.01.0作为诊断作为诊断AMIAMI的的标准。标准。 CK-MB CK-MB2 2亚型：在亚型：在AMIAMI早期诊断和判断有无再灌注上同样有很早期诊断和判断有无再灌注上同样有很高的灵敏度和特异性。一般以高的灵敏度和特异性。一般以CK-MBCK-MB2 2

52、1.9U/L1.9U/L或或CK-MBCK-MB2 2/CK-MB/CK-MB1 11.51.5作为作为AMIAMI的诊断标准。的诊断标准。 返回节返回节 四、乳酸脱氢酶及其同工酶四、乳酸脱氢酶及其同工酶 生化特性生化特性 乳酸脱氢酶是糖酵解途径中的一种重要酶。乳酸脱氢酶是糖酵解途径中的一种重要酶。LDLD除催除催化化L-L-乳酸外还可催化乳酸外还可催化-羟丁酸、羟丁酸、-酮丁酸进行脱氢反酮丁酸进行脱氢反应。应。组织分布组织分布 LDLD位于细胞质中，是一种含锌的糖酵解酶。位于细胞质中，是一种含锌的糖酵解酶。LDLD是是由由H H（心型）和（心型）和M M型（肌型）两种不同亚基组成的四聚体。型

53、（肌型）两种不同亚基组成的四聚体。5 5种同工酶。种同工酶。 若用若用 - -羟基丁酸作为底物，可测定羟基丁酸作为底物，可测定H H亚基的活性亚基的活性。 返回节返回节 LDLD的测定方法的测定方法目前多用连续监测法。目前多用连续监测法。LD-PLD-P法：以丙酮酸为底物（反应方向法：以丙酮酸为底物（反应方向P PL L）的逆向反应）的逆向反应（称（称LD-PLD-P法）。法）。LD-LLD-L法：以乳酸为底物（反应方向法：以乳酸为底物（反应方向L LP P）的顺向反应（称）的顺向反应（称LD-LLD-L法）。为法）。为IFCCIFCC参考方法（参考方法（pHpH为为9.49.4）。通过在）。

54、通过在340nm340nm波波长处监测长处监测NADNAD+ + 还原成还原成NADHNADH吸光度的增加速率而计算吸光度的增加速率而计算LDLD活性。活性。 HNADHNADLLD丙酮酸乳酸)( 返回节返回节 LDLD同工酶的测定方法同工酶的测定方法 常用电泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。目前以琼脂糖凝胶常用电泳法、免疫沉淀法和免疫抑制法等。目前以琼脂糖凝胶电泳法更多用。一般成年人存在如下规律：电泳法更多用。一般成年人存在如下规律：LDLD2 2LDLD1 1LDLD3 3LDLD4 4LDLD5 5，部分正常儿童血中可见，部分正常儿童血中可见LDLD1 1LDLD2 2。 返回节返回节 L

55、DLD及其同工酶测定的临床意义及其同工酶测定的临床意义心肌梗死心肌梗死 LD LD心肌酶中升高最晚，持续时间长。心肌酶中升高最晚，持续时间长。急性肝炎、慢性活动性肝炎和肝癌急性肝炎、慢性活动性肝炎和肝癌( (尤其转移性肝癌尤其转移性肝癌) )时，时，LDLD明显明显升高。升高。LDLD同工酶主要用于同工酶主要用于AMIAMI和肝病的诊断和肝病的诊断 AMI LDAMI LD1 1升高最为显著，升高最为显著，LDLD1 1/LD/LD2 21 1，视为诊断，视为诊断AMIAMI的一个特异指的一个特异指标。标。 肝胆疾病肝胆疾病 LD LD5 5升高常表示有肝细胞坏死。肝细胞性黄疸时升高常表示有肝

56、细胞坏死。肝细胞性黄疸时LDLD5 5LDLD4 4，阻塞性黄疽时，阻塞性黄疽时LDLD4 4LDLD5 5。 肿瘤肿瘤 肝癌肝癌( (尤其转移癌尤其转移癌) )时可伴有时可伴有LDLD4 4和和LDLD5 5明显增高；白血病、明显增高；白血病、胶原病时以胶原病时以LDLD3 3、LDLD4 4增高为主。增高为主。 恶性贫血恶性贫血 LD LD活性极度升高活性极度升高( (原始巨幼红细胞可产生并释放原始巨幼红细胞可产生并释放LD)LD)，伴有伴有LDLD1 1明显升高，明显升高，LDLD1 1LDLD2 2。 返回节返回节 返回节返回节 五、碱性磷酸酶及其同工酶五、碱性磷酸酶及其同工酶 生化特

57、性生化特性 碱性磷酸酶是一组底物特异性较低碱性磷酸酶是一组底物特异性较低, ,在碱性条件下（最适在碱性条件下（最适pHpH为为1010左右）能水解很多磷酸单酯化合物的酶。左右）能水解很多磷酸单酯化合物的酶。组织分布组织分布 ALP ALP广泛分布定位于细胞膜表面，其含量依次为肝、肾、广泛分布定位于细胞膜表面，其含量依次为肝、肾、胎盘、小肠、骨骼等。胎盘、小肠、骨骼等。 血清中的血清中的ALPALP主要来自肝脏和骨骼，是胆汁淤滞的酶学指主要来自肝脏和骨骼，是胆汁淤滞的酶学指标。标。 根据根据ALPALP的来源不同可以的来源不同可以3 3大类，即胎盘大类，即胎盘ALPALP、肠、肠ALPALP和和

58、肝肝/ /骨骨/ /肾肾ALPALP同工酶。在病理时还可能出现肝同工酶。在病理时还可能出现肝ALPALP和胆汁和胆汁ALPALP等等“高分子高分子ALPALP” ，以及一些和肿瘤有关的变异，以及一些和肿瘤有关的变异ALPALP，如，如ReganRegan、Nagao ALPNagao ALP等。等。 返回节返回节 ALPALP的测定方法的测定方法(1)(1)磷酸苯二钠比色法：磷酸苯二钠比色法：测定测定ALPALP水解底物产生的酚。水解底物产生的酚。(2)(2)连续监测法：连续监测法：我国及我国及IFCCIFCC的推荐方法。的推荐方法。 PiAMPPNPAMPPNPPALP 返回节返回节 ALP

59、ALP测定的临床意义测定的临床意义肝胆疾病肝胆疾病 各种肝内、外胆管阻塞引起的胆汁淤积性疾各种肝内、外胆管阻塞引起的胆汁淤积性疾病，病，ALPALP明显升高，且明显升高，且ALPALP升高与胆红素平行升高与胆红素平行甲亢、恶性骨损伤、佝偻病、甲亢、恶性骨损伤、佝偻病、PagetsPagets病、骨折病、骨折、指端肥大、指端肥大症所致骨损伤等，均可引起症所致骨损伤等，均可引起ALPALP活性升高，尤其是骨活性升高，尤其是骨ALPALP同同工酶的增高工酶的增高妊娠后期妊娠后期及儿童生长期及儿童生长期ALPALP增高增高血清血清ALPALP活性降低：活性降低：主要见于呆小病、维生素主要见于呆小病、维

60、生素C C缺乏症、甲缺乏症、甲状腺功能低下、恶性贫血等。状腺功能低下、恶性贫血等。 返回节返回节 u注意事项lALP底物不应含有游离酚，如有酚空白管显红色，说明磷酸苯二钠已经开始分解应弃去。铁氰化钾中加入硼酸有稳定作用，应避光保存，如出现蓝绿色应弃去。加入铁氰化钾后应立即混匀否则显色不完全，黄疸溶血血清应分别作对照，一般血清可以共用对照管六、酸性磷酸酶及其同工酶六、酸性磷酸酶及其同工酶 生化特性生化特性 酸性磷酸酶是一组对底物专一性不强、在酸性条件下水酸性磷酸酶是一组对底物专一性不强、在酸性条件下水解各种正磷酸单酯的酶。解各种正磷酸单酯的酶。组织分布组织分布 ACP ACP主要存在于体内所有细