传染病血清标志检测指标的发展与应用PPT课件

1、感染性疾病血清标志物检测的发展与临床应用 传染病血清标志物传染病血清标志物 1.感染性疾病筛查 2.HBV的检测 3.HCV的检测 4.HIV的检测感染性疾病筛查感染性疾病筛查 HBV、HCV、HIV等是感染性疾病术前筛查的重要指标 2000年卫生部184号文颁发了“临床输血技术规范”的通知，特别强调了手术病人术前的筛查项目国内感染性血清标志物检测特点国内感染性血清标志物检测特点 手工操作为主手工操作为主, ,自动化使用较少自动化使用较少 检测方法较多检测方法较多, ELISA, ELISA方法占绝大部分方法占绝大部分 使用仪器和试剂较混乱使用仪器和试剂较混乱, ,试剂多达试剂多达3030几家

2、几家, ,仪器多达仪器多达5050多种多种 实验室之间检测结果存在较大差异实验室之间检测结果存在较大差异酶联免疫法（酶联免疫法（ELISAELISA）术前病人筛查传统方法术前病人筛查传统方法 微板法固相载体微板法固相载体优势优势简单，易操作成本低缺点缺点包被面积小，反应面积有限颜色反应（灵敏度、特异性）包被均一性不足（精密度）反应时间不一致造成结果偏差（精密度低，熟练的操作人员其批间差也达20%以上） 洗板容易带来污染手工操作，管理不易电化学发光免疫测定（电化学发光免疫测定（ECLECL）输血病人筛查自动化方法输血病人筛查自动化方法结合标记抗体 结合磁性微珠转移至电极施加电压启动反应信号检测方

3、法学对比方法学对比传统（传统（ELISAELISA）优点：优点：降低成本可实现自动化缺点：缺点：HOOK效应引起的假阳性非特异反应交叉污染引起的假阳性灵敏度低,对于窗口期感染的检出率低,容易导致假阴性的出现 现在（现在（ECLECL）优点：异相免疫分析，抗原抗体高效结合，无传统一步法的缺点结果稳定，高精密度可控的反应体系快速的检测时间抛弃型tip头避免交叉污染缺点：成本相对较高传染病血清标志物传染病血清标志物 1.感染性疾病筛查 2.HBV的检测 3.HCV的检测 4.HIV的检测乙型肝炎乙型肝炎: : 世界性的公共卫生问题世界性的公共卫生问题HBsAg Prevalence8% - High

4、 2-7% - Intermediate 2% - Low全球约有全球约有2020亿人曾感染过乙肝亿人曾感染过乙肝其中其中3.53.5亿人为慢性亿人为慢性HBVHBV感染者感染者, ,几乎一半在中国几乎一半在中国/mediacentre/factsheets/fs204/en 性传播性传播 输血传播输血传播 围产期传播围产期传播 医院内传播医院内传播乙型病毒传播模式乙型病毒传播模式感染感染复制复制疾病活动期疾病活动期HBsAg, anti-HBc, anti-HBeHBeAg, HBV DNAALTHBVHBV疾病的发展疾病的发展乙肝血清学标记物检测要点感染后

5、血清转换的早期即可检测出（缩短窗口期)分析灵敏度优异识别所有的亚型可靠地识别病毒变异株高特异性的表现高检测精密度,尤其是cutoff 处精密度表现尤为重要乙肝表面抗原（HBsAg）1963年由年由 Blumberg在澳大利亚土著人血中发现，称为澳大利亚抗原（即以前所谓的在澳大利亚土著人血中发现，称为澳大利亚抗原（即以前所谓的“澳抗澳抗”）；又称为肝炎相关抗原又称为肝炎相关抗原（HAA）；1974年正式定名为乙型肝炎病毒表面抗原。年正式定名为乙型肝炎病毒表面抗原。HBsAg有一个特异的共同抗原决定簇有一个特异的共同抗原决定簇“a”和至少两个亚型决定簇和至少两个亚型决定簇“d/y”和和“w/r”，

6、最常见的血清，最常见的血清型为型为adw、adr和和ayw。最常用的测定方法为最常用的测定方法为ELISA，使用针对，使用针对HBsAg的的a决定簇的单克隆和多克隆抗体，为双抗体夹心决定簇的单克隆和多克隆抗体，为双抗体夹心测定模式。测定模式。血清中检出血清中检出 HBsAg是乙型肝炎的早期诊断指标之一是乙型肝炎的早期诊断指标之一 出现时间：出现时间：HBVHBV感染后感染后2 26 6个月（潜伏期）个月（潜伏期）HBsAg检测易出现“假阴性”结果HBsAgHBsAg含量低于所用方法的测定下限之下含量低于所用方法的测定下限之下 如感染的“窗口期”、急性期后或恢复期、自限性感染末期的携带者等。编码

7、编码HBsAgHBsAg的的HBVHBV S S基因的突变。基因的突变。 HBV容易发生突变，较其他DNA病毒的突变率要高10倍；S基因发生突变可导致HBsAg的 a决定簇发生改变，最相关的突变是G145R、K141E和T131I以及在122与123位残基之间3个氨基酸的插入，可明显影响HBsAg的抗原结构。丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCVHCV）与丁型肝炎病毒（）与丁型肝炎病毒（HDVHDV）重叠感染对）重叠感染对HBVHBV复制和复制和/ /或或HBsAgHBsAg表达的抑制作用表达的抑制作用测定方法所用抗体对测定方法所用抗体对 HBVHBV不同基因型检测敏感性的不同。不同基因型检测敏感

8、性的不同。HBsAg HBsAg 检测的挑战之一：检测的挑战之一： 对于低水平对于低水平HBsAgHBsAg的检测的检测HBsAg HBsAg 是是 乙肝感染最早出现的血清学标记物乙肝感染最早出现的血清学标记物灵敏度 是评价表面抗原的最重要的指标2006年临床化学杂志 美国华盛顿大学1. 以前在HBV DNA检测方法不是很灵敏度的时候认为HBsAg 阳性而DNA阴性代表病毒的静默期，没有复制；2. 随着更灵敏的DNA检测方法的使用，人们也发现HBsAg阴性而DNA阳性的状况；第一个原因是处于窗口期由于HBsAg的灵敏度决定的中国低水平中国低水平HBsAgHBsAg的状态的状态 浙江大学第一附属

9、医院在2002年做的评估如下： 8089例病人中2.34%5ng/ml 816表面抗原阳性的人群中23.16% 5ng/ml 其中84例1ng/ml(44.4%) 33例 1ng/ml(17.5%) 72例 2ng/ml(38.10%)根据HBsAg II在华西医院的评估结果估计：每100例HBsAg II阳性的标本中，华西的检测方法会漏检5例。国内外国内外HBsAgHBsAg诊诊断试剂灵敏度评估断试剂灵敏度评估国家参考品国家参考品adradr血清的检测结果血清的检测结果HBsAgHBsAg 检测的挑战之二：检测的挑战之二： 缩短窗口期缩短窗口期 与与 ELISA ELISA 试剂窗口期相差平

10、均试剂窗口期相差平均2020天天 HBsAg 检测的挑战之三检测的挑战之三; ; 对于突变病毒株对于突变病毒株HBsAgHBsAg的检测的检测最常见的最常见的HBsAgHBsAg突突变位点变位点S S基因的突变率基因的突变率 1988年意大利研究 2.0%的接种疫苗的人会感染HBV，确认是感染突变病毒株 这些患者的血清学表现为表面抗原和表面抗体同时阳性 其中最重要的突变是G145R，这个突变可以保持非常高的复制性 其中发现的免疫接种的婴儿被感染多是由于这个突变造成的家庭间的水平传播突变的重要原因突变的重要原因突变原因：自发突变（HBV聚合酶链反应的高出错率）选择性压力下的突变,疫苗接种/高效价

11、免疫球蛋白的应用 -疫苗的广泛应用，促使HBV 发生变异的免疫压力逐渐增大，变异的机会增加治疗抑制（拉米夫定） 对于突变株无法识别也是漏检的原因之一对于突变株无法识别也是漏检的原因之一HBsAg HBsAg 检测的挑战之四检测的挑战之四: : 不同亚型和基因型的检测不同亚型和基因型的检测HBVHBV有多个基因型和血清亚型有多个基因型和血清亚型 依据HBV全基因核苷酸序列异源性/ 8%或者s基因区核苷酸序列异源性/4%为分型标准，HBV可以分为AH的八个基因型。 依据HBV的d/y(122-134); a(139-147);w/r(159-160)等决定簇的变化，将HBV分为四个主要的血清亚型不

12、同的亚型可以同属于一个基因型不同的亚型可以同属于一个基因型同一个亚型又可以分属不同基因型同一个亚型又可以分属不同基因型可靠地检测可靠地检测HBsAgHBsAg不同基因型不同基因型Elecsys HBsAg II 如何实现能够检测变异株能力如何实现能够检测变异株能力?使用了两种单克隆捕捉抗体和一种多克隆信号抗体罗氏新一代的表面抗原在此评估中没有发现突变罗氏新一代的表面抗原在此评估中没有发现突变漏检漏检ElecsysElecsys HBsAg II HBsAg II性能小结性能小结-用于筛查用于筛查 临床灵敏度高 分析灵敏度高 检测范围检测范围52000 IU/ml52000 IU/ml手工步骤手

13、工步骤结果显示结果显示 ( ( IU/ml IU/ml) ) ( (70%70%-80% -80% 标本在此范标本在此范围围) )e411/2010(e411/2010(1:1001:100) ) e601/e170(e601/e170(1:4001:400) ) 在线稀释在线稀释e411/2010(1:100) e601/e170(1:400) 在线稀释在线稀释 HBsAg II HBsAg II QuantQuant25的标的标本本10U/l; 10U/l; - -多国的共识多国的共识 100 U/l 100 U/l 才具备保护能力才具备保护能力 - -表面抗体定量检测具备溯源性表面抗体定

14、量检测具备溯源性 Anti-HBs Anti-HBs 定量检测定量检测监控意义监控意义Anti-HBs( IU/Anti-HBs( IU/L L ) )接种建议接种建议提示提示HBVHBV感染恢复感染恢复提示成功的疫苗接种提示成功的疫苗接种提示再次疫苗接种的时提示再次疫苗接种的时间间101000010000可以保护可以保护7 7年年乙肝e抗原（HBeAg）qHBeAg与病毒Dane颗粒、HBV-DNA具伴随关系，是HBV复制活跃的血清学指标。 qHBeAg为HBsAg的可溶性成分，通常血清 HBeAg阳性者，其HBsAg亦为阳性。q血清HBeAg阳性说明传染性强。q急性乙肝患者血清HBeAg持

15、续阳性 3个月以上，则有疾病慢性化倾向qHBV抗病毒治疗的重要监测指标。 临床应用临床应用急性乙型肝炎早期指标乙型肝炎病毒感染的病人随访高度传染性的标志治疗监控Elecsys HBeAg 分析灵敏度分析灵敏度 用参考材料82做方法比较 (100 PEI U/mL)Elecsys HBeAg Elecsys HBeAg 灵敏度极佳灵敏度极佳00.81.01.21.40123456HBeAg concentration PEI U/mLHBeAg concentration PEI U/mLs/co ratios/co ratioElecsys HBeAgElecsys HBeA

16、gAssay AAssay Acut-offcut-offElecsysElecsys HBeAg HBeAg 定值溯源性至定值溯源性至 PEI PEI 标准品标准品 82 82 PEI PEI 是是 Paul-Ehrlich-Institute Paul-Ehrlich-Institute 的简称，它是德国的一个机构，隶属于德国卫生部。的简称，它是德国的一个机构，隶属于德国卫生部。该机构成立已经该机构成立已经100100多年，主要的研究方向是疫苗、抗体、基因治疗、变态反应原研究多年，主要的研究方向是疫苗、抗体、基因治疗、变态反应原研究等。它有很多职能，包括德国以及欧盟的医学产品法规的制定；等

17、。它有很多职能，包括德国以及欧盟的医学产品法规的制定； PEI PEI 是的合作组织，只要职能是体外血液产品的质量确认。是的合作组织，只要职能是体外血液产品的质量确认。 PEI PEI 还提供以下标志物的参考品和国际标准品：还提供以下标志物的参考品和国际标准品：HIV 1/2, HIV 1/2, HBVHBV, HCV, HAV, Rubella virus and HCMV, HCV, HAV, Rubella virus and HCMV由于由于HBeAgHBeAg没有没有 WHOWHO标准品，所以目前标准品，所以目前PEI PEI 标准品是最高级的国际标准品。标准品是最高级的国际标准品。

18、稀释灵敏度稀释灵敏度 Elecsys HBeAg的的 COI结果具有半定量的分析能力结果具有半定量的分析能力0.11101001000100001000000.11101001,00010,000log HBeAg PEI U/mLlog HBeAg PEI U/mLlog COIlog COIrecombinant HBeAg (5g/mL)2300 PEIU/mL目前在国外最高的自然标本为1450 PEIU/mlHBeAg的值对于慢性乙肝抗病毒治疗的应用价值的值对于慢性乙肝抗病毒治疗的应用价值 HBeAg 的血清学转换是被认为是慢性乙肝治疗的最重要的短期目标。在治疗中和治疗前HBeAg的浓

19、度对于抗病毒治疗的预示价值要超过HBV DNA。 Anti-HBe Anti-HBe乙肝乙肝e e抗体（抗抗体（抗HBeHBe）q当血清 HBeAg转阴后，可出现抗HBe，两者同时阳性较少见。q抗HBe阳性说明病毒复制减少，传染性弱，但并非没有传染性。q抗HBe不是保护性抗体。qHBeAg抗HBe血清转换被看作是HBV感染过程的一个转折点。2.001.000.000.001.002.003.004.005.00Analytical sensitivityAnalytical sensitivity Dilution of PEI reference material (100 U/mL) Di

20、lution of PEI reference material (100 U/mL)检出灵敏度：检出灵敏度： 0.2 PEI U /L0.2 PEI U /L2.001.000.005.00130.0780.0390.6250.156COICOIAnti-HBe concentration PEI U/mLAnti-HBe concentration PEI U/mLCOICOISpecificity in blood donors (n=?)Specificity in blood donors (n=?)Cut-off indexCut-off indexNumber

21、 of samplesNumber of samplesCut-offCut-offElecsys Anti-HBe 优异的临床特异性优异的临床特异性Specificity = 100%Specificity = 100%HBeAg /Anti-HBe Concurrencev 理论基础： 处于转归期出现免疫复合物v HBe Ag 和Anti-HBe同时出现的几率：出现的几率依赖于相应检查方法的灵敏度。对于免疫复合物的检测能力临床价值：临床价值： 在多余在多余HBeAg存在的条件下即能早期发现存在的条件下即能早期发现Anti-Hbe的血清转换，的血清转换， 对于指导医生的治疗有更灵敏的应用价值

22、。对于指导医生的治疗有更灵敏的应用价值。Journal of Medical Virology ; 60;256-63(2000)乙肝核心抗体（抗乙肝核心抗体（抗HBcHBc）q在HBV感染中，最早出现的特异抗体是抗HBc。q总抗HBc包括抗HBc-IgM、IgA、IgG和IgE等。q抗HBc不是保护性抗体。抗HBc在血中呈低滴度且与抗HBs同时存在，是既往感染的标志。q在HBV高流行人群中，抗HBc常作为疫苗免疫前的筛检方法。在欧洲和美国，抗HBc还是血液筛查的一个指标。q抗HBc测定中存在的最大问题是其假阳性和单项抗HBc阳性结果的解释问题。Anti-HBc优越的阴阳性标本的区分能力优越的

23、阴阳性标本的区分能力抗HBc “假阳性”结果的原因及解决办法国内评估结果国内评估结果- HBV五项结果最大的差异见于 Anti-HBc, ELISA 假阴性率很高。主要原因是血清（浆）中存在交叉反应性抗体或干扰性物质。 标本不得不稀释检测，造成灵敏度降低 如果不稀释检测，会有明显的干扰，造成假阳性q罗氏罗氏Elecsys预处理血清标本预处理血清标本将明显改善抗HBc检测的特异性；具有标本预处理的抗HBc试验的特异性在 99.8%至 99.9%之间。传染病血清标志物传染病血清标志物 1.感染性疾病筛查 2.HBV的检测 3.HCV的检测 4.HIV的检测丙型肝炎是全球面临的公共卫生问题中国CDC

24、报告的丙肝病例逐年大幅增高卫生部历年公布全国丙肝疫情卫生部历年公布全国丙肝疫情中国报告的丙肝病例在最近中国报告的丙肝病例在最近6 6年内几乎翻了年内几乎翻了6 6倍倍211453938052927706811003391180160200002000040000400006000060000800008000010000010000012000012000020032003年年20042004年年20052005年年20062006年年20072007年年20082008年年丙肝人类健康的沉默杀手丙肝起病隐匿，是容易被忽视的疾病丙肝起病隐匿，是容易被忽视的疾病一旦感染丙肝，仅20-30%感染者

25、自发清除病毒慢性丙型肝炎患者有70-80%无明显症状隐匿的丙肝患者会成为危险的传染源没有“病毒携带者”，有“毒”就要考虑治疗疾病发展越后期，越难治愈疾病发展越后期，越难治愈逐渐发展成肝硬化、肝癌等终末期肝病带来越来越沉重的疾病负担目前没有疫苗预防目前没有疫苗预防丙肝发生肝硬化和肝癌的风险有多大？HCVHCV感染后感染后肝硬化发生率：肝硬化发生率：2020年达年达10%10%；在在感染后感染后3030年内达年内达20%20%。 1%4%的的HCV感染者会发展为肝癌感染者会发展为肝癌肝肝硬硬化化肝肝癌癌急性丙肝感染的血清标志物图谱急性丙肝感染的血清标志物图谱慢性丙型肝炎感染的血清学图谱慢性丙型肝炎

26、感染的血清学图谱实验室检测的现状 Anti-HCV 检测q酶联免疫吸附实验-大批量处理q化学发光自动化快速q快速检测技术试纸条q补充确认实验重组免疫印记实验(RIBA) Anti-HCV IgG/IgM检测 HCV RNA检测 HCV血清学分析HCV筛查面临的问题 假阳性率问题 漏检 不同ELISA试剂结果的不一致HCV基因结构及其功能CE1E2/NS1NS2NS3NS4a NS4b NS5aNS5b核酸序列5-nc3-nc342914 149026053360531262569371核心蛋白包膜蛋白糖蛋白功能不清三磷酸核苷酸结合的螺旋酶RNA聚合酶功能ELISA法检测抗-HCV1990199

27、0年美国公司用年美国公司用NS4NS4蛋白的蛋白的c c100-3100-3表位作为抗原表位作为抗原，生产了第一代生产了第一代ELISAELISA法法抗抗HCV HCV 试剂盒。试剂盒。19921992年推出第二代年推出第二代ELISAELISA法抗法抗HCV HCV 检测试剂。其包被抗原增加了非结构蛋白检测试剂。其包被抗原增加了非结构蛋白c33cc33c和结构蛋白和结构蛋白c22-3c22-3作为抗原，灵敏度大大提高，窗口期从从作为抗原，灵敏度大大提高，窗口期从从16W16W缩短到缩短到10W10W。19951995年推出了第三代年推出了第三代ELISAELISA法抗法抗HCV HCV 检测

28、试剂，包被抗原为含检测试剂，包被抗原为含c22-3c22-3、c33cc33c、c100-3c100-3和和5-1-15-1-1的重组蛋白，灵敏度和特异性得到进一步改善，平均窗口的重组蛋白，灵敏度和特异性得到进一步改善，平均窗口期缩短至期缩短至7-8W7-8W。 Elecsys Anti-HCV CE1E2NS2NS3NS4NS553结构部分结构部分非结构部分非结构部分Core-Peptide rec. NS3-Protein NS4-Peptide aa 9-48 aa 1192-1457 aa 1689 - 1743E 1E 2CoreRNA Elecsys Elecsys Anti-HC

29、V Anti-HCV 试剂中试剂中 应用的抗原应用的抗原Elecsys Anti-HCV可以检测各种基因型 Elecsys Anti-HCV Elecsys Anti-HCV 能够检测能够检测 HCV genotypes 1-6 HCV genotypes 1-6 种不同基因型种不同基因型Elecsys Anti-HCV检测优势优异的血清转化灵敏度优异的血清转化灵敏度 高灵敏度可用于HCV感染的早期检测，对于那些新感染患者的早期发现有助于他们的成功治疗。高的临床特异性高的临床特异性 99.71%的血清盘检出率，不会因高剂量钩状效应造成任何的假阴性检测，检测同样不受自身抗体的干扰。灵敏的识别病毒

30、变异株灵敏的识别病毒变异株 病毒出现新的变异时，也能准确地检测出来，100%灵敏识别HCV主要1-6种基因型。快速的反应时间快速的反应时间 18分钟传染病血清标志物传染病血清标志物 1.感染性疾病筛查 2.HBV的检测 3.HCV的检测 4.HIV的检测AIDS获得性免疫缺陷综合症（Acquired Immune Deficiency Syndrome），艾滋病。1981年6月5日首先在美国于一同性恋者中发现。1983年由法国科学家分离出病原体-人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）；同年在非洲发现异性间传播并发现HIV-2。1985年第一个诊断试

31、剂盒出现。中国艾滋病流行现状中国艾滋病流行现状 截至2009年10月31日，累计报告艾滋病患者和感染者近32万例，其中艾滋病病人10万余例。 到2009年年底，存活的艾滋病感染者和病人总数估计达74万人。 31个省(自治区、直辖市)全部已发现HIV感染者。三种传播途径均已存在。数字反映出来的数字反映出来的 不过是冰山一角不过是冰山一角 中国艾滋病：危险的泰坦尼克号中国艾滋病：危险的泰坦尼克号 HIV感染的实验室检测 HIV感染包括病原学检测和免疫学检测 。病原学检测包括病毒分离培养、病毒抗原检测、病毒核酸检测等。免疫学检测主要检测人体产生的特异性HIV抗体，是目前HIV/AIDS诊断中最常用的

32、方法: HIV抗体检测 确认是否感染的依据。HIV检测试剂发展的历程1985 HIV抗体ELISA试剂、全病毒裂解抗原（第一代）1990 HIV抗体ELISA试剂、基因工程或合成肽抗原（第二代）1992 HIV1/HIV2抗体ELISA联检试剂1994 HIV抗体双抗原夹心法ELISA试剂（第三代）1994 HIV抗体唾液检测试剂1996 家用HIV-1检测系统1996 HIV-1P24抗原检测试剂1996 HIV1抗体尿液检测试剂1997 HIV1/2/O抗体ELISA试剂1998 HIV-1/2抗原抗体联检试剂（第四代）1998 HIV抗体确认WB试剂1999 HIV-1RNA定量检测试剂2002 HIV1基因型耐药性检测试剂2003 HIV抗体快速检测试剂第一代：1985年，主要使用来自T淋巴细胞系中培养的HIV病毒的裂解产物，这类抗原通常会同时有宿主细胞成分的污染，从而造成假阳性。为减少非特异性，通常不得不降低包被的抗原浓度，另外，杂蛋白的存在会与抗原竞争包被位点，因此第一代试剂的灵敏度也受到了一定的限制。 第二代：主要使用基因工程重组和/或人工合成肽做为抗原，采用间接法的原理检测HIV IgG抗体，与第一代相比明显地提