2006肿瘤细胞基质金属蛋白酶活性的动态光学成像

1、华技大学博士摘要基质金属蛋白酶(Matrix Moproteinases，MMPs)是一种可降解细胞外基质的蛋白水解酶，在的生长、侵袭、转移和生成过程中起着重要的作用。基质金属蛋白酶抑制剂作为新型抗肿瘤，在肿瘤治疗方面具有良好的开发与应用潜力。建立实时在体检测 MMPs 活性的方法，对于高通量在体筛选 MMPs 抑制剂具有重要的作用。应用工程技术用于在体检测水解酶活性的荧光共振能量转移（FRET）探针，通过 FRET 成像能动态监测在体外和不同细胞表达水解酶的活性。本研究中应用工程技术了两对可用于在活细胞或活动物体内检测 MMPs活性的荧光共振能量转移（FRET）探针，此 FRET 探针设计原

2、理为：将能发生 FRET的荧光蛋白对 CFP/YFP 或 CFP/DsRed 用 MMPs 识别的肽相连，构建成 YFP-MMPs底物识别序列-CFP 或 DsRed- MMPs 底物识别序列-CFP 的融合蛋白。在体外利用纯化的荧光探而且此探MMP 酶的活性及抑制剂的作用进行了实时动态的光谱学分析，MMP2 具有较高的酶切特异性。将这两个探针用展示技术锚定在细胞膜的外表面，用于检测到细胞外的 MMPs 活性。当细胞外液无 MMPs 时, 此FRET 探针保持其完整性时，CFP 与 YFP 或 CFP 与 DsRed 之间能够发生荧光共振能量转移；当肿瘤细胞高表达 MMPs，到细胞外液中的 M

3、MPs 活性较高时，FRET 探针被 MMPs 裂解，使得荧光受体蛋白 YFP 或 DsRed 游离到细胞外液中， 而荧光供体蛋白 CFP 仍保留在肿瘤细胞上。因此，无论是通过 FRET 荧光成像还是单独检测 YFP 或 DsRed 荧光信号，均能灵敏地反映肿瘤细胞的 MMPs 活性。本研究中，将此 FRET 探针分别转染到 MDA-MB 435s 细胞（高表达 MMP s）和MCF-7 细胞（低表达 MMPs），筛选稳定表达荧光探针的细胞株，利用 FRET 技术在活细胞内实时监测了 MMPs 的活性及 MMPs 抑制剂 GM6001 的作用。此外，将稳定表达 FRET 探针 DsRed- M

4、MP 识别序列-CFP 的 MDA-MB 435s 细胞接种在无壳鸡胚上，通过监测 DsRed 和 CFP 的荧光比例信号在体反映肿瘤生长过程中的MMP 活性，同时用 MMPs 抑制剂GM6001 作用于肿瘤 3 天，发现消失的 DsRed科技攻关计划（2005BA711A04），重点基础研究发展计划（973 计划）课题(2004CB520804)，教育部科学技术研究项目10420)资助项目。I华技大学博士荧光信号明显增强，结果表明构建的 FRET 探针能够灵敏在体地检测金属蛋白酶的活性。因此，所构建的荧光探针可以灵敏地检测 MMP 的活性并用于 MMP 抑制剂的的抗癌的研究。：基质金属蛋白酶

5、荧光共振能量转移成像荧光蛋白II华技大学博士AbstractMatrix Moproteinases (MMPs) are capable of degrading almost all extracellularmatrix (ECM) and basement membrane (BM) components. They play an important role innormal issue remling and growth, as well as in many destructive pathologicalconditions such as tumour growth, i

6、nvasion and metastasis. MMPs inhibitors have gooddevelopment and application prospenovel anti-tumor pharmacotherapy. The approachwhich real-time detecting MMPs activity has an important role in screening MMPs inhibitorsGenetically encoded fluorescence resonant energy transfer (FRET) probes are used

7、to detect proteinase activity, and FRET imaging can monitor proteinase activity in living cells. In this study, we construct two FRET probes to detect MMPs activity in the living and in vivo. The designing principle is to link CFP and YFP or CFP and DsRed with MMPs substract peptide. In this way, th

8、e fusion proteins YFP-MSS-CFP or DsRed-MSS-CFP are constructed.The purified probe can be used to analyze MMP activity by spectrum detection in vitro, and this probe is specific for MMP2. And with a display approach, the fusion proteins are displayed on the cells surface to detect secretory MMPs acti

9、vity. FRET probe will be intact in the absent of extracellular MMPs, the fluorescence resonant energy transfer between CFP and YFP (or CFP and DsRed) will occur. However, when high extracellular MMPs are secreted, FRET probe will be degraded. And this results in YFP or DsRed out of the cells, but CF

10、P was still on the cells. Therefore, MMPs activity can be detected either by FRET imaging or by YFP (or DsRed) imaging. FRET probes were stably expressed in MDA-MB 435s cells, in which high secretory MMPs were expressed and MCF-7 cells that expressed low levels of MMPs. The FRET sensor YFP-MSS-CFP d

11、isplay can sensitively and reliably monitor MMP activation and GM6001 inhibitor effect in living cells in real-time.The DsRed-MSS-CFP was expressed in MDA-MB 435s cells that highly expressingendogenetic secretory MMP, so that the DsRed-MSS-CFP was cleaved by MMP and the fluorescence ratio of DsRed2

12、to CFP was decreased. When the cells were treated byIII华技大学博士GM6001, an MMP inhibitor, it could block the cleavage of DsRed-MSS-CFP and causedan increase of fluorescence ratio of DsRed2/CFP. The same result was achieved by usingtumor mthat DsRed-MSS-CFP expressing MDA-MB-435s cells inoculated onto t

13、hechorioallantoic membrane of developing chick embryos form primary tumors on the membrane. Thus, the fluorescent probes are able to sensitively monitor MMP activationand be used to assess MMP inhibitors for anti-cancer research in vivo.Keywords: Matrix mloproteinase (MMP)Fluorescence Resonant Energ

14、y Transfer (FRET)ImagingFluorescence ProteinIV独创性本人所呈交的是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明的内容外，本不包含任何其他个人或集体已经或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全本的法律结果由本人承担。作者签名：日期：年月日使用书本作者完全了解学校有关保留、使用的规定，即：学校有权保留并向有关部门或机构送交的复印件和，被查阅和借阅。本人华技大学可以将本的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等保存和汇编本。，在年后适用本书。本属于不。（

15、请在以上方框内打“”）作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华技大学博士1绪论1.1金属蛋白酶概述是引起人类的主要疾病之一，而肿瘤的转移（metastasis）是引起的主要高度之一。肿瘤转移是肿瘤细胞从灶向远处组织形成转移灶，它是的一个重要特征，肿瘤细胞与其生存的宿主组织基质的外环境的平衡性是肿瘤转移的关键因素。近年来对肿瘤细胞侵袭转移的生物学机制进行了大量研究1，肿瘤在被侵入组织生长需要依赖肿瘤细胞参与的两类相互作用：肿瘤细胞与宿主组织基质细胞之间的细胞与细胞相互作用、肿瘤细胞与细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)成分之间的细胞与基质相互作用2。这些相互作用

16、会激活、一系列细胞因子和生长因子如表皮生长因子(EGF)、 生长因子(VEGF)等3,4，这些因子可以直接或间接地刺激肿瘤的生长，也可以直接产生促进肿瘤细胞不断的繁殖。在参与肿瘤细胞的侵袭转移调控过程中，蛋白质水解酶（proteases）在扮演了重要的，尤其是细胞外的蛋白质水解酶，因为它们直接参与了肿瘤细胞与周围基质细胞和基质成份之间的酶解作用，改变了它们固有的平衡状态，导致了肿瘤细胞的恶化。例如金属蛋白酶、尿激酶、Furin 蛋白酶。对于绝大多数灶肿瘤细胞来说，其中只有小部分具有转移能力。细胞在转移时一般要经过以下几个过程：脱离肿瘤组织、向淋巴管或中迁移、穿过内皮细胞粘附、基底膜、穿透腔、逃

17、脱免疫监视、与远离灶的离开、在被侵入的微环境中存活和生长。由于这些复杂的过程牵涉许多细胞与水平的调控与分化，其实肿瘤产生转移效率并不高，但是若有少数灶肿瘤细胞克服各种屏障转移到其它的组织部位生长并形成新的克隆，就会产生肿瘤的，形成高发性转移，而这种新转移肿瘤会获得了更高的转移性，肿瘤的转移是造成癌症治疗失败的主要之一。大量的研究结果表明基质金属蛋白酶（ Matrixmloproteinases，MMPs）在肿瘤的这些过程中都起到了重要的作用。基质金属蛋白酶是蛋白酶水解酶的一种，可分解细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)蛋白的酶，无论在正常或病理细胞中，它们都扮演重要的

18、。基质金属蛋白酶在正常细胞中具有重要的生理功能，如对于生殖过程也非常重要，MMP成员1华技大学博士以及卵着床的过程5；MMP 还参与了分娩之后的参与了、与泌乳图 1.1 基质金属蛋白酶的结构: 基质金属蛋白酶根据结构的不同可分成 8 个组，其中 5 个组是型蛋白，3 个是膜结合蛋白（membrane-type MMPs，MT-MMPs）。蛋白：最小的的蛋白结构域包含 3 个结构域，信Zn2+号肽(Pre) 指导蛋白酶进入内质网，前肽区有一个与结合的 SH 基团，封闭蛋白酶的活性；催化区是一个 Zn2+的结合区。还有的 MMP 蛋白酶具有绞链区和血液结合素相似区，绞链区具有与组织金属蛋白酶抑制剂

19、蛋白、细胞表面的和蛋白酶底物位点相互结合的特性。在血液结合素相似区第一个与第四个重复区段由二硫键结合。可与明胶结合的 MMP 包含着与胶原蛋白结合的 fibronectin（Fi）相似的重复序列。有的MMP 包括一个 Furin蛋白酶识别区，可以被细胞内的 Furin激活。膜结合 MMP（MT-MMP）：包括一个 C 端的跨膜区（ transmembrane domain ， TM ）和一个短的胞内区 （cytoplasmic domain，CY）。有的膜 MT-MMP 是与 GPI结合而锚定在膜上的。MMP-23 是第二种类型的膜结合MMP。N 端是一个信号结合（signal anchor，

20、SA）肽，可结图 来 自 Nature Review Cancer,2002, 2: 161-174合到细胞膜上，它上面还有一个独特的半胱氨酸区和免疫球蛋白蛋白类似区（Ig-like domains）9。Fig 1.1 The protein structure of the MMPs. Matrix m loproteinases (MMPs) can be divided into eight distinct structural groups, five of which are secreted and three of which are membrane-type MMPs(MT

21、-MMPs). Secreted MMPs: The minimal-domain MMPs contain an amino-terminal signal sequence (Pre) that directs them to the endoplasmic reticulum, a propeptide (Pro) with a zinc-interacting thiol (SH) group that maintains them as inactive zymogens and a catalytic domain with a zinc-binding site (Zn). In

22、 addition to the domains that are found in the minimal domain MMPs, the simple hemopexindomain- containing MMPs have ahemopexin-like domain that is connected to the catalytic domain by a hinge (H) which mediatesinteractions with tissue inhibitors of mloproteinases, cell-surface molecules and proteol

23、ytic substrates. Thefirst and the last of the four repeats in the hemopexin-like domain are linked by a disulphide bond (SS). The gelatin-binding MMPs contain inserts that resemble collagen-binding type II repeats of fibronectin (Fi). The furinactivated secreted MMPs contain a recognition motif for

24、intracellular furin-like serine proteinases (Fu) between their propeptide and catalytic domains that allows intracellular activation by these proteinases. This motif is also found in the vitronectin-like insert (Vn) MMPs and the membrane-type MMPs (MT-MMPs). MT-MMPs: MT-MMPs include transmembrane MM

25、Ps that have a carboxy-terminal, singlespan transmembrane domain (TM) and a very short cytoplasmic domain (Cy), and the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored MMPs. MMP-23 represents a third type of membrane-linked MMP. It has an N-terminal signal anchor (SA) that targets it to the cell membran

26、e, and so is a type II transmembrane MMP. MMP-23 isalso characterized by its unique cysteine array (CA) and immunoglobulin (Ig)-like domains.2华技大学博士之后的在功能改变之后大小和形状的恢复过程6，在受伤组织中表达有利于伤口的重新生长与愈合；另外在正常组织的发育过程中也参与了重要的调控作用。在对细胞的研究中，发现基质金属蛋白酶可水解细胞外的基底膜蛋白，帮助肿瘤细胞穿过基底膜，对侵袭性肿瘤的转移起着非常重要的作用。表 1.1基质金属蛋白酶的分类Table

27、1.1The classes of MMPs基质金属蛋白酶MMP 排序量主要底物(Da)型1813570007500054000间质性胶原酶、型性胶原嗜中性胶原酶、型性胶原胶原酶、型性胶原型明胶酶 A明胶酶 B金属弹性蛋白酶2912720009200052000、型胶原，明胶原、型胶原，明胶原弹性蛋白型基质溶素-1 基质溶素-2 Matrilysin型3107580005800028000Laminin，Laminin， Laminin，结合蛋白，黏蛋白结合蛋白，黏蛋白结合蛋白，黏蛋白基质溶素-3 型膜型 MMP 型膜型 MMP 型膜型 MMP型膜型 MMP111429000660007600

28、070000-1 抗胰蛋白酶明胶酶原 A未定未知未定未知未定未知未知在 1962 年初，最早纯化到了 MMP中的第一个成员 MMP-1，它是从蝌蚪尾巴发现的间质性胶原酶（interstitial collagenases）7,8。由于青蛙在从蝌蚪到成年的变3华技大学博士态过程中，通过胶原酶将基质吸收或破坏。直到现在为止，已有二十多种金属蛋白酶被发现，它们被统称为基质金属蛋白酶。MMP 是一组锌离子依赖性内肽酶，它们大小各异，底物不尽相同，但一般都含有信号肽、前肽和催化区 3 个基本的结构域，酶催化区和前肽区具有高度保守性（如图 1.1）。现在已经发现的 MMPs，可粗略分为四型(如表 1.1)

29、：I 型：胶原酶包括间质性胶原酶、嗜中性胶原蛋白酶（neutrophil collagenase）和胶原酶三种。 此三种都可分解 I、II、III 型状胶原质（ fibrillar collagens）。II 型：包括为两种 72kDa(明胶酶 A)、92kDa(明胶酶 B)的明胶酶（gelatinases）和金属弹性蛋白酶（mloelastase）,两种明胶酶可分解 IV、V 型基底层（basallamina）非状胶原质, 也可分解型的胶原质、结合蛋白（fibronectin），X型的短链胶原质、弹性蛋白和金属蛋白酶。III 型: 包括为基质溶素-1（stromelysin-1）、基质溶素-

30、2、matrilysin，它们可分解IV 型的胶原质和型胶原质中的蛋白多糖（proteoglycan）、结合蛋白、laminin。IV 型：膜型基质金属蛋白酶（membrane-type mloproteinase，MT-MMP）可结合于胞膜上，MT-MMP 是以特殊的活性明胶酶原 A（activate progelatinase A）出现。从最初的发现至今, 已有数个 MT-MMP 的的 IV 型。被确定, 这些酶都暂时归于 MMP1.2MMP 在肿瘤中的作用1.2.1MMP 有助于肿瘤细胞转移MMP 的表达既受癌的调控也受许多肿瘤演化过程中的生长因子调控。在肿瘤细胞系中能分离出许多不同的

31、MMP 蛋白，并且在肿瘤样本中能检测出高水平表达1。肿瘤细胞在穿过周围组织转移时有 MMP 水平升高，因此 MMP 被广泛认为参与了肿瘤细胞的侵袭转移过程。MMP 具有选择性地剪切基质蛋白的功能，最初认为高表达 MMP 的肿瘤细胞，酶解细胞外基质能使肿瘤细胞跨基底膜而运动。在细胞和动物的转移模型的实验都证实了这样一种观点：MMP 在肿瘤的侵袭过程中起重要作用。通过体外检测细胞穿过天然或人工基底膜的能力，发现 MMP 的活性与细胞侵袭能力相关：增加 MMP 的表达水平，可增强肿瘤细胞的侵袭能力；相反当降低 MMP的表达水平，就会减弱肿瘤细胞的侵袭作用。将肿瘤细胞注射入动物的尾静脉或原4华技大学博

32、士位种植构建实验性自发转移模型，可通过检查靶中转移灶的数目来肿瘤转移的效果，这种肿瘤的生长转移模型也能得到相同的结论，即肿瘤的侵袭能力与MMP 的表达水平正相关。另外，有时肿瘤细胞只高表达 MMP的中的某个成员，就能引起侵袭或转移能力的改变，提示对某一 MMP 调控的改变足以改变肿瘤演进的过程，例如在乳腺上皮细胞中高表达 MMP3 即可增强其侵袭的表型10。基于大量的实验得到的结论，现已将 MMP 作为肿瘤已经被用作多种类型肿瘤的诊断指标。治疗重要的药靶，并且 MMP 在临图 1.2（A）经典的观点认为 MMPs（用剪刀代表）由肿瘤产生并，降解了细胞外的基质膜和基质成份，因此促进了细胞的侵袭与

33、转移。（B）目前的观点认为 MMPs 在肿瘤的侵袭、增的生成、多个过程起到了重要的作用。而且 MMPs 不仅被肿瘤细胞殖、，也可以被周围的基质细胞产生。图来自 SCIENCE，2002 VOL 295：23872392Fig.1.2 (A) Early view of MMP action in cancer. MMPs (represented by scissors) were classically viewed as being produced and secreted by tumor cells, degrading basement membrane and extracell

34、ular matrix components, thereby facilitating tumor cell invasion and metastasis. (B) Current view of MMP action in cancer. MMPs are now known to contribute to multiple steps of tumor progression in addition to invasion, including tumor promotion, angiogenesis, and the establishment and growth of met

35、astatic lesions in distant organ sites. In addition, it is recognized that MMPs not only can be synthesized bytumor cells but are frequently produced by surrounding stromal cells。5华技大学博士另外的一些实验事实也印证了上面的观点：组织蛋白酶抑制剂（ TissueInhibitor of mloproteinases, TIMP）是细胞表达的天然抑制剂，通过增加 TIMP的水平，或通过使用人工抑制剂对 MMP 活性进行

36、抑制，对肿瘤细胞的侵袭和转移起到明显的抑制效果69。服用重组 TIMP 蛋白或通过引入 TIMP以高表达 TIMP 蛋白，可抑制高转移细胞的侵袭和转移。对人工抑制剂也进行了类似的抑制 MMP 活性实验70。在人细胞中高表达 TIMP2 蛋白，同时应11。总之，这些结果均肯定了用人工MMP 抑制剂可阻碍癌细胞进入MMP 在侵袭中的作用。1.2.2MMP 调节肿瘤的发生与生长的小鼠体内生长的繁殖速度明显比野生型的慢71，72，肿瘤细胞在MMP-9表明 MMP 可产生有助肿瘤细胞生长的因子。有三种方式可肋肿瘤细胞的生长，第一是 MMP 可以有助于出膜结合起来的生长因子，如 TGF-73。第二酶切 E

37、CM 蛋出来74，75。利用白可产生肽生长因子，例如 IGF 可由 IGF-BP 被 MMP 酶切后转小鼠提供的一种体内模型系统，可以分析肿瘤和基质细胞的相互作用，并且可以提供关于单个产物如何影响肿瘤演进全过程的非常重要的信息。利用工程技术获得的高表达 MMP 转小鼠的研究已经揭示了 MMP 对肿瘤发生的作用。近来，有表表达 MMP3 的转小鼠，形成率增加，可能与肿瘤演进过程中多阶段的改变有关10。高表达 MMP7 的转瘤形成率增加12。与此相似，高表达 MMP-13 可以造成小鼠在模型中肿剂诱发的皮肤癌模型中肿瘤形成率增加。这些依赖于 MMP 所引起的肿瘤起始和发生率增加均发生在肿瘤演进的早

38、期，远在转移出现之前。这些结果均支持 MMP 在肿瘤发生和生长中的作用。1.2.3MMP 对生成的作用肿瘤的形成是一个复杂的过程，需要包括肿瘤形成等多个的协同作用。肿瘤在生长过程中，则必须有新生的形成才能进一步生长。因为内皮细胞，所以在生成过程中 MMP 活性对内皮细胞的必须穿越其底膜才能形成新的侵入是非常重要的14。现有研究结果支持 MMP 在生成中的作用，抑制 MMP2与其底物作用可减少的生成15。在动物体内的实验用内源性的和的 MMP6华技大学博士的生长77，78，79，实验表明抑制剂两者都能减少MMP 是重要的正调控成份。MMP2，MMP9 和MMP14 直接参与了的生长，MMP19

39、也对的生长80，MMP2敲除小鼠的肿瘤细胞生长减少，新在生成中的作用。另外利用的生成。因此，MMP 活性与的形成也比对照动物少，进一步说明了 MMP2的 MMP 抑制剂也可在体外和体内实验中减少的生成有关，提示在治疗中 MMP 抑制可作为生成抑制发挥抗肿瘤作用14。1.2.4MMP 还可降解其它蛋白E2 钙粘合素也是 MMP 的一个底物，E2 钙粘合素是细胞之间的连接蛋白81，许多证据显示 E2 钙粘合素的下调，可以引起对多种细胞功能的调节，因此对于肿瘤的发生是非常重要的。因此 MMP 可以直接细胞与细胞及细胞与基质之间的连接。当肿瘤细胞获得穿越组织侵袭和转移的能力时，细胞与细胞及细胞与基质之

40、间的连接均遭到破坏。细胞中高表达 MMP-3 可以引起细胞间连接的破坏，而这种破坏与对 E2 钙粘合素的酶解增加有关。研究显示 MMP 还可以酶切参与肿瘤演化过程中的其他蛋白，生化实验证实MMP 可以降解和激活其他 MMP。例如：MT1-MMP 参与 MMP-2 的结合和激活16。总体来说，在肿瘤形成的特定阶段，多个 MMP 家庭成员协同高表达，一个 MMP 的激活可以其他 MMP 的激活。胰岛素样生长因子(IGF, insulin-like growth factor)通过与 IGF 结合蛋白相互作用而失去生物学活性。MMP 可以降解 IGF 结合蛋白，使 IGF 从这个抑制性连接中。和。除

41、了通过降解基质而将包埋在基质中的生长因子之外，MMP 还可以直接激活某些生长因子。在经 MMP 剪切之后，细胞表面的生长因子和受体可被在体外 MMP-3 可以剪切和 可溶性生长因子肝素结合表皮生长因子(heparin binding epidermal growth factor，HB-EGF)，HB-EGF 对肿瘤细胞增殖和生长具有促进作用17。另外许多生长因子的受体也受 MMP 的酶切。FGF-I 型受体可介导成细胞生长因子的作用已被证实为 MMP-2 的底物。一些生长因子需在剪切后成生物活性形式，而另一些生长因子则需要去除抑制物。MMP-3 可剪切白介素 21变成活性形式18。现在研究显

42、示 MMP 具有广泛的底物以调控肿瘤的生长、侵袭和转移等特性。7华技大学博士1.3基质金属蛋白酶抑制剂（MMP inhibitor,MMPI）临床开发的 MMP 抑制剂，表自 Nature Reviews Cancer 2006, 6: 227-239 19Table 1.2 MMP inhibitors in clinlical development,from Nature Reviews Cancer 2006, 6: 27-239表 1.21.3.1的化学 MMP 抑制剂抗肿瘤药由于认识到 MMPs 在肿瘤侵袭、转移中起着重要的作用，因此对 MMPs 抑制剂的研究开发倍受重视。MMPs

43、 抑制剂化合物很多都能抑制一种或多种基质金属蛋白酶，特别是抑制 MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-14等，这些化合物也能抑制细胞肿瘤坏死因子，最近这类化合物又被认为在恶性肿瘤或白身免疫病方面的治疗将有一定疗效。从 80 年代初期开始发展MMPIs，这些抑制剂是多肽衍生物，是胶原质金属结合基的类似物，可竞争结合金属离子 MMP 上活化位置的锌原子，微摩尔量的 MMP 抑制剂就对 MMP 的活性起抑制作8华技大学博士用。目前这方面的研究开始受到关注，有些己进入临床试验期，如 batimastat和 marimastate 在动物模型中用于抑制肿瘤的生长

44、和转移，并且己经用于临床三期试验。Batimastat （BB-94，British Biotech Inc.Oxford.UK），是一个人工的异羟肟酸化合物，具有广谱抑制 MMP 的特性,其结构模拟了胶原酶。在鼠中用 batimastat处理可减少转移的密度，并且因此抑制生成，另一方面 batimastat 可以诱导肝转移，与肝转移的时候肝中 MMP-2 和 MMP-9 mRNA 水平上调相一致了，根据这些实验数据，的 MMPs 的抑制剂己经在临床试验中显示出双重的作用19。Batimastat 通过螯合 MMP 酶活性中心的锌离子而起作用。这是第一个进入临床实验的 MMPI。虽然在动物模型

45、上可抑制肿瘤的生长和转移，但其主要缺点是在水中极度不溶。然而由于它可以减轻恶性腹水和胸腔积水，所以并不影响它作为一个腹膜内和胸膜内制剂使用25。Marimastat (BB - 2516) 是第二代人工MMP 抑制剂，又是第一个可口服的MMPI。期和期临床试验中,Marimastat 对结临用于抗肿瘤治疗的人工直肠癌、癌和癌均具有剂量依赖性的生物学效应(通过测定血清肿瘤标志物水平而定) 。Marimastat 正处于与细胞毒性化疗和小细胞肺癌的比较性期临床试验中。Marimastat 作为胰应用治疗胃癌、胰手术切除后的化疗辅助的应用也在测试中。Batimstat 和 Marimastat 的剂

46、量依赖性副作用是伴有肌腱和关节炎。这些副作用可在停服 MMPI 后逆转20, 21。另外，对于是否 MMP中所有蛋白均参与了肿瘤的生长或转移的过程尚不清楚。因此，开展毒副作用更小的特异的抑制剂更具吸引力。近来已有明胶酶的特异制剂可以选择性地抑制MMP-9 和MMP-2，动物模型中显示可抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移，并且可延长异种移植肿瘤动物的存活时间。Bryostatin 类化合物 Bryostatin 是天然的大环内酯类化合物，通过与人工的MMPI 不同的作用机制抑制 MMP。这种抑制作用的机理尚不清楚，但有研究表明与影响蛋白激酶 C (protein kinase C, PKC) 的活性

47、有关。由于 MMP -1，MMP-3，MMP-9和 MMP-11 均属于 PKC 反应，所以 Bryostatin 可能通过抑制这些的转录而起作用。BAY12-29566 (Bayer) 是一个 Bryostatin 类化合物，它对多种肿瘤模型均有作用，是一个新型、非多肽的联苯类 MMP 抑制剂。该化合物也通过抗生成的途径而抗转移，本身不影响细胞增殖，仅对内皮细胞侵入基质有抑制作用22。Bayer药品停止了它的 MMPs 抑制剂 Byerl2-9566 的所有临床试验，因为在小细胞肺癌的患9华技大学博士者，抑制剂比安慰剂的作用还差23 24。这些相反的发现表明明胶酶在肿瘤发展过程中的复杂作用。

48、因此对肿瘤患者 的应用 MMPs 的抑制剂还有赖于对其参与的分子机制的理解。另一个 Bryostatin 类化合物，AG3340 (agouron)，在体内模型中可抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭，同时可增加荷瘤动物存活时间。四环素是已知的抗微生物 ，研究表明对 MMP 也有抑制作用。 的化学修饰四环素(chemically modified tetracyclines，CMTs)，既保留了抗 MMP 的活性,又癌动物模型中显示出一定作用26。消除了抗菌作用。其中一个化合物 CMT-3 在由于 MMPI 属于细胞抑制而不是细胞毒类化合物，所以在临床实验中传统的用来评价细胞毒类作用的指标，如肿瘤体积缩

49、小，对此类不适用。因此建立了肿瘤转移休眠的概念，即在某些情况下，将肿瘤从进展型调整到一个较安静的状态也可看作是一种治疗的结果。为了维持这种静息眠状态，必需长期服用这类，所以它们的毒性也需要引起重视。CT17416 是一种的 MMP 抑制剂，是此类药物的代表。在结直肠癌动物实验中，CT1746 可减少肿瘤的生长、侵袭和转移，并能增加存活率。此外还可采用其他相关的指标用来评价此类的疗效。例如在 Marimastat 的早期临床试验中，采用了血清中肿瘤标志物 CEA(carcinoembryonicantigen，癌胚抗原)的水平变化作为指标。但直到现在使用这类指标的可靠性尚未得到证实。Watson

50、 及其同事们检测了小鼠胃癌的生长与 CEA 水平的关系，发现血清中 CEA 的水映了肿瘤的大小，因此认为在标27。细胞毒类的早期抗肿瘤作用时可以使用此类指随着对许多新结构化合物作为底物的深入研究，新型的 MMP 抑制剂会不断出现。已有抗菌药 hypothemycin 可以抑制 Ras 诱导的 MMP- 1、MMP-3 和 MMP-9 的表达，这代表了一个新的通过转录调控的 MMP 抑制途径28。在正常成年人的组织中，MMP 的水平是较低的；只有在系统接受一个刺激，如伤口需要修复或在病理状态下，MMP 水平才会升高。正常 MMP 的低表达状态使其成为在和其它疾病治疗中的一个吸引人的靶点，因为这对

51、正常生理功能的影响可能是很小的。然而，在最初的临床试验中，人们发现 MMP 抑制剂具有引起关节痛的副作用，因此MMP 的活性可能与关节的正常生理功能有关19。10华技大学博士1.3.2组织表达的天然剂另外，组织自身也会表达多利抑制剂来调控 MMP 的活性，抑制剂包括一般的血浆蛋白酶抑制剂，像 a2-巨球蛋白；还包括组织表达特殊的抑制剂，如 TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 等。MMPs 的酶解能力与酶和抑制剂的剂量有关，当酶和抑制剂之间的平衡打破后，会多种疾病如关节炎、硬化症、等。研究显示,发展过程中，MMP 的作用力大于抑制剂，MMP 会帮助肿瘤的扩散和、并通过的抑制剂细胞壁、在新的

52、部位生长、及提供生长的增生。天然或可用来治疗，然而使用天然的抑制剂 TIMP-1、TIMP-2 会有口服上的限制。因为它们的大小分别为 28kDa 和 21kDa，这限制了抑制剂或重组 TIMP 的功能区是较有效的方法。的穿透性, 所以1.4荧光共振能量转移技术1.4.1基本原理FRET 是一个无辐射的量子能量转移现象，它指的是当一个荧光（即供体）受到激发时，能量向邻近的另一荧光基团（即受体）转移的过程，如图 1.3 a 所示。一对光谱合适的荧光物质可以一个能量供体(donor)和能量受体(acceptor)对，它们之间由于偶极-偶极的相互作用，激发供体的光子能量 h 可能被传递至受体，而后受

53、体通过发射出光子 h(hh)而驰豫，这就是 1948 年由Frster 首先提出的荧光共振能量转移理论32。根据 Frster 理论，两个互相靠近的k 2 s，其中 K是常数，k2 是偶极子排列“同向发生共振能量转移效率为 E = K R 6因子”，R 是两间的距离，是重叠，即受体激发谱与供体发射谱的重叠程度。荧光共振能量转移是通过供体发光体与受体发光体之间的能量转移效率来测量供体与受体之间的空间距离的荧光光谱技术。FRET 在研究蛋白质、核酸构象及蛋白质相互作用中起着重要的作用33。荧光共振能量转移(FRET)是一个距离依赖的物理过程，在此过程中，一个荧光作为供体被激活，部分激活能量借助之间

54、长偶极子偶联作用以非辐射的方式转移给邻近的另一受体。FRET 发生时，供体与受体之间的距离小于10nm，能量转移效率与供、受体之间距离六次方的倒数呈正相关。FRET 现象11华技大学博士并不一定要求受体会发荧光，但要想对 FRET 进行检测计算并作进一步的分析研究，则必须要求受体象供体一样是发荧光的，而且受体以 FRET以外的其它机制淬灭供体所发荧光。图 1.3 bFRET 能量转移效率与距离的关系Fig 1.3 b The relation of FRET efficiency and distance图 1.3 aFRET 示意图Fig 1.3 a Schematic representation of FRET由于 FRET 效率与供体受体间的距离 6 次幂的关系，所以 FRET 效率对距离的变化非常灵敏，当两者距离变大，其能量转移效率就会迅速下降，如图 1.3 b 所示。图中 E 为发生荧光共振能量转移的效率，R 为受体与供体间的距离，R0 为能量转移效率为 50%时所对应的能量供体和受体间临界能量转移距离。FRET 是间偶极相互作用将供体