NOX2促进心肌间质纤维化和舒张功能障碍培训

1、内皮NADPH氧化酶-2通过促炎效应和内皮-间质转化促进间质心肌纤维化和舒张功能障碍1123通讯作者：Professor Ajay M Shah.通讯地址：The James Black Centre, Kings College London, 125 Coldharbour Lane, London SE59NU, UK. Tel: +44 2078485189; Fax: +44 2078485193; E-mail: ajay.shahkcl.ac.uk文章简介JACC是美国心脏病学会的官方杂志和该领域的领导者，它发表了有关心血管疾病各个方面的经过同行评审的原始临床和实验报告。 涵盖的

2、主题包括冠状动脉和瓣膜疾病，先天性心脏缺陷，血管外科手术，心肌病，药物治疗，新的诊断技术，实验室的发现以及新疗法的大型多中心研究。 专题讨论会，临床评论和更新，社论评论和信函是经常发表的内容。10.1016/j.jacc.2014.02.572目的：探讨内皮功能障碍对心肌肥厚和纤维化的影响。背景：内皮功能障碍伴随着心肌肥厚和纤维化，但其对这些疾病的作用尚不清楚。 NADPH氧化酶-2（NOX2）激活增加导致内皮功能障碍。方法：内皮特异性NOX2过表达（TG）转基因小鼠和野生型幼鼠接受慢性血管紧张素II泵入（1.1mg/kg/天，2周）诱导肥大和纤维化。结论：在体内AngII诱导的内皮细胞NOX

3、2激活具有促心脏纤维化作用，诱导舒张功能障碍的表型。 内皮NOX2激活增强具有促炎作用。 这可能是潜在的肾素-血管紧张激活期间心脏纤维化和舒张功能障碍重要机制。摘要3 Brutsaert及其同事3证明心脏内皮细胞直接影响心肌收缩，后来在人体内证实了这个概念。5内皮-心肌细胞串扰在几种疾病中的重要性已得到证实。3,6然而，内皮功能障碍在肾素-血管紧张素激活增加引起的心脏不良重塑的发病机制中的作用尚不清楚。 内皮功能障碍的主要驱动因素是ROS生成酶NOX2，它被AngII和其他激动剂激活。7NOX2在内皮细胞、心肌细胞、成纤维细胞、炎性细胞和血管平滑肌细胞中均有表达。 高血压患者血管NOX2的表达

4、和活性增加，调节促进血管重塑的细胞内信号通路，通过超氧化物介导的一氧化氮失活导致血管舒张功能障碍，并可能具有促炎症作用7。前言4 实验动物：野生型C57/BL6小鼠；内皮特异性NOX2过表达（TG）转基因 C57/BL6小鼠；Nox2基因敲除C57/BL6小鼠；嵌合 C57/BL6小鼠（骨髓移植产生） 实验细胞： 人主动脉内皮细胞（购买）； 冠状动脉微血管内皮细胞（小鼠分离）；人F153成纤维细胞（购买） 小鼠血压测量；小鼠心脏超声；小鼠心脏功能的有创导管检查 白细胞粘附实验；NADPH氧化酶活性检测；流式细胞学 免疫组织化学；激光共聚焦显微镜蛋白定位；蛋白印迹；PCR材料与方法5实验结果（1

5、） 内皮NOX2过表达对AngII所致高血压和心脏肥厚的影响 内皮NOX2过表达增强AngII诱导的心脏纤维化 NOX2-TG内皮细胞收缩功能保留的左室舒张功能障碍 内皮NOX2增强心肌炎性细胞浸润 NOX2增强内皮激活和白细胞-内皮相互作用 炎症细胞NOX2对于AngII诱导的心脏纤维化并不是必需的 NOX2促进内皮-间充质转换(EMT) 内皮细胞对成纤维细胞的旁分泌作用补充-图1选题意义实验动物：WT小鼠；Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：AngII（1.1mg/kg/d，2w）取材：左室组织实验方法：小鼠血压计；NADPH活性试剂盒检测指标：血压、NADPH氧化酶活性、左心室重量/体

6、重、细胞面积7补充-图2选题意义实验动物：Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：AngII（1.1mg/kg/d，2w）DPI（10M）-NADPH抑制剂L-NAME（100M）-NOS 抑制剂Tiron（20M）-磺酸钠（治胃炎/胃溃疡）oxypurinol（100M）-黄嘌呤氧化酶抑制剂rotenone（1.5M）-抑制线粒体呼吸链apocynin (100 M) -选择性的NADPH氧化酶抑制剂取材：左室组织实验方法：荧光素（5m）增强化学发光检测指标：NADPH氧化酶活性-化学发光8实验结果（2） 内皮NOX2过表达对AngII所致高血压和心脏肥厚的影响 内皮NOX2过表达增强AngI

7、I诱导的心脏纤维化 NOX2-TG内皮细胞收缩功能保留的左室舒张功能障碍 内皮NOX2增强心肌炎性细胞浸润 NOX2增强内皮激活和白细胞-内皮相互作用 炎症细胞NOX2对于AngII诱导的心脏纤维化并不是必需的 NOX2促进内皮-间充质转换(EMT) 内皮细胞对成纤维细胞的旁分泌作用图1选题意义实验动物：WT小鼠；Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：小麦胚芽凝集素天狼星红取材：左室组织实验方法：免疫组织化学检测指标：胶原10补充-图1选题意义实验动物：WT小鼠；Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：AngII（1.1mg/kg/d，2w）取材：左室组织实验方法：胶原面积计算；PCR检测指标：

8、纤维化、胶原mRNA表达11实验结果（3） 内皮NOX2过表达对AngII所致高血压和心脏肥厚的影响 内皮NOX2过表达增强AngII诱导的心脏纤维化 NOX2-TG内皮细胞收缩功能保留的左室舒张功能障碍 内皮NOX2增强心肌炎性细胞浸润 NOX2增强内皮激活和白细胞-内皮相互作用 炎症细胞NOX2对于AngII诱导的心脏纤维化并不是必需的 NOX2促进内皮-间充质转换(EMT) 内皮细胞对成纤维细胞的旁分泌作用补充图3选题意义实验动物：WT小鼠；Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：AngII（1.1mg/kg/d，2w）实验方法：小鼠心脏超声检测指标：IVSD-室间隔厚度LVEDD-左室舒

9、张末期内径LVESD-左室收缩末期内径EF-射血分数HR-心率13补充图4选题意义实验动物：WT小鼠；Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：AngII（1.1mg/kg/d，2w）实验方法：小鼠心脏功能（压力容积曲线）检测指标：Ees-左室收缩末弹性模量dP/dt-maxEDV-左心室内压最大速率EDV-舒张末期容积ESV-收缩末期容积SW-搏出功EDPVR-舒张末期压力容积关系14选题意义15实验结果（4） 内皮NOX2过表达对AngII所致高血压和心脏肥厚的影响 内皮NOX2过表达增强AngII诱导的心脏纤维化 NOX2-TG内皮细胞收缩功能保留的左室舒张功能障碍 内皮NOX2增强心肌炎性

10、细胞浸润 NOX2增强内皮激活和白细胞-内皮相互作用 炎症细胞NOX2对于AngII诱导的心脏纤维化并不是必需的 NOX2促进内皮-间充质转换(EMT) 内皮细胞对成纤维细胞的旁分泌作用图2选题意义实验动物：WT小鼠；Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：AngII（1.1mg/kg/d，2w）取材：左心室组织实验方法：蛋白印迹，白细胞粘附实验检测指标：CD45+、MAC3+、VCAM-1、17补充图5选题意义实验动物：WT小鼠；Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：AngII（1.1mg/kg/d，2w）取材：左心室组织实验方法：免疫组织化学检测指标：CD45+、MAC3+18补充图6选题意

11、义实验动物：WT小鼠；Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：AngII（1.1mg/kg/d，2w）取材：左心室组织实验方法：PCR检测指标：mRNA-TGF、TNF、Endothelin1、CTGF、Osteopontin、MCP119补充图7选题意义实验动物：WT小鼠；Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：AngII（1.1mg/kg/d，2w）取材：左心室组织实验方法：免疫组织化学、蛋白印迹检测指标：SBP纤维化左室重量/体重CD45+20实验结果（5） 内皮NOX2过表达对AngII所致高血压和心脏肥厚的影响 内皮NOX2过表达增强AngII诱导的心脏纤维化 NOX2-TG内皮细胞收缩

12、功能保留的左室舒张功能障碍 内皮NOX2增强心肌炎性细胞浸润 NOX2增强内皮激活和白细胞-内皮相互作用 炎症细胞NOX2对于AngII诱导的心脏纤维化并不是必需的 NOX2促进内皮-间充质转换(EMT) 内皮细胞对成纤维细胞的旁分泌作用补充图8选题意义实验动物：WT小鼠；Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：AngII（1.1mg/kg/d，2w）取材：左心室组织实验方法：免疫组织化学检测指标：VCAM122实验结果（6） 内皮NOX2过表达对AngII所致高血压和心脏肥厚的影响 内皮NOX2过表达增强AngII诱导的心脏纤维化 NOX2-TG内皮细胞收缩功能保留的左室舒张功能障碍 内皮NO

13、X2增强心肌炎性细胞浸润 NOX2增强内皮激活和白细胞-内皮相互作用 炎症细胞NOX2对于AngII诱导的心脏纤维化并不是必需的 NOX2促进内皮-间充质转换(EMT) 内皮细胞对成纤维细胞的旁分泌作用补充图9选题意义AWT-BMNox2KO-BM实验动物：WT小鼠（左）骨髓移植小鼠（BMT）Nox2基因敲除小鼠（KO）取材：左心室组织实验方法：流式细胞学检测指标：ROS24- PMA +PMA补充图9选题意义BC实验细胞：WT小鼠（左）骨髓移植小鼠（BMT）Nox2基因敲除小鼠（KO）实验试剂：AngII(1.1mg/kg/day）取材：左心室组织实验方法：免疫组织化学检测指标：VCAM12

14、5补充图10选题意义WT BM WTTG BM TGKO BM WTWT BM TGWT BM KOTG BM WT实验动物：WT小鼠（左）骨髓移植小鼠（BMT）Nox2基因敲除小鼠（KO）实验试剂：AngII(1.1mg/kg/day）取材：左心室组织实验方法：免疫组织化学检测指标：纤维化26实验结果（7） 内皮NOX2过表达对AngII所致高血压和心脏肥厚的影响 内皮NOX2过表达增强AngII诱导的心脏纤维化 NOX2-TG内皮细胞收缩功能保留的左室舒张功能障碍 内皮NOX2增强心肌炎性细胞浸润 NOX2增强内皮激活和白细胞-内皮相互作用 炎症细胞NOX2对于AngII诱导的心脏纤维化并

15、不是必需的 NOX2促进内皮-间充质转换(EMT) 内皮细胞对成纤维细胞的旁分泌作用图3选题意义实验动物：WT小鼠；Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：AngII（1.1mg/kg/d，2w）取材：左心室组织实验方法：蛋白印迹、免疫荧光检测指标：CD31SMACollActin28图3选题意义实验动物：WT小鼠；Nox2-TG小鼠实验试剂(微量泵)：AngII（1.1mg/kg/d，2w）取材：左心室组织实验方法：免疫荧光检测指标：CD31SMA29图4选题意义实验细胞：内皮细胞实验试剂(微量泵)：AngII(100 nmol/L)、-gal、Nox-2(MOI=20)腺病毒取材：左心室组织

16、实验方法：蛋白印迹、免疫荧光检测指标：CD31 CD144SMA FSP1Nox230补充图11选题意义实验细胞：内皮细胞实验试剂(微量泵)：AngII(100 nmol/L)、-gal、Nox-2(MOI=20)腺病毒取材：内皮细胞实验方法：激光共聚焦检测指标：CD144SMA 31实验结果（8） 内皮NOX2过表达对AngII所致高血压和心脏肥厚的影响 内皮NOX2过表达增强AngII诱导的心脏纤维化 NOX2-TG内皮细胞收缩功能保留的左室舒张功能障碍 内皮NOX2增强心肌炎性细胞浸润 NOX2增强内皮激活和白细胞-内皮相互作用 炎症细胞NOX2对于AngII诱导的心脏纤维化并不是必需的

17、 NOX2促进内皮-间充质转换(EMT) 内皮细胞对成纤维细胞的旁分泌作用补充图12选题意义实验细胞：内皮细胞纤维细胞实验试剂：AngII(100 nmol/L)、-gal、Nox-2(MOI=20)腺病毒取材：共培养细胞实验方法：蛋白印迹检测指标：mRNA-胶原1、SMA蛋白-SMA、SM22、GADPH33讨论 NOX2过表达的小鼠模型8中内皮细胞NOX2蛋白的2倍增加没有基础效应，但增强了血管紧张素刺激的NOX2活性的增加。 在本研究中，我们发现血管紧张素诱导的内皮细胞NOX2激活 （a）促进心肌纤维化的发展，而不是心肌细胞肥大，并导致左室舒张功能不全，收缩功能保持； （b） 通过增加血

18、管内皮细胞VCAM-1的表达（即内皮激活）促进心肌炎症细胞浸润，尽管炎症细胞中的NOX2对促纤维化作用是可有可无的； （c）增强导致心肌纤维化的EMT。 总之，这些数据表明，在肾素-血管紧张素系统激活的病理环境中，NOX2驱动的内皮功能障碍和激活可能是促进心肌纤维化和左室舒张功能障碍的重要机制。 34讨论内皮心肌细胞串扰 心肌内皮细胞与心肌细胞间的串扰在正常心脏发育过程中起着重要作用。3，4心肌内皮细胞也通过一氧化氮、内皮素等旁分泌因子影响成年心脏的收缩功能。2心肌细胞与心肌微血管的相互信号传导被发现在慢性压力超负荷期间很重要。 例如，通过neuregulin1-ErbB2轴从EC向心肌细胞发

19、送信号促进压力超负荷时心肌细胞存活15和慢性超负荷心脏中心肌细胞释放的血管生成因子调节心肌毛细血管密度11，16。 虽然这些研究支持内皮功能障碍可能影响心肌细胞生长、存活和收缩功能，但对应激下心脏纤维化的影响尚不清楚。 35讨论内皮细胞NOX2的促炎作用 在此，我们证明内皮功能障碍对心肌纤维化的发展有着深刻的ROS依赖性影响，与心肌细胞肥大无关。 这些作用的一个潜在机制可能是活化内皮细胞的促炎症特性。 健康内皮细胞具有抗炎和抗血栓作用，但在肾素-血管紧张素系统激活等病理环境中，内皮细胞被激活并促进与循环炎性细胞的相互作用。17 以前的研究表明，在振荡剪切应力作用下NOX2参与细胞因子和血管紧张

20、素诱导的内皮细胞活化和内皮细胞粘附分子的表达，如VCAM-118,19和增强的单核细胞与内皮细胞的结合。20 这些结果清楚地表明，血管紧张素诱导的内皮细胞NOX2激活增强了体内心脏的炎症反应。 其他细胞类型（如血管平滑肌细胞、周细胞）是否也参与其中是一个未知。36讨论内皮细胞NOX2的促炎作用 除EC外，NOX2在炎症细胞中含量丰富，在炎症细胞中有助于氧化应激，例如动脉粥样硬化。21炎症细胞中的NOX2激活与血管紧张素诱导的血管肥大有关。22因此，浸润性炎症细胞（以及内皮细胞）中的NOX2激活可能在心肌纤维化的发展中起重要作用。 在炎症细胞NOX2活化中，我们构建了含有NOX2活性细胞或缺失细

21、胞的嵌合体小鼠。 这一系列的研究表明，NOX2在浸润性炎性细胞中的激活对血管紧张素诱导的纤维化的发展是可有可无的，而NOX2在受体心肌细胞中的激活是促进促纤维化作用的关键。 这一结果表明，尽管NOX2可能对炎症细胞的某些功能（如吞噬功能、动脉粥样硬化中LDL的氧化21很重要，但它并非对所有功能都是必需的，在AngII诱导的心脏病理中是可有可无的。37讨论EMT的作用 内皮功能障碍促进心肌纤维化的另一个机制是EMT。 上皮细胞和内皮细胞向间充质细胞表型的转变在心脏发育中具有重要意义。 在一项具有里程碑意义的研究中，Zeissberg等人14表明，在慢性压力超负荷期间，EMT对病理性心脏纤维化有显著贡献。 内皮素-1的EC生成与糖尿病心脏的EMT有关。23 我们发现与野生型相比，慢性AngII后TG心脏的EMT显著增加。 更确切的证据表明，内皮细胞NOX2促进EMT，NOX2显著促进血管内皮细胞向成纤维细胞表型的转变。 这些结果有力地表明，NO