分子生物学研究方法

1、关于分子生物学研究方法1现在学习的是第一页，共114页分子生物学研究法分子生物学研究法专题一：序列已知基因的克隆策略专题一：序列已知基因的克隆策略专题二：序列未知基因的克隆策略专题二：序列未知基因的克隆策略专题三：基因表达研究方法专题三：基因表达研究方法专题四：基因功能研究方法专题四：基因功能研究方法专题五：分子杂交技术专题五：分子杂交技术专题六：蛋白质、核酸相互作用技术专题六：蛋白质、核酸相互作用技术2现在学习的是第二页，共114页基因克隆（基因克隆（gene cloning）n经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程，通常是将单个基因导入宿主细过程，通常是将单个

2、基因导入宿主细胞中复制而成。胞中复制而成。3现在学习的是第三页，共114页4现在学习的是第四页，共114页基因克隆的五个步骤基因克隆的五个步骤分、切、连、转、选5现在学习的是第五页，共114页基因克隆需要什么？基因克隆需要什么？n目的基因目的基因n载体载体n宿主宿主n基因操作方法基因操作方法6现在学习的是第六页，共114页基因克隆基因克隆n目的基因序列已知目的基因序列已知n目的基因序列未知目的基因序列未知7现在学习的是第七页，共114页专题一：序列已知基因的克隆策略专题一：序列已知基因的克隆策略n5.1 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术n5.2 载体的发现及其应用载体的发现及其应用n5.3

3、 工具酶的发现和应用工具酶的发现和应用n5.4 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖n5.5 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术8现在学习的是第八页，共114页5.1 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术nPolymerase chain reaction (PCR) was developed in 1983 by Kary Mullis.nIn 1993, Mullis was awarded the Nobel Prize in Chemistry along with Michael Smith for his work on PCR.nPCR amplifies DN

4、As by repeated rounds of DNA replication in vitro.9现在学习的是第九页，共114页PCR的原理的原理n是在是在模板模板DNA、引物引物和和4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于存在的条件下，依赖于DNA聚合酶聚合酶的酶的酶促合反应，将待扩增的促合反应，将待扩增的DNA片段与其两片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变高温变性性低温退火低温退火引物延伸引物延伸”三步反三步反应的多次循环，使应的多次循环，使DNA片段在数量上呈片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量

5、的特定基因片段。需的大量的特定基因片段。10现在学习的是第十页，共114页11现在学习的是第十一页，共114页1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍12现在学习的是第十二页，共114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋

6、DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA9513现在学习的是第十三页，共114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点9550引物1引物2DNA引物14现在学习的是第十四页，共114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶15现在学习的是第十五页，共114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束95第2轮开始16现在学习的是第十六页，共114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaq17现在学

7、习的是第十七页，共114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束18现在学习的是第十八页，共114页PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点19现在学习的是第十九页，共114页PCR的原理示意图的原理示意图20现在学习的是第二十页，共114页聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 21现在学习的是第二十一页，共114页PCR指数扩增时循指数扩增时循环次数与环次数与DNA产物产物数量的比较数量的比较22现在学习的是第二十二页，共114页PCRPCR过程的过程的“三个步骤三个步骤”n变性变性（90-98）：双链）：双链DNA模板在热作

8、用模板在热作用下，下， 氢键断裂，形成单链氢键断裂，形成单链DNA 。n退火退火（25-65）：系统温度降低，引物与）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。模板结合，形成局部双链。 n延伸延伸（70-75）： 在在Taq酶酶的作用下，以的作用下，以dNTP为原料，从引物的为原料，从引物的5端端3端延伸，合成与端延伸，合成与模板互补的模板互补的DNA链链 。23现在学习的是第二十三页，共114页PCRPCR反应程序反应程序n95 5 minn95 30 Sn55 30 Sn72 1 minn72 10 minn43030个循环个循环24现在学习的是第二十四页，共114页PCRPCR

9、反应体系的反应体系的“五个要素五个要素”n模板模板n引物引物ndNTPn缓冲液（其中需要缓冲液（其中需要Mg2+）nDNA聚合酶聚合酶25现在学习的是第二十五页，共114页PCR反应体系反应体系10扩增缓冲液扩增缓冲液10LMg2+1.5mmol/L4种种dNTP混合物混合物200mol/L引物引物110100pmol 引物引物210100pmol模板模板DNA0.12gTaq DNA聚合酶聚合酶2.5 加双或三蒸水加双或三蒸水100 L26现在学习的是第二十六页，共114页DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase）nTaq DNA polymerase，1976年从粞热水生菌年从粞

10、热水生菌（Thermus aquaticus）分离，耐高温，具有）分离，耐高温，具有5 -3外外切酶活性，切酶活性，不具有不具有3 -5外切酶活性外切酶活性，PCR产物具有产物具有3突出的单突出的单A核苷酸尾核苷酸尾。nPfu DNA polymerase ，从火球菌（，从火球菌（Pyrococcus furiosis）分离，耐高温，不具有）分离，耐高温，不具有5-3外切酶活性，外切酶活性，具有具有3-5外切酶活性外切酶活性，PCR产物为平末端产物为平末端。27现在学习的是第二十七页，共114页模板（模板（Template）n单、双链单、双链DNA均可。均可。n不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有

11、蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶聚合酶抑制剂、抑制剂、DNA结合蛋白类。结合蛋白类。n模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。n可以是复杂样品。可以是复杂样品。28现在学习的是第二十八页，共114页引物（引物（primers)n引物是人工合成的两引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域个引物与感兴趣区域一端的一条一端的一条DNA模板模板链互补，另一个引物链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端与感兴趣区域另一端的另一条的另一条DNA模板链模板链互补。互补。3355Sense primerAntisense primer29现在学习的是

12、第二十九页，共114页 引物设计原则引物设计原则30现在学习的是第三十页，共114页331现在学习的是第三十一页，共114页引物设计软件引物设计软件nPrimer Premier 5.0 nOligonFPCRnPrimer-Blast32现在学习的是第三十二页，共114页PCR反应的特点反应的特点n特异性强特异性强n灵敏度高灵敏度高n简便、快速简便、快速n对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低33现在学习的是第三十三页，共114页PCRPCR的应用的应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现

13、场标本分析 肿瘤各种肿瘤检测 其他34现在学习的是第三十四页，共114页PCR的种类的种类n基因组基因组PCRPCRn反（逆）转录反（逆）转录PCRPCRn实时定量实时定量PCRPCRn扩增已知序列两侧扩增已知序列两侧DNADNA的的PCRPCRn致突变致突变PCRPCRn扩增未知扩增未知DNADNA序列的序列的PCRPCRn重组重组PCRPCR推荐书目推荐书目PCR最新技术原理、方法及应用最新技术原理、方法及应用，黄留玉主编，黄留玉主编 35现在学习的是第三十五页，共114页载体主要是小分子量的复制子如：病毒、噬菌体、质粒。载体主要是小分子量的复制子如：病毒、噬菌体、质粒。1972年，美国年

14、，美国Stanford大学的大学的P. Berg 等首次成功地实现了等首次成功地实现了DNA的的体外重组；体外重组；5.2 载体的发现及其应用载体的发现及其应用36现在学习的是第三十六页，共114页载体（载体（vector）p是携带是携带靶靶DNA（目的（目的DNA）片段进入）片段进入宿宿主细胞主细胞进行进行扩增和表达扩增和表达的运载工具。的运载工具。37现在学习的是第三十七页，共114页载体的功能载体的功能n运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞n为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因提供复制能力或整合能力n为外源基因的扩增或表达提供必要的条件为外源基因的扩增或表达提供

15、必要的条件38现在学习的是第三十八页，共114页39General features of a They contain an origin of replication and can autonomously replicating DNA independent of hosts genome.Contains at least one selective marker, which allows host cells containing the vector to be selected amongst those which do not. Contains a multiple

16、cloning site (MCS) to be cut by restriction enzymes for DNA manipulation. 1. Easily to be isolated from the host cell. Most are circular, some are linear (e.g. YAC vector).39现在学习的是第三十九页，共114页用于基因克隆的载体用于基因克隆的载体n质粒载体质粒载体：10kb以下以下n噬菌体载体噬菌体载体： 20kbn黏粒（黏粒（cosmid）噬菌体）噬菌体：50kbn人工染色体人工染色体：200kb-1Mbn土壤农杆菌土壤农

17、杆菌Ti质粒质粒：植物细胞，：植物细胞，200kb40现在学习的是第四十页，共114页质粒质粒pPlasmids: small, extrachromosomal circular molecules, from 2 to 200 kb in size, which exist in multiple copies within the host cells.p严紧型质粒严紧型质粒 拷贝数拷贝数1-2/cellp松弛型质粒松弛型质粒 拷贝数拷贝数10/cell41现在学习的是第四十一页，共114页克隆载体和表达载体克隆载体和表达载体n克隆载体（克隆载体（Cloning Vector） 可携带插

18、入的目的可携带插入的目的DNA进入宿主细胞内并进入宿主细胞内并能自我复制的能自我复制的DNA分子。此种分子。此种DNA分子含有能分子含有能在宿主中复制的位点和便于筛选的遗传标志。在宿主中复制的位点和便于筛选的遗传标志。 n表达载体（表达载体（Expression Vector） 在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能、终止子等），是目的基因能够表达的载体。够表达的载体。 42现在学习的是第四十二页，共114页43现在学习的是第四十三页，共114页44现在学习的是第四十四页，共114页n限制性内切酶（限

19、制性内切酶（Restriction endonuclease）nDNA连接酶（连接酶（DNA ligase）n反转录酶（反转录酶（Reverse transcripatase）n碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase）nDNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase）5.3 工具酶的发现和应用工具酶的发现和应用45现在学习的是第四十五页，共114页1970年，年，Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II， 1972年，年，Boyer等相继发现了等相继发现了EcoR I 一类重要的限制性内切酶。一类重要的限制性内切酶。 1

20、）限制性内切酶的发现和应用）限制性内切酶的发现和应用46现在学习的是第四十六页，共114页限制性内切酶限制性内切酶（restriction endonuclease）n定义定义：能够识别：能够识别DNA上的特定碱基序列上的特定碱基序列并从这个位点切开并从这个位点切开DNA分子。分子。n限制性外切酶限制性外切酶：n是一类能从多核苷酸链的一端开始按序是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解催化水解3, 5-磷酸二酯键，降解核苷磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸。苷酸。47现在学习的是第四十七页，共114页48现在学习的是第四十八页，共11

21、4页nWhy being used?-To break large DNA molecules into manageable fragments.Nucleic acids-Restriction digestionNucleic acids-Restriction digestionby the of specific sequences.49现在学习的是第四十九页，共114页n来源来源：细菌的限制修饰系统。：细菌的限制修饰系统。n命名命名：微生物属名的第一个字母和种名：微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌的前两个字母组成，第四个字母表示菌株株(品系品系)。限制性

22、内切酶限制性内切酶50现在学习的是第五十页，共114页51the 1st such enzyme foundEscherichia coli Species categoryR13strainHow to name a restriction endonuclease?EcoRI51现在学习的是第五十一页，共114页限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类pI型限制酶型限制酶 属于复合功能酶，兼有修饰和切割属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性，两种特性，随机切割。随机切割。pII型限制酶型限制酶 识别序列一般为识别序列一般为4-6个碱基对个碱基对，通常是反，通常是反转重转重复顺序复

23、顺序(回文结构回文结构)，具有，具有180的旋转对称性，的旋转对称性，特异特异性切割性切割。pIII型限制酶型限制酶 在在DNA链上有特异位点切割，其切割位点在识链上有特异位点切割，其切割位点在识别位点以外。别位点以外。52现在学习的是第五十二页，共114页53nRE used in molecular biology typically recognize (识别识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构回文结构), and cut (切割切割) at a defined sequence wit

24、hin those sequences. e.g. EcoRI5.GAATTC.3 .CTTAAG.53现在学习的是第五十三页，共114页54The random occurrence of the hexameric (六核苷酸的六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)What are the frequencies if the recognition sequences are four (tetrameric) and eight (octameric) nucleotides? How to estimate the frequency of the RE

25、 in a DNA molecule or genome?54现在学习的是第五十四页，共114页5555现在学习的是第五十五页，共114页56(1) Restriction enzymes differ in the : target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in , and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in : blunt/flush ends (平末端平末端), sticky/staggered ends (粘性末端粘性末端

26、).(4) Restriction enzymes differ in the .Characteristics of RE56现在学习的是第五十六页，共114页57sticky ends(粘性末端粘性末端) blunt ends(平末端平末端) Fig 2 Recognition sequences and cut sites of various endonucleases57现在学习的是第五十七页，共114页同裂酶（isoschizomer）：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。少数有特殊性质的少数有特殊性质的IIII型酶型酶58现在学习的是第五十八页，共114页同尾酶（isocauda

27、rner)：作用后能产生相同的粘性末端。59现在学习的是第五十九页，共114页几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端内切酶所识别的序列及其酶切末端60现在学习的是第六十页，共114页1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连接连接酶，特别是酶，特别是1970年年H.G.Khorana等发现的等发现的T4 DNA连接连接酶具有更高的连接活性。酶具有更高的连接活性。2）DNA连接酶的发现和应用连接酶的发现和应用61现在学习的是第六十一页，共114页 DNA连接酶连接酶（DNA ligase）n一种封闭一种封闭DNA链上缺口链上缺口的酶，借助的

28、酶，借助ATP或或NAD水解提供的能量催化水解提供的能量催化DNA链的链的5-PO4与另一与另一DNA链的链的3-OH生成生成磷磷酸二酯键酸二酯键。nEcoli DNA连接酶连接酶 nT4 DNA连接酶连接酶 62现在学习的是第六十二页，共114页连接反应体系连接反应体系n三蒸水三蒸水 0.5 Ln目的基因目的基因 6 Ln载体载体 2 Ln缓冲液缓冲液 1 Ln连接酶连接酶 0.5Ln温度温度 4, 1663现在学习的是第六十三页，共114页nDNA连接酶只能作用于连接酶只能作用于双链双链DNA分子分子而不能将二而不能将二个单链个单链DNA分子连接。分子连接。nT4噬菌体噬菌体DNA连接酶可

29、连接连接酶可连接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链和双链DNA粘性末端或平头末粘性末端或平头末端。端。 n大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端连接酶不能连接平末端DNA分子。分子。nDNA重组技术常用重组技术常用T4噬菌体噬菌体DNA连接酶。连接酶。注意：64现在学习的是第六十四页，共114页5.4 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖n细菌转化细菌转化（transformation），是指一），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过而导致性状特征发生遗传改变的过程。程。n提供转化

30、提供转化DNA的菌株叫作的菌株叫作供体菌株供体菌株。n接受转化接受转化DNA的细菌菌株则被称为的细菌菌株则被称为受体受体菌株菌株。65现在学习的是第六十五页，共114页为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取理，增加其获取DNA的能力。经过这种处理的能力。经过这种处理的细胞被称作的细胞被称作感受态细胞感受态细胞（competent cells）。）。感受态细胞感受态细胞（competent cells）66现在学习的是第六十六页，共114页 CaCl2法法大肠杆菌培养至大肠杆菌培养至OD=0.2-0.80预处理的低渗预处理的低渗CaCl2-甘油

31、溶液甘油溶液42 90s或或37 5min转化效率：转化效率：51062107个个/g DNA。 67现在学习的是第六十七页，共114页电击法电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细胞质。进入细胞质。将生长至对数中期的将生长至对数中期的E. coli菌液冷却至菌液冷却至4后离心，洗菌后用后离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将的甘油悬浮，将高密度菌液（高密度菌液（21010/ml）置于特制的）置于特制的电击杯中进行

32、电击。电击杯中进行电击。68现在学习的是第六十八页，共114页电穿孔仪电穿孔仪电击杯电击杯69现在学习的是第六十九页，共114页细菌转化及蓝白斑筛选细菌转化及蓝白斑筛选（Blue-white screening）70现在学习的是第七十页，共114页5.5 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术p 一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率电泳的迁移率，它与电，它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成场强度和电泳分子本身所

33、携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。正比，与片段大小成反比。71现在学习的是第七十一页，共114页核酸电泳的核酸电泳的用途用途n确定确定DNA或或RNA的大小的大小n纯化纯化DNA或或RNA片段片段n分离分离DNA或或RNA片段片段72现在学习的是第七十二页，共114页Fig 3: DNA is separated by gel electrophoresislargemoderate small73现在学习的是第七十三页，共114页741. DNA and RNA molecules are negatively charged, thus move in the gel matrix

34、(胶支持物胶支持物) toward the positive pole (正电极正电极).2. Linear DNA molecules are separated according to sizes. The large DNA molecules move slower than the small molecules.3. The mobility of circular DNA molecules is affected by their topological structures. The mobility of the same molecular weight DNA mol

35、ecule with different shapes is: supercoiled (超螺旋超螺旋) linear (线性线性) nicked or relaxed (缺缺刻或松散刻或松散) DNA gel mobility (DNA在胶上的迁移性在胶上的迁移性)74现在学习的是第七十四页，共114页75Gel matrix (胶支持物胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through. Gel matrix (胶支持物胶支持物)75

36、现在学习的是第七十五页，共114页76Agarose (琼脂糖琼脂糖): a much less resolving power than polyacrylamide, (1)but can separate DNA molecules of up to tens of kb1 kb0.5 kb2 kb3 kb4 kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭溴化乙锭)76现在学习的是第七十六页，共114页77Polyacrylamide

37、(聚丙稀酰聚丙稀酰胺胺): has high resolving capability, and can resolve DNA that differ from each other as little as a single base pair/nucleotide.(1)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a few hundred bp).77现在学习的是第七十七页，共114页凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂

38、糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50178现在学习的是第七十八页，共114页溴化乙锭溴化乙锭染料的染料的化学结构及其对化学结构及其对DNA分子的插入分子的插入作用。由于插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳中中DNA的条带便的条带便呈现出橘黄色荧呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。光，易于鉴定。79现在学习的是第七十九页，共114页常用缓冲液常用缓冲液nTAE：Tri

39、s-乙酸乙酸缓冲容量小，溶解度大，易储存，可用于核酸纯化。缓冲容量小，溶解度大，易储存，可用于核酸纯化。nTBE：Tris-硼酸硼酸缓冲容量大，溶解度小，不易储存，不用于核酸纯化。缓冲容量大，溶解度小，不易储存，不用于核酸纯化。nTPE：Tris-磷酸磷酸缓冲容量大，不可用于核酸纯化。缓冲容量大，不可用于核酸纯化。80现在学习的是第八十页，共114页n5.1 聚合酶链式聚合酶链式反应技术反应技术n5.2 载体载体的发现及其应用的发现及其应用n5.3 工具酶工具酶的发现和应用的发现和应用n5.4 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖n5.5 核酸凝胶电泳技术核酸凝胶电泳技术专题

40、一：序列已知基因的克隆策略专题一：序列已知基因的克隆策略81现在学习的是第八十一页，共114页部分考研题部分考研题nBlue-white screening（武汉大学2008）nVector（上海交大2004，浙江大学2004、2006）n聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）（北京师范2008）n限制性酶图谱（华南理工2005）n黏性末端（南京师范2006）n同裂酶（南京师范2006）n设计PCR引物的主要原则是什么？（中科院2007）n描述PCR技术原理（浙江大学2004、2006）n分子生物学研究中经常用各种载体进行研究工作，试问有哪些不同大小类型的载体，各

41、自的主要特点是什么？（武汉大学2005、2009）n碱法质粒提取用到的溶液成分的作用时什么？操作中有哪些注意事项？（北京大学2010）82现在学习的是第八十二页，共114页思考题思考题n请设计一组试验来请设计一组试验来克隆一个你所感兴克隆一个你所感兴趣的人类基因；趣的人类基因；并对基因产物大量表并对基因产物大量表达与纯化；达与纯化；然后研究该基因的生物学然后研究该基因的生物学功能。（武汉大学功能。（武汉大学2005）83现在学习的是第八十三页，共114页专题二：序列未知基因的克隆策略专题二：序列未知基因的克隆策略5.6 构建基因组文库构建基因组文库5.7 构建构建cDNA文库文库5.8 文库筛

42、选文库筛选5.9 RACE84现在学习的是第八十四页，共114页85Libraries of DNA molecules can be created by cloning (Genomic library and cDNA library) (DNA文库文库) is a population of identical vectors that each contains a different DNA insert. (基因组文库基因组文库) : the DNA inserts in a DNA library is derived from restriction digestion or

43、 physical shearing of the genomic DNA. (cDNA文库文库) : the DNA inserts in a DNA library is converted from the mRNAs of a tissue, a cell type or an organism. cDNA stands for the DNA copied from mRNA. 85现在学习的是第八十五页，共114页5.6 基因组基因组DNA文库构建文库构建 把某种生物的基因组把某种生物的基因组DNADNA切成适当大小，分切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克别与载体组

44、合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有隆。汇集包含基因组中所有DNADNA序列的克隆序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为样的克隆片段的总汇，称为基因组基因组DNADNA文库文库。86现在学习的是第八十六页，共114页Clark和Carbon于1975年提出公式： N=ln(1-p) / ln(1-f)式中：N表示一个基因组文库所应该包含的重组克隆数目；p表示所期望的靶基因在文库中出现的概率；f表示重组克隆平均插入片段的长度与基因组DNA总长的比值。87现在学习的是第八十七页，共114页构建基因组文库最常用的是构建

45、基因组文库最常用的是噬菌体载体（克隆能力约噬菌体载体（克隆能力约1520kb）和）和限制性内切酶部分消化法限制性内切酶部分消化法。88现在学习的是第八十八页，共114页5.7 cDNA文库的构建文库的构建1 总总RNA的提取的提取2 mRNA的纯化的纯化3 cDNA的合成的合成4 cDNA文库的构建文库的构建cDNA文库的文库的构建过程构建过程89现在学习的是第八十九页，共114页细胞中的总细胞中的总RNA包括包括mRNA，rRNA ，tRNA以及一以及一些小些小RNA（sRNA）。）。一个典型的动物细胞约含一个典型的动物细胞约含10-5g RNA，其中：，其中：80%-85%为为rRNA15

46、%-20%为为tRNA及及sRNAmRNA约占总约占总RNA 的的1%-5%1 总总RNA的提取的提取90现在学习的是第九十页，共114页总总RNA的抽提方法的抽提方法p异硫氰酸胍异硫氰酸胍- -苯酚抽提法苯酚抽提法(TRIzol(TRIzol法法) )p硅胶膜纯化柱硅胶膜纯化柱91现在学习的是第九十一页，共114页RNA的浓度和纯度可以通过测定其的浓度和纯度可以通过测定其OD260和和OD280来判断。来判断。OD260为为1时相当于浓度为时相当于浓度为40g/ml，而，而OD260/OD280的比值如果在的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提之间，表示所提取的取的RNA纯度较好，如果样品

47、中有蛋白质或酚污纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则染，则OD260/ OD280的比值将明显低于的比值将明显低于1.8。92现在学习的是第九十二页，共114页RNA的琼脂糖电泳检测变性条件下，甲醛是最常用的变性剂，也可用加热或尿素等变性剂。28S和18S亮度2:1rRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是28S和和18S特征性条特征性条带是电泳鉴定总带是电泳鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。纯度和完整性的重要参数。93现在学习的是第九十三页，共114页2 mRNA的纯化的纯化 5端帽子结构和端帽子结构和3端的端的polyA尾巴尾巴 寡聚寡聚(d

48、T)-纤维素柱色谱法纤维素柱色谱法94现在学习的是第九十四页，共114页PolyAT Tract mRNA的分离纯化过程简图。95现在学习的是第九十五页，共114页3 cDNA的合成的合成96现在学习的是第九十六页，共114页cDNA合成过程示意图合成过程示意图反转录酶DNA聚合酶97现在学习的是第九十七页，共114页定向定向cDNA合成及分子修饰合成及分子修饰98现在学习的是第九十八页，共114页 cDNA：0.5-8 kb常用常用Uni-zap XR（一种（一种噬菌粒载体）做载体，噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选

49、的便利，可容纳斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，插入片段，含有含有pBluescript载体的全部序列。载体的全部序列。重组后可通过体内剪切反应（重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将将cDNA插入片段转移到质粒系统中进行筛选、插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。克隆和序列分析。 4 cDNA文库的构建文库的构建99现在学习的是第九十九页，共114页cDNA文库构建的优点：文库构建的优点：1）无内含子、片段短、易操作。）无内含子、片段短、易操作。2） cDNA文库仅包含正在表达的基因，且某特定文库仅包含正在表达的基因，且某特定基因在基因在mRNA中的拷贝数在基因组中的拷贝数。中的拷贝数在基因组中的拷贝数。3）由于成熟）由于成熟mRNA是转译成蛋白质的直接模板，是转译成蛋白质的直接模板，可从可从cDNA序列中直接找到编码区，推测蛋白质序列中直接找到编码区，推测蛋白质的氨基酸顺序及其性质、功能等。的氨基酸顺序及其性质、功能等。100现在学习的是第一百页，共114页5.8 基因文库的筛选基因文库的筛选p基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子分子的特定克隆的过程。的特定克隆的过程。p筛选的方法有很多种，如筛