生物物质分离与纯化

1、9.1概述概述生物物质分离（生物物质分离（Bioseparation)是生物化工的一个重要的组是生物化工的一个重要的组成部分，常称之为下游过程（成部分，常称之为下游过程（Downstream processing）。）。其与上中游同样重要，在某种程度上，甚至大于它们。前者解其与上中游同样重要，在某种程度上，甚至大于它们。前者解决丰产问题，而下游分离过程解决丰收问题。决丰产问题，而下游分离过程解决丰收问题。生物物质的分离区别于其它物质的分离在于生物物质的分离区别于其它物质的分离在于A: 目的产物浓度很低。因此耗能、费用增高和产物的价格也目的产物浓度很低。因此耗能、费用增高和产物的价格也相应的增加

2、。相应的增加。B: 生物物质易受环境因素如温度、生物物质易受环境因素如温度、pH、金属离子和微生物等、金属离子和微生物等的影响，增加了分离的难度。的影响，增加了分离的难度。C: 对终产品的质量要求极高。特别是医药产品或作为生物制对终产品的质量要求极高。特别是医药产品或作为生物制剂的产品。剂的产品。因此它是一项十分艰巨和耗资巨大的工作。对于传统发酵工业因此它是一项十分艰巨和耗资巨大的工作。对于传统发酵工业来说，（如抗生素、乙醇、柠檬酸等生产来说，（如抗生素、乙醇、柠檬酸等生产), 分离和提纯部分离和提纯部分费用占总投资的分费用占总投资的60%，而对基因工程菌的发酵占到，而对基因工程菌的发酵占到9

3、0%，对其下功夫研究和设计是一项十分重要和有意义的，对其下功夫研究和设计是一项十分重要和有意义的工作。工作。表表 9-1 9-1 几种典型产品发酵液的浓度几种典型产品发酵液的浓度发酵液发酵液细胞分离细胞分离提取、分离提取、分离纯化、精制纯化、精制产物产物胞外产物胞外产物胞内产物胞内产物离心或过滤离心或过滤细胞破碎细胞破碎整体细胞萃取整体细胞萃取离心或过滤离心或过滤离心或过滤离心或过滤干燥干燥含产物的清液含产物的清液废物废物离心或过滤离心或过滤干燥干燥产物产物板框过滤机平板过滤机真空旋转过滤机管式过滤机蜂窝式过滤机深层过滤机主要离心设备主要离心设备高速冷冻离心机碟片式离心机管式离心机倾析式离心机

4、框式离心机Disc-CentrifugesSolids-retainingcentrifugeNozzle with pressurizeddischarge of concentrateNozzle with peripheralnozzlesPeriodicallysolids-ejectingcentrifugePeriodicallysolids-ejectingcentrifuge withaxial channelsCentrifuges三、细胞破碎三、细胞破碎破碎方法破碎方法机械方法机械方法非机械方法非机械方法固体剪切力固体剪切力流体剪切力流体剪切力干燥处理干燥处理溶胞处理溶胞处

5、理球球磨磨法法压压榨榨法法高高压压匀匀浆浆超超声声法法酶酶溶溶法法化化学学法法物物理理法法压力破碎法：利用压力释放时的固液剪切进行破碎。操作简单，可连续操作，压力破碎法：利用压力释放时的固液剪切进行破碎。操作简单，可连续操作，适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，同时破碎率低。适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，同时破碎率低。珠磨破碎法：利用固体的剪切进行破碎。操作简单，可连续珠磨破碎法：利用固体的剪切进行破碎。操作简单，可连续/批式操作，适批式操作，适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，不同细胞的破碎条件差异大。用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，不同细胞的破碎条件差异大。超声破碎

6、法：利用超声波形成空穴产生压力冲击进行破碎。操作简单，可连超声破碎法：利用超声波形成空穴产生压力冲击进行破碎。操作简单，可连续续/批式操作，但操作会产生热，需有冷却系统，破碎率低，适应性差。批式操作，但操作会产生热，需有冷却系统，破碎率低，适应性差。渗透压法：利用渗透压的突变，造成细胞内压力差而引起细胞的破碎。破碎渗透压法：利用渗透压的突变，造成细胞内压力差而引起细胞的破碎。破碎率低，产物释放较好，操作复杂，条件要求苛刻，适用于少量样品的处理，率低，产物释放较好，操作复杂，条件要求苛刻，适用于少量样品的处理，费用高。费用高。有机溶剂法：利用有机溶剂或表面活性剂改变细胞壁有机溶剂法：利用有机溶剂

7、或表面活性剂改变细胞壁/膜的通透性，使包内膜的通透性，使包内产物释放的方法。该法简单，内含物释放少，产物较纯，可规模化生产，但产物释放的方法。该法简单，内含物释放少，产物较纯，可规模化生产，但适用面窄。适用面窄。碱或酶处理法：利用碱或酶的处理是细胞壁或膜破坏，产物得以释放。该法碱或酶处理法：利用碱或酶的处理是细胞壁或膜破坏，产物得以释放。该法简单，可规模化生产，但适用面窄。简单，可规模化生产，但适用面窄。选择破碎法的依据：选择破碎法的依据：细胞的处理量：细胞的处理量： 大规模，则一般采用机械法，而实验室规模的，则选择非机械法。大规模，则一般采用机械法，而实验室规模的，则选择非机械法。细胞壁的强

8、度和结构：细胞壁的强度和结构：酵母和真菌，含有纤维素和几丁质，比细菌的胞壁强度大，应选择酵母和真菌，含有纤维素和几丁质，比细菌的胞壁强度大，应选择高压匀浆法。而对于有高度分之的微生物，会阻塞匀浆气阀而不能高压匀浆法。而对于有高度分之的微生物，会阻塞匀浆气阀而不能应用。应用。目的产物对破碎条件的敏感性：目的产物对破碎条件的敏感性：破碎程度：由于破碎会使细胞碎片细小，使固液分离困难，破碎程度：由于破碎会使细胞碎片细小，使固液分离困难，所以，适宜的操作条件是高的产物释放率，低能耗和便于后续提取所以，适宜的操作条件是高的产物释放率，低能耗和便于后续提取三个方面权衡。三个方面权衡。四、分离和纯化四、分离

9、和纯化主要任务是提高溶液中的产品的浓度，同时也取出一些杂质。传统主要任务是提高溶液中的产品的浓度，同时也取出一些杂质。传统的方法包括沉淀法、吸附法、离子交换、萃取法，另外，含有超滤、的方法包括沉淀法、吸附法、离子交换、萃取法，另外，含有超滤、反渗透，电渗析、凝胶电泳等，常用的为蒸发、萃取和吸附。反渗透，电渗析、凝胶电泳等，常用的为蒸发、萃取和吸附。1. 液体蒸发：又称浓缩，通过加热是溶液中的部分水汽化并出去，液体蒸发：又称浓缩，通过加热是溶液中的部分水汽化并出去，以提高溶液的浓度。蒸发的持续进行必须满足而个条件：其一，保以提高溶液的浓度。蒸发的持续进行必须满足而个条件：其一，保证连续的提供不断

10、汽化所需的热量，同时不断的移去二次蒸汽。证连续的提供不断汽化所需的热量，同时不断的移去二次蒸汽。2. 液液-液萃取：是一种常用的方法。应用于抗生素、有机酸、维生液萃取：是一种常用的方法。应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物的分离和提取。特别是近素、激素等发酵产物的分离和提取。特别是近20年，与其它的技术年，与其它的技术性结合产生了新的分离技术，用于提取酶、蛋白质、核酸、多肽和性结合产生了新的分离技术，用于提取酶、蛋白质、核酸、多肽和氨基酸。氨基酸。 如：反胶囊萃取（如：反胶囊萃取（reversed micelle extraction), 超临超临界萃取（界萃取（supercritic

11、al fluid extraction )和液膜萃取（和液膜萃取（liquid membrane extraction)等适合等适合DNA重组技术和遗传工程的发展重组技术和遗传工程的发展溶质在二个互不相容的溶剂的分配系数不同，溶质在二个互不相容的溶剂的分配系数不同，所造成的溶质的转移。所造成的溶质的转移。混合器和澄清器混合器和澄清器3. 双水相萃取；双水相萃取； 二种互不溶的聚合物，这两种的聚合物中的含水率很二种互不溶的聚合物，这两种的聚合物中的含水率很高，一般在高，一般在70-90%，这样就可以防止在有机相中的变性，同时这些，这样就可以防止在有机相中的变性，同时这些高聚物含有保护和稳定蛋白质

12、等生物活性物质的作用。高聚物含有保护和稳定蛋白质等生物活性物质的作用。4. 反胶团萃取；反胶团萃取； 在有机相中加入一定量的表面活性剂，形成大小为毫在有机相中加入一定量的表面活性剂，形成大小为毫微米级的微胶团。当此有机相与含有目的产物的水相形成液微米级的微胶团。当此有机相与含有目的产物的水相形成液-液萃取时，液萃取时，由于微胶团中的表面活性剂带有与水相中的蛋白质相反的电荷，而将由于微胶团中的表面活性剂带有与水相中的蛋白质相反的电荷，而将水相中的蛋白质迁移入微团内水池中，实现物质的提取。水相中的蛋白质迁移入微团内水池中，实现物质的提取。5. 超临界萃取；超临界萃取； 同样为溶剂萃取。而此方法使用

13、的溶剂是在超临界状同样为溶剂萃取。而此方法使用的溶剂是在超临界状态下的液态气体，常用的为态下的液态气体，常用的为CO2, 它具有液体的密度和气体的高扩散性，它具有液体的密度和气体的高扩散性，产品分离容易等特点。受到广泛的关注。产品分离容易等特点。受到广泛的关注。6; 固体吸附：固体吸附：是物质从液相（发酵液）到固相（吸附剂）发生物质的转移。此法是物质从液相（发酵液）到固相（吸附剂）发生物质的转移。此法用于蛋白质、核酸、氨基酸、抗生素等物质的分离和提取。用于蛋白质、核酸、氨基酸、抗生素等物质的分离和提取。按照吸附剂的作用原理：分为三大类。按照吸附剂的作用原理：分为三大类。A物理吸附：物理吸附：依

14、靠范德华力的作用。吸附剂可用活性炭、硅藻土、硅胶、分子筛依靠范德华力的作用。吸附剂可用活性炭、硅藻土、硅胶、分子筛和氧化铝等。和氧化铝等。B静电吸附：静电吸附：借助静电引力吸附物质。主要为合成的树脂。借助静电引力吸附物质。主要为合成的树脂。C: 亲和吸附：亲和吸附：在树脂上嫁接一个能与要分离的物质发生特异性反应的配基。在树脂上嫁接一个能与要分离的物质发生特异性反应的配基。五、提纯五、提纯1，层析法（，层析法（Elution Chromatography) 又称洗脱法又称洗脱法/色谱法。他们与吸色谱法。他们与吸附法本质上是相同的。但在操作过程不同。造成了结果不同。附法本质上是相同的。但在操作过程

15、不同。造成了结果不同。吸附法吸附和洗脱间断进行，收集洗脱液也为一次性、不分段。因此，只吸附法吸附和洗脱间断进行，收集洗脱液也为一次性、不分段。因此，只有浓缩而无分离。有浓缩而无分离。层析法则是吸附和洗脱同时进行，分段收集洗脱液，因此分离和浓缩同时层析法则是吸附和洗脱同时进行，分段收集洗脱液，因此分离和浓缩同时完成。完成。层析法又分为离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析层析法又分为离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析2：沉淀法：沉淀法适合大规模生产，通过采取不同的手段使发酵液中目的适合大规模生产，通过采取不同的手段使发酵液中目的物质溶解度降低，使之发生沉淀，达到分离提纯的目的。物质溶解度降低，使之发生沉淀，达到分离提纯的目的。常用等电点沉淀法、盐析法、加热沉淀法、有机溶剂沉常用等电点沉淀法、盐析法、加热沉淀法、有机溶剂沉淀法等淀法等3. 超滤法超滤法是一种半透膜，使溶液中的溶剂和小分子物质通过，而是一种半透膜，使溶液中的溶剂和小分子物质通过，而阻止截流大分子物质的方法。阻止截流大分子物质的方法。超滤区别于常规过滤主要采用了错流