第九章蛋白质组学的研究方法和进展

1、第九章蛋白质组学的研究方法和进展第一节第一节 蛋白质组学的概念及其发展史蛋白质组学的概念及其发展史一、蛋白质组学的概念一、蛋白质组学的概念 蛋白质组是澳大利亚学者蛋白质组是澳大利亚学者WilliamsWilliams和和WilkinsWilkins于于19941994年首先提出，是指年首先提出，是指“一个细胞或一个组织基因一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质组所表达的全部蛋白质”。蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞新兴科学，其目的是从整体的

2、角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 主要研究内容主要研究内容 了解某种特定的细胞、组织了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；或器官制造的蛋白质种类； 明确各种蛋白质分子是如何形明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；成类似于电路的网络的； 描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决结构上的关键部位，如与药物结合并且决

3、定其活性的部位。定其活性的部位。 功能蛋白质组学功能蛋白质组学( (functional proteomics) )的提出的提出 n功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。一生理现象相关的所有蛋白质。n介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。组学之间。 n从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。群体。 n将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的近于生命细胞的“

4、全部蛋白质全部蛋白质”的蛋白的蛋白质组图谱。质组图谱。背背 景景 基因组时代基因组时代 后基因组时代后基因组时代 研究重点的转移及其标志研究重点的转移及其标志 功能基因组学产生，其任务是解析和综合功能基因组学产生，其任务是解析和综合大量的遗传信息，阐明基因遗传信息与人类大量的遗传信息，阐明基因遗传信息与人类生命活动的关系。生命活动的关系。二、蛋白质组学的产生与发展二、蛋白质组学的产生与发展mRNAmRNA水平的基因表达研究取得进展，但水平的基因表达研究取得进展，但mRNAmRNA与蛋白质间的相关系数仅为与蛋白质间的相关系数仅为0.40.40.50.5 蛋白质自身特点难以从蛋白质自身特点难以从D

5、NADNA和和mRNAmRNA水平得水平得到解答到解答 进进 展展各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟： 19961996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心究中心 美国国立癌症研究院（美国国立癌症研究院（NCINCI）投资）投资1 0001 000万美元建万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。 NCI NCI和和FDAFDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。段的蛋白质组数据库。 英国建立三个蛋白

6、质组研究中心对已完成或英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。究。 CeleraCelera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。工作。n 1997年召开了第一次国际年召开了第一次国际“蛋白质组蛋白质组学学”会议会议n 1998年在美国旧金山召开了第二届国年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议际蛋白质组学会

7、议 n 1999年年1月在英国伦敦举行了应用蛋月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议白质组会议 我国也于我国也于1998年启动了蛋白质组学研年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会了两次全国性的蛋白质组学研讨会 2003成立了中国人类蛋白质组组成立了中国人类蛋白质组组织（织（CHHUPO），并分别于），并分别于2003年年9月、月、2004年年8月以及月以及2005年年8月召开月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，届学术大会，2004年年10月在中国北京月在中国北京召开了第

8、三届国际蛋白质组学会议。召开了第三届国际蛋白质组学会议。 n 科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划计划项目和项目和“863”计划项目计划项目；国家自然科学基金委员会也国家自然科学基金委员会也将将“蛋白质组研究蛋白质组研究”列为重点项目。列为重点项目。n我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展取得了较大的进展。 第二节第二节 蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究方法概述蛋白质组研究更为复杂和困难：蛋白质组研究更为复杂和困难： 蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质数目大大超过基因数目

9、。 蛋白质随时间和空间而变化。蛋白质随时间和空间而变化。 发展高通量、高灵敏度、高准确性发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。间内蛋白质组学研究中的主要任务。 当前主要任务 一、蛋白质组表达模式的研究方法一、蛋白质组表达模式的研究方法 最初的蛋白质组学主要是研究蛋白质组的组最初的蛋白质组学主要是研究蛋白质组的组成成分即蛋白质组表达模式成成分即蛋白质组表达模式, , 支撑技术主要有双向凝胶电泳、以质谱为代支撑技术主要有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学分析技术。表的蛋白质鉴定技术及生物

10、信息学分析技术。（一）蛋白质组研究中的样品制备 n通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。分进行蛋白质组分析。 n也可以进行样品预分级，即将细胞或组也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。进行研究。 样品预分级的主要方法样品预分级的主要方法n蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白等n蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等n蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等体、叶绿体等 样品预分级主

11、要作用样品预分级主要作用: :在于提高低丰在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度度蛋白质的上样量和检测灵敏度。（二）蛋白质组研究中的样品分离n双向凝胶电泳双向凝胶电泳two-dimensional two-dimensional electrophoresiselectrophoresis，2-DE)2-DE)：利用蛋白质的：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。离各种蛋白质的方法。原原 理理 第一向在高压电场下对蛋白质进行第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦等电聚焦(IEF), , 再在第一向垂直方向再在第一向垂直方向上进

12、行第二向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电聚丙烯酰胺凝胶电泳泳(SDS-PAGE)。 1975年首先由年首先由OFarrell等创立。等创立。特特 点点n可分离可分离10100 kD分子量的蛋白质分子量的蛋白质 n高灵敏度和高分辨率高灵敏度和高分辨率n便于计算机进行图像分析处理便于计算机进行图像分析处理 n与质谱分析匹配与质谱分析匹配 第一向第一向IEF电泳电泳 n传统传统OFarrell系统双向电泳的缺陷。系统双向电泳的缺陷。nBjellgvist等发展并完善了固相等发展并完善了固相pH梯度等电聚梯度等电聚焦技术，焦技术，Grg等成功地将之应用于双向电泳等成功地将之应用于双向电泳。固相固相

13、pHpH梯度等电聚焦的优点梯度等电聚焦的优点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。稳定的可以随意精确设定的稳定的可以随意精确设定的pH梯度。梯度。 尤其可在较窄的尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。分析，大大提高了分辨率及重复性。 第二向第二向SDS-PAGE电泳电泳 垂直板电泳垂直板电泳 水平超薄胶电泳水平超薄胶电泳 2-DE技术的缺点技术的缺点 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。白质用

14、此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。联用实现自动化。 新型非凝胶技术新型非凝胶技术 液相色谱法液相色谱法liquid chromatography，LC毛细管电泳毛细管电泳capillary electrophoresis，CEn液质联用技术（液质联用技术（LC-MS/MSLC-MS/MS） 蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入的分离，然后进入MS系统获得肽段分子系统获得肽段分子量，再通过串联量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，技术，得到部分序列信息，最

15、后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。 根据蛋白质带电性及疏水性不同，根据蛋白质带电性及疏水性不同，用用LC/LC分离多肽复合物。分离多肽复合物。 n多维多维色谱技术（色谱技术（LC/LC-MS/MS）n多维蛋白质鉴定技术多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology)新型蛋白质鉴定技术新型蛋白质鉴定技术 质谱（质谱（MSMS）法）法 基本原理：样品分子离子化后，根据离基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（子间质荷比（m/zm/z）的差异来分离并确）的差异来分离并确定样品的分子量。

16、定样品的分子量。 （三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定n基质辅助激光解吸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） n电喷雾质谱（电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS） 主要质谱类型主要质谱类型鉴定和注释蛋白质的路线鉴定和注释蛋白质的路线 n通过肽质谱指纹图（通过肽质谱指纹图（peptide mass

17、fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配）和数据库搜寻匹配 n通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配序列标签和数据库搜寻匹配 目目 录录（四）蛋白质组学研究的生物信息学（四）蛋白质组学研究的生物信息学 生物信息学是蛋白质组学研究的一个生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可缺少的部分。不可缺少的部分。应应 用用n构建和分析双向凝胶电泳图谱构建和分析双向凝胶电泳图谱 n数据库的搜索与构建数据库的搜索与构建蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础的标志和基础 n瑞士的瑞士的SWISS

18、-PROT拥有目前世界上最拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。大、种类最多的蛋白质组数据库。n目前应用最普遍的数据库是目前应用最普遍的数据库是NRDB 和和dbEST数据库。数据库。dbEST数据库数据库 由美国国家生物技术信息中心（由美国国家生物技术信息中心（NCBINCBI）和欧洲生物）和欧洲生物信息学研究所（信息学研究所（EBIEBI）共同编辑，包括许多生物体）共同编辑，包括许多生物体的表达序列标签（的表达序列标签（ESTEST） 肽序列标签肽序列标签(PST)或部分序列信息最适合查寻或部分序列信息最适合查寻 概念：把一个基因组表达的全部蛋白概念：把一个基因组表达的全部蛋白质或

19、一个复杂体系中所有的蛋白质进质或一个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。行精确的定量和鉴定。 （五）定量蛋白质组学研究（五）定量蛋白质组学研究 低丰度蛋白质检测困难低丰度蛋白质检测困难 蛋白质表达量差异很小，如在蛋白质表达量差异很小，如在50%以下时，精确定量成为瓶颈以下时，精确定量成为瓶颈 蛋白质表达的瞬时变化蛋白质表达的瞬时变化 蛋白质定量的难点蛋白质定量的难点1 1基于双向凝胶电泳的定量蛋白基于双向凝胶电泳的定量蛋白质组研究策略质组研究策略 双向凝胶电泳双向凝胶电泳(2-DE)是目前唯一能分离展是目前唯一能分离展示大量蛋白质并进行蛋白质定量分析的一种示大量蛋白质并进行蛋白质定量分

20、析的一种方法。方法。 荧光差异显示双向电泳（荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE） 2基于生物质谱的定量蛋白质组研究基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略策略 原理：对于具有相同离子化能力的蛋白质原理：对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽，可以通过比较质谱峰的强度（或或多肽，可以通过比较质谱峰的强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。 二、蛋白质组功能模式的研究方法二、蛋白质组功能模式的研究方法主要研究目标 n揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深入了解蛋白质的结构协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关

21、系，以及基因结构与蛋与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。白质结构功能的关系。 （一）蛋白质翻译后修饰的研究（一）蛋白质翻译后修饰的研究翻译后修饰翻译后修饰糖基化糖基化乙酰化乙酰化甲基化甲基化羧基化羧基化二硫键二硫键n修饰肽的检测的高灵敏度方法修饰肽的检测的高灵敏度方法 n蛋白质翻译后修饰的定量分析蛋白质翻译后修饰的定量分析 n合适的修饰状态下处理和电离条件合适的修饰状态下处理和电离条件 n测定工作量巨大测定工作量巨大 研究面临的困难：研究面临的困难： （二）蛋白质相互作用研究技术（二）蛋白质相互作用研究技术n生命的基本过程是不同功能蛋白质在时生命的基本过程是不同功能蛋白质在时

22、空上有序和协同作用空上有序和协同作用 n新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现络协同作用实现 n细胞信号转导及病原体感染和免疫反应细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 n1989年年Field 和和Song等人在酵母细胞中等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。设计的分析蛋白质相互作用的方法。n以真核细胞转录激活因子的结构和活性以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础。特点为基础。1 1酵母双杂交系统酵母双杂交系统（yeast two-hybrid systemyeast two-hybrid system） 转录激活因子转录激活因子GAL

23、4GAL4的特点的特点nN N端含端含NLSNLS和与酵母和与酵母GAL1GAL1基因启动子上游激活序列基因启动子上游激活序列(UASG)(UASG)结合的结构域结合的结构域nC C端含端含GAL1GAL1转录激活结构域转录激活结构域n功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性式结合在一起才具有完整的转录因子活性 系系 统统 构构 建建n分别构建含分别构建含GAL4 BD GAL4 BD 和和AD AD 的两个酵的两个酵母融合蛋白表达载体；母融合蛋白表达载体；n建立含特殊基因型、适用于双杂交建立含特殊基因型、适用于双杂交

24、体分析的酵母菌株体分析的酵母菌株 2 2噬菌体表面显示技术噬菌体表面显示技术 ( phage display )( phage display ) 三个基本因素：三个基本因素： 在噬菌体在噬菌体pp和和pp衣壳蛋白衣壳蛋白N N端插入外源端插入外源待筛基因编码的蛋白，形成的融合蛋白表达待筛基因编码的蛋白，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面；同时其保持的外源蛋在噬菌体颗粒的表面；同时其保持的外源蛋白天然构象能被相应的抗体或受体识别。白天然构象能被相应的抗体或受体识别。n利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲和筛选法（和筛选法（panning），从噬菌体文库中）

25、，从噬菌体文库中筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。n外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。测序推导出来。主主 要要 应应 用用筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质 研究抗体或受体的结合位点研究抗体或受体的结合位点构建随机肽库、抗体库和蛋白文库构建随机肽库、抗体库和蛋白文库 改造和提高蛋白质的生物学和免疫学特性改造和提高蛋白质的生物学和免疫学特性 研究新型多肽药物、疫苗和抗体研究新型多肽药物、疫苗和抗体 研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的