第三章植物器官培养

1、第三章植物器官培养器官培养器官培养(Organ culture)植物某一器官的全部或部分或器官原基的培养。植物某一器官的全部或部分或器官原基的培养。根段、根尖、根段、根尖、 茎段、茎尖、茎段、茎尖、 块茎、球茎、块茎、球茎、 叶片、子叶、叶片、子叶、 花序、花瓣、子房、花托、花序、花瓣、子房、花托、果实、果实、 种子种子等。等。l 外植体选择：外植体选择：p28l洗涤：洗涤：p19l 灭菌：器皿灭菌灭菌：器皿灭菌p20 ， 外植体消毒外植体消毒p29第一节第一节 植物器官及组织培养的一般程序植物器官及组织培养的一般程序n培养基的选择：基本培养基生长调节剂培养基的选择：基本培养基生长调节剂p21

2、n培养基配置：特别是植物生长调节剂配置、培养基配置：特别是植物生长调节剂配置、保存保存p26-27n培养基灭菌：（尤其是某些不能高温培养基灭菌：（尤其是某些不能高温高压灭菌的物质）高压灭菌的物质） p20无无 菌菌 操操 作（技术）作（技术）p21Success!植物（活体）植物（活体）培养基（载体）培养基（载体）一般程序一般程序(p29-30)外植体取材外植体取材 自来水冲洗自来水冲洗10min以上以上 表面消毒表面消毒10-30s 选择适合消毒剂处理选择适合消毒剂处理无菌水冲洗无菌水冲洗3-5次次 放入无菌培养皿备用放入无菌培养皿备用外植体消毒外植体消毒植物组织培养形态发生和植株再生植物组

3、织培养形态发生和植株再生一、概念和意义一、概念和意义1.1.茎尖培养概念茎尖培养概念茎尖分生组织培养茎尖分生组织培养指对不超过指对不超过0.1mm的茎尖或几十微米的茎尖进行的培养。的茎尖或几十微米的茎尖进行的培养。特点：可获脱病毒苗，操作困难，成苗时间长。特点：可获脱病毒苗，操作困难，成苗时间长。 普通茎尖培养普通茎尖培养对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养。对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养。操作技术简单、易成活、成苗时间短、繁殖速度快。操作技术简单、易成活、成苗时间短、繁殖速度快。 第二节第二节 茎尖培养茎尖培养茎段茎段 茎尖取材有限，茎尖取材有限，可采用带芽或可采用带芽

4、或不带芽的茎段进行培养。不带芽的茎段进行培养。优点优点容易成功、变异小、容易成功、变异小、性状一致、繁殖速度快。性状一致、繁殖速度快。用于快速繁殖。用于快速繁殖。茎尖培养茎尖培养在园艺植物离体培养中最常见，在园艺植物离体培养中最常见，可快速繁殖无性系；可快速繁殖无性系；培养脱病毒苗、培养脱病毒苗、品种改良；品种改良；基础研究。基础研究。2.2.茎尖培养意义茎尖培养意义蜡梅蜡梅茎段茎段（一）建立无菌材料（一）建立无菌材料 健壮枝梢健壮枝梢 去除叶片去除叶片 分成分成1-2cm1-2cm 自来水冲洗消毒自来水冲洗消毒 75% 75%的酒精的酒精3030秒秒 0.1% 0.1%升汞或升汞或2%2%次

5、氯酸钠消毒次氯酸钠消毒8-10min8-10min 无菌水无菌水 修剪剥离茎尖，通常切割下顶端修剪剥离茎尖，通常切割下顶端 通常切割下顶端通常切割下顶端0.1mm0.1mm叶原基的茎尖叶原基的茎尖 无菌水无菌水 接种。接种。 二、茎尖培养一般方法二、茎尖培养一般方法（茎尖分生组织）（茎尖分生组织）（二）培养基（二）培养基多为多为MS培养基及其改良配方，培养基及其改良配方，还有还有White配方、配方、B5配方、配方、Heller配方、配方、Gautheret配方等。配方等。1.1.固体培养法固体培养法特点特点琼脂做凝固剂，茎尖基部紧贴培养基。琼脂做凝固剂，茎尖基部紧贴培养基。优点优点操作较为简

6、单，普遍。操作较为简单，普遍。缺点缺点对有些植物培养较难。对有些植物培养较难。操作操作培养基分装培养基分装灭菌灭菌冷却冷却茎尖接种茎尖接种252533培养。培养。（三）培养方法（三）培养方法2.2.纸桥培养法纸桥培养法滤纸取代琼脂，滤纸取代琼脂，液体培养基。液体培养基。优点优点营养物质能均衡持久地供给外植体，利于外植体健康生长。营养物质能均衡持久地供给外植体，利于外植体健康生长。缺点缺点操作复杂。操作复杂。 茎尖培养可进行植物的无性快繁，茎尖培养可进行植物的无性快繁，并且技术较为成熟，也叫微繁技术。并且技术较为成熟，也叫微繁技术。三、普通茎尖培养与繁殖技术三、普通茎尖培养与繁殖技术（一）茎尖微

7、繁技术的一般方法（一）茎尖微繁技术的一般方法1. 无菌培养体系的建立无菌培养体系的建立外植体制备外植体制备正在生长的芽或腋芽、茎段、鳞茎切块、块茎、球茎。正在生长的芽或腋芽、茎段、鳞茎切块、块茎、球茎。茎尖组织大小为带茎尖组织大小为带2-4个叶原基或更多。个叶原基或更多。 操作程序操作程序类似一般无菌操作基本技术，类似一般无菌操作基本技术，基本培养基：基本培养基：MS、B5、White等，等，糖糖2-3%，生长调节剂。生长调节剂。培养条件培养条件1000-3000Lx、16hr、25。茎尖的发育方向及调节是采用生长调节剂，茎尖的发育方向及调节是采用生长调节剂，6-BA6-BA、KTKT等促进发

8、芽，等促进发芽，IBAIBA、NAANAA、2,4-D2,4-D促生根。促生根。培养的茎尖可能有几种不同的发育方向培养的茎尖可能有几种不同的发育方向 (1)腋芽萌发腋芽萌发 (2)脱分化后产生胚状体脱分化后产生胚状体 (3)脱分化后直接产生不定器官脱分化后直接产生不定器官 (4)脱分化后形成愈伤组织脱分化后形成愈伤组织 用作悬浮培养细胞或原生质体的起始材料，用作悬浮培养细胞或原生质体的起始材料， 或用以分化大量胚状体，或用以分化大量胚状体， 或不定芽或不定芽.2.2.脱分化和再分化脱分化和再分化3.3.生根成苗生根成苗胚状体可直接成苗，胚状体可直接成苗，腋芽和不定芽须转入生根培养基培养。腋芽和

9、不定芽须转入生根培养基培养。 矿质元素高利于茎叶生长，低利于生根，故生根培养基中无机盐低。矿质元素高利于茎叶生长，低利于生根，故生根培养基中无机盐低。芽苗生根采取的措施芽苗生根采取的措施 (1)(1)降低基本培养基无机盐浓度降低基本培养基无机盐浓度 一般采用一般采用1/2MS1/2MS或改良或改良WhiteWhite基本培养基。基本培养基。(2) (2) 调节生长素浓度调节生长素浓度 采用采用IBAIBA或有利于分化根。或有利于分化根。(3 )(3 )添加吸附剂添加吸附剂 如活性碳。如活性碳。(4 )(4 )减少琼脂用量。减少琼脂用量。试管苗的移栽应在生根后不久，当小根尚未停止生长之前及时移栽

10、。试管苗的移栽应在生根后不久，当小根尚未停止生长之前及时移栽。 （小根（小根5cm5cm左右）。左右）。即将形成的小植株转移到土壤的过程。即将形成的小植株转移到土壤的过程。这个过程是微繁殖最关键的一步。这个过程是微繁殖最关键的一步。保持小苗水分供需平衡保持小苗水分供需平衡选择适当的介质选择适当的介质 珍珠岩、蛭石、粗砂、炉灰渣、锯木屑等。珍珠岩、蛭石、粗砂、炉灰渣、锯木屑等。防止杂菌滋生防止杂菌滋生 保持环境干净，农药灭菌。保持环境干净，农药灭菌。注意光温管理注意光温管理 避免阳光直射、温度适宜。避免阳光直射、温度适宜。 4.4.试管苗的移植试管苗的移植( (二二) ) 影响茎尖培养微繁殖的因

11、素影响茎尖培养微繁殖的因素p基因型基因型p外植体的大小外植体的大小p供试植株的生理状态供试植株的生理状态p芽在植株上的部位芽在植株上的部位p供试植株的年龄供试植株的年龄p培养基：植物生长物质培养基：植物生长物质p褐变褐变p玻璃化玻璃化玻璃化苗的叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状；玻璃化苗的叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状； 整株矮化肿胀、失绿；整株矮化肿胀、失绿； 叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎； 叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。玻璃化苗中因其体内含水量高，玻璃化苗中因其体

12、内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和酶活性降低，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难成活，分化能力降低，所以很难成活，严重影响组培苗繁殖率的提高。严重影响组培苗繁殖率的提高。 一、离体叶培养概念及意义一、离体叶培养概念及意义1.1.离体叶培养概念离体叶培养概念 指包括叶原基、叶柄、叶鞘、指包括叶原基、叶柄、叶鞘、 叶片、子叶等的无菌培养。叶片、子叶等的无菌培养。 多经脱分化形成愈伤组织，多经脱分化形成愈伤组织， 再由后者分化出茎和根。再由后者分化出茎和根。第三节第三节 叶的培养叶的培养桫椤叶片桫椤叶片研究叶形

13、态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题的良好方法。研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题的良好方法。 叶原基培养成为成熟叶，从而观察叶形态发生的过程。叶原基培养成为成熟叶，从而观察叶形态发生的过程。通过叶片组织的脱分化和再分化培养，以证实叶细胞的全能性。通过叶片组织的脱分化和再分化培养，以证实叶细胞的全能性。通过离体叶组织、细胞的培养，通过离体叶组织、细胞的培养， 探索离体叶组织、细胞培养的条件和影响因素。探索离体叶组织、细胞培养的条件和影响因素。利用离体叶组织的再生特性，建立植物体细胞快速无性繁殖系，利用离体叶组织的再生特性，建立植物体细胞快速无性繁殖系， 提高某些不易繁殖植物的繁殖

14、系数。提高某些不易繁殖植物的繁殖系数。叶细胞培养物是良好的遗传诱变系统，叶细胞培养物是良好的遗传诱变系统， 经过自然变异或者人工诱变处理可筛选出突变体应用于育种实践。经过自然变异或者人工诱变处理可筛选出突变体应用于育种实践。 2.2.离体叶培养意义离体叶培养意义（一）叶原基培养（一）叶原基培养 叶原基培养是研究形态建成的重要手段。叶原基培养是研究形态建成的重要手段。 1. 采用休眠期顶芽，剥去一部分鳞片。采用休眠期顶芽，剥去一部分鳞片。 2. 在在5%次氯酸钠溶液中浸泡次氯酸钠溶液中浸泡20min，进行表面消毒。，进行表面消毒。 3. 切取柱状叶原基进行培养。切取柱状叶原基进行培养。 培养基采

15、用培养基采用Knops无机盐（部分修改）或无机盐（部分修改）或Kundson（1951）配方（大量元素），）配方（大量元素）， 添加添加Nitsch配方中的微量元素（再加配方中的微量元素（再加CoCl225mg/L）2%蔗糖、蔗糖、pH5.5。部分实验中添加维生素、部分实验中添加维生素、NAA、水解酪蛋白等，、水解酪蛋白等，温度温度24，人工光照，人工光照24h。 二、叶培养方法二、叶培养方法1.1.叶组织培养培养的方法叶组织培养培养的方法（二）叶组织培养（二）叶组织培养方法一（幼嫩叶片）方法一（幼嫩叶片）选取植株顶端未充分展开的幼嫩叶片选取植株顶端未充分展开的幼嫩叶片流水冲洗流水冲洗蘸有少量

16、蘸有少量75%酒精的纱布擦拭叶片两面酒精的纱布擦拭叶片两面放入放入0.1%升汞溶液中消毒升汞溶液中消毒5-8min无菌水冲洗无菌水冲洗3-4次次消毒后叶片转入到铺有滤纸的无菌培养皿内消毒后叶片转入到铺有滤纸的无菌培养皿内解剖刀切成解剖刀切成0.5cm0.5cm0.5cm0.5cm左右的小块或薄片（如叶柄和子叶）左右的小块或薄片（如叶柄和子叶）上表皮朝上接在固体培养基上培养。上表皮朝上接在固体培养基上培养。 70%酒精漂洗约酒精漂洗约10秒秒饱和漂白粉液中浸饱和漂白粉液中浸3-15分钟分钟无菌水冲洗数次无菌水冲洗数次放在无菌的干滤纸上吸干水分以供接种用。放在无菌的干滤纸上吸干水分以供接种用。对一

17、些粗糙或带绒毛的叶片要延长灭菌时间。对一些粗糙或带绒毛的叶片要延长灭菌时间。注意要选择成熟的叶片。注意要选择成熟的叶片。 同一叶片的栅栏组织比海绵组织较成熟。同一叶片的栅栏组织比海绵组织较成熟。培养叶肉组织时因海绵组织在分裂前就死亡，培养叶肉组织时因海绵组织在分裂前就死亡，如果栅栏组织不发达就难培养。如果栅栏组织不发达就难培养。方法二（成熟叶片）方法二（成熟叶片）叶片愈伤组织诱导形成叶片愈伤组织诱导形成常用常用MS、B5、White、N6等培养基，等培养基，3%糖，糖，培养基中添加椰子汁等有机添加物，培养基中添加椰子汁等有机添加物，有利于叶片组织培养中的形态发生。有利于叶片组织培养中的形态发生

18、。 大多数双子叶植物的叶组织培养，大多数双子叶植物的叶组织培养，细胞分裂素特别是细胞分裂素特别是KT、6-BA有利于芽的形成，有利于芽的形成，生长素特别是生长素特别是NAA有利于根的发生，有利于根的发生， 2,4-D有利于愈伤组织的形成。有利于愈伤组织的形成。一般一般 6-BA 1-3mg/L NAA 0.25-1mg/L 2. 2. 培养基培养基25-28，光照光照12-14h，光照度光照度 1500-2000Lx，不定芽分化和生长期间不定芽分化和生长期间3000-10000Lx。3.3.培养条件培养条件 直接产生不定芽；直接产生不定芽； 由愈伤组织产生不定芽；由愈伤组织产生不定芽； 胚状体

19、形成；胚状体形成； 其他途径。其他途径。 叶片的分化程度较高，叶片的分化程度较高，一般需要通过诱导愈伤组织并经再分化才能产生植株，变异率较高。一般需要通过诱导愈伤组织并经再分化才能产生植株，变异率较高。再分化能力弱的植物种类而言，叶片离体再生的难度相当大。再分化能力弱的植物种类而言，叶片离体再生的难度相当大。4.4.离体叶组织的茎和芽发生途径离体叶组织的茎和芽发生途径5.5.影响叶肉组织培养的因素影响叶肉组织培养的因素（1）基因型基因型 不同植物种类、不同植物种类、 同一物种的不同品种间在叶组织培养特性上有一定的差异。同一物种的不同品种间在叶组织培养特性上有一定的差异。（2）细胞分裂素与生长素

20、的组合细胞分裂素与生长素的组合 两种细胞分裂素都能促进芽的分化，两种细胞分裂素都能促进芽的分化， 6-BA的作用好于的作用好于KT， 但但6-BA对不定芽的进一步发育（茎叶的形成）有抑制作用。对不定芽的进一步发育（茎叶的形成）有抑制作用。 细胞分裂素与生长素的组合细胞分裂素与生长素的组合 细胞分裂素与生长素配合使用，细胞分裂素与生长素配合使用， 诱导芽分化效果好于单独使用细胞分裂素。诱导芽分化效果好于单独使用细胞分裂素。（3 3）供试植株的发育时间和叶龄）供试植株的发育时间和叶龄 个体发育早期的幼嫩叶片较成熟幼嫩叶片分化能力高，个体发育早期的幼嫩叶片较成熟幼嫩叶片分化能力高，（4 4）叶脉）叶

21、脉 叶脉、叶柄分化能力较强。叶脉、叶柄分化能力较强。（5 5）极性）极性 叶背面朝上放置就不生长。叶背面朝上放置就不生长。（6 6）损伤）损伤 损伤后刺激诱导愈伤组织生长和器官发生。损伤后刺激诱导愈伤组织生长和器官发生。一、根培养一、根培养（一）根培养的实践意义（一）根培养的实践意义1.1.进行根系生理代谢研究的最优良试验体系。进行根系生理代谢研究的最优良试验体系。2.2.研究器官分化、形态建成的良好体系。研究器官分化、形态建成的良好体系。3.3.建立快速生长的根无性系，对药物生产有重要意义。建立快速生长的根无性系，对药物生产有重要意义。4.4.对根细胞培养物进行诱变处理，可筛选突变体，用于育

22、种实践。对根细胞培养物进行诱变处理，可筛选突变体，用于育种实践。第四节第四节 其他器官的培养其他器官的培养1.1.培养步骤培养步骤 离体根培养的第一步是要获得无性繁殖系。离体根培养的第一步是要获得无性繁殖系。 直接取室外植物的根系培养；直接取室外植物的根系培养； 植物种子，经灭菌后，在无菌条件下发芽，获得无菌苗，取根培养。植物种子，经灭菌后，在无菌条件下发芽，获得无菌苗，取根培养。 种子表面消毒种子表面消毒无菌条件下萌发无菌条件下萌发根伸长后切取根伸长后切取1.0cm1.0cm长的根尖长的根尖接种于培养基接种于培养基侧根生长侧根生长切取侧根的根尖扩大培养切取侧根的根尖扩大培养获离体根无性系获离

23、体根无性系 （二）离体根的培养方法（二）离体根的培养方法胡萝卜根培养胡萝卜根培养在一个培养瓶中，有液体和固体培养两个组成部分：在一个培养瓶中，有液体和固体培养两个组成部分：根尖部分处于液体培养中，根尖部分处于液体培养中，而根茎部分则插入含有有机成分的固体而根茎部分则插入含有有机成分的固体 培养基中。培养基中。可进行根系生长发育，营养代谢或结瘤试验。可进行根系生长发育，营养代谢或结瘤试验。2.2.离体根培养的试验系统离体根培养的试验系统此装置由此装置由2个部分组成，个部分组成，下部是试管，管中装有含无机盐的营养液，下部是试管，管中装有含无机盐的营养液，并接种根瘤菌；并接种根瘤菌；上部是玻璃盖，盖

24、中有一单向开口的管状凹槽，上部是玻璃盖，盖中有一单向开口的管状凹槽，槽中盛放含有有机化合物的琼脂固体培养基。槽中盛放含有有机化合物的琼脂固体培养基。故有机营养从根基部吸收，故有机营养从根基部吸收， 无机营养从根尖吸收。无机营养从根尖吸收。 Bunting和和Horrocks1964年修改了年修改了Raggio等的装置，等的装置，变为在粗沙中提供无机盐。变为在粗沙中提供无机盐。利用这一技术研究菜豆、大豆等离体根根瘤菌的固氮情况，利用这一技术研究菜豆、大豆等离体根根瘤菌的固氮情况，结果表明这些根瘤菌含有血红蛋白，并能固定大气中的氮。结果表明这些根瘤菌含有血红蛋白，并能固定大气中的氮。Raggio1

25、965年等设计了离体根的结瘤实验装置。年等设计了离体根的结瘤实验装置。离体根培养多用无机离子浓度低的离体根培养多用无机离子浓度低的WhiteWhite培养基或其他培养基，培养基或其他培养基，MSMS、B5B5等也可采用，但必须将其浓度稀释到等也可采用，但必须将其浓度稀释到2/32/3或或1/21/2。（三）离体根培养所用的培养基（三）离体根培养所用的培养基成份成份 苜蓿浓度苜蓿浓度(mg/L) (mg/L) 西红柿浓度西红柿浓度(mg/L)(mg/L) Ca(NO3)2.4H2O 200 143.9Na2SO4 200 100KCl 65 40KNO3 82 NaH2PO4.2H2O 18.6

26、 10.6MgSO4.7H2O 740 368.5MnSO4.4H2O 4.5 3.35FeC6H5O7.3H2O 4 2.25ZnSO4.7H2O 2.7 1.34H3BO3 1.5 0.75KI 0.8 0.38CuSO4.5H2O 0.004 0.002MoO3 0.02 0.01甘氨酸甘氨酸 3 4 烟酸烟酸 0.5 0.75维生素维生素B1 0.1 0.1维生素维生素B6 0.1 0.1蔗糖蔗糖 20000 15000pH 5.5 5.2 1.1.基因型基因型 不同植物的根对培养的反应不同，不同植物的根对培养的反应不同，番茄、烟草、马铃薯、小麦可快速生长并继代培养无限生长。番茄、烟草、马铃薯、小麦可快速生