基于苯甲酸芬顿反应的传感器研究

1、目 录摘要1Abstract2前言3一、苯甲酸的类芬顿反应4（一）Co2+参与的类芬顿反应机理4（二）化学传感器的构建5二、实验部分6（一）实验药品和仪器61.实验药品62.实验仪器6（二）实验过程61.pH62.温度63.Co2+浓度64.苯甲酸和过氧化氢浓度比以及时间65.荧光的衰减速度76.荧光产物的标准曲线7三、结果与讨论8（一）最佳反应条件确定8（二）荧光标准曲线的绘制13（三）苯甲酸类芬顿反应的应用14结论16参考文献17致谢1919基于苯甲酸芬顿反应的传感器研究摘要芬顿反应体系作为一种高效处理工业废水的方法一直是研究的热点，常见的芬顿试剂为二价铁离子和过氧化氢，因其氧化效率和速率

2、高而被广泛应用，但只能用于pH小于4的强酸性溶液，在使用范围上具有一定的局限性。本文研究并提出一种相似的类芬顿反应，以二价钴离子和过氧化氢为芬顿试剂，在中性和碱性条件下有很好的反应效果，并用荧光分析法测试其与苯甲酸的氧化反应，来检验苯甲酸作为荧光传感器捕获和检测羟基自由基的能力。关键词：芬顿反应；苯甲酸；荧光；羟基自由基AbstractFenton reaction system has been a hotspot in research as a method for efficient treatment of industrial waste water. The common Fen

3、ton reagents are ferrous ion and hydrogen peroxide. They are widely used due to their high oxidation efficiency and velocity, but only for strongly acidic solutions with a pH of less than 4, so there are certain limitations in the usage. In this paper, a similar Fenton-like reaction was studied and

4、proposed. Cobalt ion and hydrogen peroxide were used as the Fenton-like reagents. The reaction was very good under neutral and alkaline conditions. Besides, we test its reactivity with benzoic acid by fluorescence analysis, and evaluate its ability of capturing and detecting hydroxyl radicals.Keywor

5、ds: Fenton Reaction; Benzoic Acid; Fluorescence; Hydroxyl Radicals.前言芬顿反应是无机化学中非常重要的一类反应，是为数不多的无机人名反应之一。1876年，化学家芬顿在酒石酸、过氧化氢以及微量二价铁盐的混合物中得到了一种有色产物1，1894年他发表文章表明这种产物是二羟基马来酸，1932年哈伯和韦斯提出了体系中羟基自由基的存在而导致其氧化性提升，1950年巴克斯代尔猜想体系中的超氧化物抑制了三价铁的生成，以此来解释铁的催化性2。然而，由于这种无机体系的极强氧化性，很难应用于普通反应，直到20世纪70年代才被应用于高效废水处理3。然

6、而，芬顿体系极强的氧化性只有在强酸性条件下才能实现，碱性或中性条件下则失去氧化性4，针对这一点缺点，我们尝试寻找在偏碱性条件下具有强氧化性的类芬顿体系来弥补芬顿反应的不足，并将其应用于羟基自由基的捕获和检测。众所周知，羟基自由基与人类的衰老过程有着很大联系，同时也是引发细胞突变和坏死的主要物质5，所以研究羟基自由基的检测与清除对于生物化学和生命科学课题具有重要意义。目前主要的检测羟基自由基的方法有电子自旋补集法、高效液相色谱法、电化学分析法和荧光法等，每个方法各有优劣，但羟基自由基寿命极短，浓度很低，且现今的检测技术多集中于体外检测6，所以寻找一种高灵敏度的方法尤为重要。荧光分析法由于灵敏度高

7、，选择性好，检测限低，干扰少7，所以本实验尝试采用二价钴离子与过氧化氢的类芬顿体系，用荧光分析法测试其与苯甲酸的最佳反应条件，来验证本体系在碱性环境下的适用性，并通过对反应产物的荧光检测来尝试定量分析苯甲酸捕获和检测羟基自由基的能力，最后评估苯甲酸作为化学传感器的适用性以及优缺点。一、苯甲酸的类芬顿反应芬顿反应体系中起主要氧化作用的物种是羟基自由基，虽然自由基存在时间极短，液相中仅为10-9秒8，但它的高活性和强氧化能力，可以迅速氧化苯甲酸和香豆素这类含苯环的富电子体系生成羟基苯甲酸和7-羟基香豆素，而香豆素被氧化的pH环境在4左右9，所以本实验选用反应条件偏碱性的苯甲酸进行试验，与Co2+以

8、及过氧化氢形成类芬顿体系。（一）Co2+参与的类芬顿反应机理和Fe2+参与的经典芬顿反应类似，Co2+和过氧化氢在合适的条件下先进行反应，过氧化氢均裂生成羟基自由基，接着羟基自由基进攻苯甲酸的邻、间、对位，分别得到邻、间、对羟基苯甲酸，如图1-1所示，这是主要的荧光产物。此外，高活性的自由基会引发一些副反应，不仅会氧化苯甲酸，还会进攻过氧化氢生成过氧羟自由基，也会与Co2+反应转变为羟基，羟基自由基之间也会相互碰撞失去氧化性10，所以要找出最稳定的反应条件使得羟基自由基的副反应尽量减少，同时重现性也要良好，有助于进行定性和定量分析。图1-1 Co2+参与的类芬顿反应机理和主要副反应Ciotti

9、研究发现在芬顿反应中，Fe2+:H2O2的值会影响反应的进程和羟基自由基的生成量11，他建立了模型试图解释这其中的数学关系，但结果并不理想。Lindsey认为研究芬顿反应应该首先找到最合适的反应条件12，即达到稳态，从稳态出发去验证化学探针对羟基自由基的检测和量化效果。Burgos Castillo Rutely C则成功寻找到最佳稳态条件，验证了香豆素作为有机探针捕获和量化羟基自由基的能力13。本实验经过初期试验，发现苯甲酸和H2O2的浓度对反应后的荧光强度也有着很大影响，因此，寻找最优条件和环境成为研究Co2+类芬顿体系的关键。（二）化学传感器的构建分子识别在生物化学、材料化学以及信息科学

10、领域扮演十分重要的角色，也就是传感器技术，在医学上也称为探针技术，通过底物与受体之间的选择性结合产生某种特定信号来向外传递信息14，为了高效简便地收发信息，人们设法通过检测电信号，光信号来实现分子识别，其中荧光探针因其选择性好，灵敏度高而被广泛研究15。本实验选用苯甲酸作为荧光传感器，尝试构建一种检测量化羟基自由基的方法，使用Co2+和过氧化氢的类芬顿体系，建立浓度与荧光强度的线性标准曲线，来对羟基自由基浓度进行定量分析。基于荧光分析法的特性，构建良好的荧光传感器需要得到稳定的、重现性好的荧光信号16，且要有较好的荧光量子产率，所以寻找最合适的反应条件成为首要任务。二、实验部分（一）实验药品和

11、仪器1.实验药品苯甲酸（PhCOOH，CP），硝酸钴（Co(NO3)2，AR），过氧化氢（H2O2，AR），磷酸二氢钠（NaH2PO4，AR），磷酸氢二钠（Na2HPO4，AR），去离子水。2.实验仪器F-4600型荧光光度计，集热式恒温加热磁力搅拌器（DF-101S），1.5mL和5mL离心管若干，10mL反应管若干，20-1000L移液枪和枪头若干。（二）实验过程以下每项实验中的每个样品，都至少进行两次平行测定，取平均值。1.pH配制一系列pH为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的磷酸缓冲溶液，在1.5 mL离心管中分别加入2 mmol/L苯甲酸100L、100 mol/LCo

12、2+100L、2 mmol/LH2O2100 L和磷酸缓冲溶液700L，在热水浴中反应20 min，用荧光光度计进行测量。2.温度在1.5 mL离心管中加入2 mmol/L苯甲酸100L、100 mol/LCo2+100L、2 mmol/LH2O2100L和磷酸缓冲溶液700L，分别置于70C、75C、80C、85C、90C、95C的水浴中反应20 min，测量其荧光强度。3.Co2+浓度在1.5mL离心管中加入2 mmol/L苯甲酸100L和磷酸缓冲溶液700L，再分别加入10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 mol/L的Co2+100L，最后加入2 mmol/L的H2O2100

13、L，置于热水浴中反应20 min后，用荧光光度计进行测量。4.苯甲酸和过氧化氢浓度比以及时间取10 mL反应管若干，根据表2-1加入各种药品溶液，总量为5 mL，置于热水浴中反应并计时，在0-30 min内的各个时间节点用移液枪吸出1000L溶液，用荧光光度计进行测定。体系苯甲酸CO2+H2O2苯甲酸:H2O2A200 mol/L10-5100 mol/L2B200 mol/L10-5200 mol/L1C200 mol/L10-5400 mol/L0.5D200 mol/L10-5800 mol/L0.25表2-1 不同过氧化氢浓度的类芬顿体系5.荧光的衰减速度在1.5mL离心管中加入2 m

14、mol/L苯甲酸100L、100 mol/LCo2+100L、2 mmol/LH2O2100L和磷酸缓冲溶液700L，置于热水浴中反应20 min后取出并计时，在反应后的0-30 min内取时间节点测定其荧光强度。6.荧光产物的标准曲线配制一系列数量级浓度的水杨酸标准溶液，用荧光光度计测定其荧光强度，取其中处于仪器量程内的浓度，用磷酸缓冲溶液稀释一个数量级内的不同倍数进行测定，并进行多次空白试验以计算检测限。三、结果与讨论（一）最佳反应条件确定苯甲酸在碱性缓冲溶液中具有很弱的荧光，在Co2+和过氧化氢的存在下会被氧化生成强的荧光，该荧光的最大激发波长为306nm，最大发射波长在420nm左右，

15、荧光强度与苯甲酸相比较高，如图3-1所示。图3-1 苯甲酸和Co2+参与的类芬顿体系荧光发射光谱体系的酸碱环境是芬顿和类芬顿反应的重要条件，通过测定不同pH值下反应后体系的荧光强度进行对比，得到以图3-2。可以从图中看出，Co2+参与的类芬顿体系适合在中性和偏碱性的环境下反应，在偏酸性的条件下，甚至是pH=6.5的弱酸性环境中反应的效果就会大大降低，荧光强度只有pH=8.0时的1/5，说明酸性环境对本体系具有抑制作用，不利于羟基自由基的生成和后续荧光产物的生成。而偏碱性条件下的反应则容易的多，但pH超过8以后，反应后的荧光强度又开始降低，推测可能是Co2+在pH大于8的环境中的氧化能力开始衰弱

16、，生成羟基自由基的效率降低，进而导致反应的进行影响荧光产物的生成，反应后的荧光强度较pH=8时有所降低。所以，我们选择pH=8为最佳的反应酸碱环境，7-8.5为可以相关传感器使用的酸碱范围。图3-2 不同pH下反应后的荧光强度根据相关文献，Co2+参与的类芬顿反应需在热水浴中反应20 min左右17，且温度对芬顿和类芬顿反应有较大影响。在室温下将Co2+和过氧化氢与苯甲酸混合等待反应一段时间后，测得的荧光强度和纯苯甲酸几乎相同，说明在室温或更低温度下，Co2+参与的类芬顿体系不会发生反应。而在70至95C的环境下，其反应后的荧光强度见图3-3，可以看出从70至85C，反应的程度不断增加，反应后

17、的体系荧光强度不断增高，直至90C达到最大值，而后更高的温度下，荧光强度几乎不发生变化，说明90C时，Co2+参与的类芬顿体系已经达到最佳反应温度，继续提升温度进行反应只会增加仪器成本，所以，将最佳的反应温度定为90C以上。图3-3 温度对Co2+参与的类芬顿体系的影响 经过初步试验我们发现Co2+在体系中的作用和催化剂类似，且与Co2+相关的副反应较少，主要影响反应历程的是苯甲酸和过氧化氢的浓度，所以最佳Co2+浓度可以单独筛选.。Co2+浓度在本反应中不起主要影响，只是作为催化剂在体系中循环反应18，所以本实验选取了10-7到10-3这五个数量级的浓度进行试验，每个数量级的荧光强度如图3-

18、4所示。在Co2+浓度较低的10-6和10-7数量级条件下，体系反应后的荧光强度较低，可能是因为由于浓度过低导致Co2+的消耗速率远大于生成速率，羟基自由基的生成受到抑制，荧光产物生成速率相应降低，荧光强度衰减。在浓度大于10-4时，虽然较高的Co2+浓度保证了羟基自由基的生成，但过高的Co2+也会通过副反应消耗羟基自由基，使得荧光产物的生成在一定程度上被抑制，荧光强度相比10-5时有所降低。所以，最佳的Co2+反应浓度为10-5数量级。图3-4 Co2+浓度数量级对荧光强度的影响确定了最佳的pH、温度、Co2+浓度之后，寻找苯甲酸和过氧化氢的最适浓度比成为了反应的关键，芬顿反应中H2O2的浓

19、度对反应历程和结果有着重要影响，本实验的类芬顿体系中的苯甲酸:H2O2不同会导致反应后的荧光强度非线性变化，而且不同苯甲酸:H2O2的体系中荧光强度随时间的变化趋势也会产生差别。由于仪器的量程限制，我将苯甲酸浓度定为200 mol/L，在四种不同浓度比的类芬顿体系中分别测定荧光强度关于时间的变化，如图3-5所示。从图中可以看出，不同浓度比下的反应体系荧光强度随时间的变化有很大的差异，但四种体系在反应时间超过25分钟后的荧光强度都开始趋于平稳。当过氧化氢浓度为100 mol/L，苯甲酸:H2O2为2时，体系的荧光强度先缓慢升高，至10分钟后开始不断下降，这可能是因为过氧化氢浓度太低导致反应初期羟

20、基自由基生成量太少，在10分钟后羟基自由基被消耗完毕，体系中的剩余物质反应生成了非荧光产物，导致荧光强度降低。在过氧化氢浓度为400 mol/L，苯甲酸:H2O2为0.5时，反应体系的荧光强度呈缓慢上升趋势，但整体荧光强度较低，和苯甲酸:H2O2为0.25时相似，这是因为过氧化氢浓度过高导致的副反应增多，消耗了大量羟基自由基，使得苯甲酸和羟基自由基的碰撞减少，主反应被抑制，荧光产物生成减少，荧光强度较低，说明这不是最佳条件，没有达到最佳荧光产率。在过氧化氢浓度为200 mol/L，苯甲酸:H2O2为1的条件时，体系荧光强度随时间变化的曲线在四种体系中最高，且在12分钟左右存在一个最高点，我推测

21、在12分钟之前，羟基自由基不断生成消耗产生荧光产物，生成速率小于消耗速率，体系荧光强度不断增高，在12分钟之后，羟基自由基消耗速率大于生成速率，浓度降低，苯甲酸分子和自由基的碰撞概率开始减小，主反应被抑制，同时副反应产生的非荧光产物，以及羟基苯甲酸的消耗，导致了荧光强度的降低。所以，取苯甲酸:H2O2=1，反应12分钟为最佳浓度和时间。图3-5 不同浓度比下荧光强度对时间的曲线最后，是测试本体系的荧光衰减速度来评价其荧光稳定性，要想构建合理的荧光传感器，荧光的稳定性非常重要，其强度随时间的衰减曲线在一定程度上可以反映体系的稳定性和重现性19，所以为了验证苯甲酸用作荧光传感器的能力，本实验测定了

22、在最佳反应条件下反应结束后1小时内体系的荧光强度变化，来说明本类芬顿体系的稳定性和重现性。如图3-6所示。从图中可以看出，在反应后的30分钟内，体系的荧光强度几乎没有变化，非常稳定，只有在40分钟之后，才出现轻微的衰减，说明Co2+参与的类芬顿体系和苯甲酸反应后的荧光很稳定，30分钟之内均可以进行延迟测定。图3-6 体系的荧光衰减速度综上所述，Co2+参与的类芬顿反应体系的最佳反应条件为，pH=8的缓冲溶液中，10-5数量级的Co2+浓度，苯甲酸:H2O2=1，90摄氏度下反应12分钟。（二）荧光标准曲线的绘制在确定了Co2+参与的类芬顿体系的最佳反应条件后，为了构建捕获检测羟基自由基的苯甲酸

23、化学传感器，需要寻找能够将羟基自由基浓度与荧光强度对应的数学模型或标准曲线20。体系中主要的产物是邻、间、对羟基苯甲酸，且由文献得知在碱性条件下间羟基苯甲酸没有荧光21，邻羟基苯甲酸和对羟基苯甲酸的荧光光谱非常相似22，所以测定一系列浓度的邻羟基苯甲酸即水杨酸的荧光，制成标准曲线，由此可以简要得出本反应中消耗了多少浓度的羟基自由基，来论证苯甲酸捕获和检测羟基自由基的能力。如图3-7所示，在水杨酸浓度为10-100 nmol/L时，荧光强度随浓度线性升高。经过空白试验计算，检测限为0.7 nmol/L左右，证实了构建以苯甲酸为传感器的检测羟基自由基体系的可能。图3-7 水杨酸荧光光谱以及标准曲线

24、（三）苯甲酸类芬顿反应的应用本实验探究的Co2+参与的类芬顿体系，是在中性和偏碱性条件下生成羟基自由基的反应，适用于温和酸碱环境下进行的对羟基自由基的相关研究。例如，在研究中草药的生物和医用性质时，会关注该中草药对人体内羟基自由基的捕获和清除作用，通常用羟自由基清除率表示23。在测定时一般选用芬顿反应作为羟基自由基的生成来源，但其强酸性环境无法进行控制。所以本实验研究的Co2+参与的类芬顿体系可以与传统芬顿反应互补，在酸碱条件上更温和，且更接近人体内的pH环境，使得羟基自由基的体外检测更加可靠。 结论本实验研究的Co2+参与的类芬顿体系很好地解决了传统芬顿反应的酸性条件限制，在中性偏碱性的条件

25、下能够很好的发生反应，产生羟基自由基，进而进攻苯甲酸生成羟基苯甲酸，并产生荧光信号被仪器检测。为了构建以苯甲酸类芬顿反应为主的荧光化学传感器，本实验探究并找出了反应的最佳条件，在pH=8的磷酸缓冲溶液中，苯甲酸:H2O2=1，10-5数量级的Co2+，在90摄氏度的热水浴中反应12分钟，得到的荧光最稳定，荧光强度最好，在反应后的30分钟内不发生明显变化，以此作为苯甲酸用作荧光传感器的最佳条件。根据苯甲酸类芬顿反应的荧光产物为羟基苯甲酸这一事实，通过测定羟基苯甲酸的荧光强度制成与浓度相关的标准曲线，就可以大致得出反应中生成的羟基自由基浓度，证实了苯甲酸作为荧光传感器对羟基自由基的捕获和量化检测能

26、力，同时也体现了寻找类芬顿反应最佳条件的科学性，生成的羟基自由基浓度与反应后体系的荧光强度成线性关系。最后，本实验虽然找到了Co2+参与的类芬顿体系的最佳反应条件，也证实了苯甲酸检测羟基自由基的能力，但仍存在一些不足，例如最佳反应温度较高，不利于实例应用，线性检测不够完善等，这些问题有待进一步的研究。参考文献1. Wardman P, Candeias LP. Fenton chemistry: An introductionJ. Radiation Research. 1996,145(5): 523-531.2. Baxendale, JH, George, P. The Kinetics

27、 of Formation and Dissociation of the Ferrous Tris-dipyridyl IonJ. Transactions of the Faraday Society. 1950,46(9): 736-744.3. Rutely C, Jean-M, Walter Z. Towards reliable quantification of hydroxyl radicals in the Fenton reaction using chemical probesJ. RSC Adv. 2018,8: 5321-5330.4. 文镜,张西,陈曦,郭豫,常平.

28、 体内羟自由基的检测方法J. 食品科学, 2004,25(10): 351-357.5. 樊琛,李燕,曾庆华,王会,陆长民,郑焕芹. Fenton羟自由基反应体系的修正J. 农业科学, 2015,54(21): 5382-5386.6. G. Pliego, J. A. Zazo, P. Garcia-Munoz, M. Munoz. Trends in the Intensification of the Fenton Process for Wastewater TreatmentJ. An Overview, Crit. Rev. Environ. Sci. Technol. 2015,

29、 45(24): 2611-2692.7. 马文辉,彭孝军,徐群,宋波. 香豆素类荧光传感器J. 化学进展, 2007,19(9): 1258-1264.8. 邰超,邹洪,谷学新,郭启华. Fenton反应产生的羟自由基及其清除的电化学方法测定J. 分析测试学报, 2002,21(5): 30-32.9. 舒杰明,高云玲,姚克俭,胡颖. 香豆素类荧光传感器检测金属离子的研究进展J. 化工进展, 2014,33(12): 3144-3156.10. S. Liu, J. Zhao, K. Zhang, L. Yang, M. Sun, H. Yu. Dual emissive fluorescence measurements of hydroxyl radicals using a coumarin-activated silica nanohybrid probe, Analyst, 2016, 141(7): 2296-2302.11. C. Ciotti, R. Baciocchi and T. Tuhkanen, Influence of th