中药制剂分析100

1、中药制剂分析中药制剂分析 第一章第一章 绪绪 论论 中药制剂分析是以中医药理论为指导，运用现代分析理中药制剂分析是以中医药理论为指导，运用现代分析理论和方法研究中药制剂质量的一门应用学科。论和方法研究中药制剂质量的一门应用学科。 第一节第一节 概概 述述 一、中药制剂分析的对象一、中药制剂分析的对象 中药制剂分析的对象应该是制剂组方中起主要作用的中药制剂分析的对象应该是制剂组方中起主要作用的有效成分、毒性成分、或影响疗效的化学成分，对其做出有效成分、毒性成分、或影响疗效的化学成分，对其做出定性、定量等各方面的评价。定性、定量等各方面的评价。 二、中药制剂分析的特点二、中药制剂分析的特点 一）中

2、药制剂分析的对象是复杂的混合物。一）中药制剂分析的对象是复杂的混合物。 1.1.组成中成药的组成中成药的中药材中药材具有复杂性。具有复杂性。 中药材的同名异物，同物异名现象普遍存在。中药材的同名异物，同物异名现象普遍存在。有的中药更由于形态相似，容易容易误用。 2.2.中成药中成药化学成分化学成分的多样性、复杂性。的多样性、复杂性。 1 11 1）由多味中药组成的复方制剂，其化学成分极为复杂多样由多味中药组成的复方制剂，其化学成分极为复杂多样。 2) 2) 各种化学成分在中药中的含量相差悬殊。各种化学成分在中药中的含量相差悬殊。 3 3）中药制剂由多种单味药材组成，所含化学成分相互影响）中药制

3、剂由多种单味药材组成，所含化学成分相互影响。 3.3.中成药的中成药的剂型繁多剂型繁多，所用之辅料多种多样，在测定前，样所用之辅料多种多样，在测定前，样品必须经过预处理，以排除各种辅料的干扰，必要时还须进行辅品必须经过预处理，以排除各种辅料的干扰，必要时还须进行辅料的检查和测定。料的检查和测定。 4.4.工艺各异，很多在单味中药鲜品中存在的化学成分，经过炮工艺各异，很多在单味中药鲜品中存在的化学成分，经过炮制或制备工艺中经加热处理后已不复存在，或在制备过程中因挥制或制备工艺中经加热处理后已不复存在，或在制备过程中因挥发、分解、成盐发、分解、成盐 ( (沉淀沉淀) )反应等增加了中成药分析工程的

4、困难。反应等增加了中成药分析工程的困难。 二）首先进行组方分析，随方决定测定主药，选择合适的检测二）首先进行组方分析，随方决定测定主药，选择合适的检测指标，是目前质量分析方法的特点之一。指标，是目前质量分析方法的特点之一。 在进行质量分析时首先以中医理论和用药原则为指导，进行组在进行质量分析时首先以中医理论和用药原则为指导，进行组方分析，按功能主治分出主、辅、从、次药味和药群，选择某合适方分析，按功能主治分出主、辅、从、次药味和药群，选择某合适的化学成分为指标来说明其与质量的关系。的化学成分为指标来说明其与质量的关系。 三、影响中药制剂质量的因素三、影响中药制剂质量的因素 ( (一一) )原料

5、药材的品种、规格、产地、药用部位、采收季节、加原料药材的品种、规格、产地、药用部位、采收季节、加工方法的影响工方法的影响 (二二)炮制方法的影响炮制方法的影响 （三）（三）生产工艺的影响生产工艺的影响 (四四)中药制剂的包装、贮藏、保管的影响中药制剂的包装、贮藏、保管的影响 四、中药制剂质量控制的现状和发展趋势四、中药制剂质量控制的现状和发展趋势 一）国外药物分析发展趋势一）国外药物分析发展趋势 基本的方法主要为：分离分析法、电化学法、光谱法和联用分基本的方法主要为：分离分析法、电化学法、光谱法和联用分析方法等析方法等。 各种色谱及其联用技术各种色谱及其联用技术已成为占主导地位的常规分析方法，

6、已成为占主导地位的常规分析方法，如HPTLCHPTLC、HPLCHPLC、GCGC、HPCEHPCE、LC-MSLC-MS联用等联用等。 体内药物分析研究体内药物分析研究，趋向于采用在线的联用微透析分析技术在线的联用微透析分析技术，如on-line MD-CEon-line MD-CE、on-line MDon-line MDLCLC等。 手性药物手性药物作为化学药物的特殊群体，以以HPLCHPLC和和CECE为主要拆分手为主要拆分手段的手性药物分析段的手性药物分析方兴未艾，已成为全世界药物分析的研究热点。 二）国内中药制剂分析现状与发展趋势）国内中药制剂分析现状与发展趋势 1、国内中药制剂分

7、析现状国内中药制剂分析现状 1 1）光谱法的应用）光谱法的应用 A A 比色法比色法 如丹参素如丹参素/ /丹参注射液，阿魏酸丹参注射液，阿魏酸/ /当归浸膏当归浸膏-定量定量 B 紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法 单波长法单波长法 如蒽醌如蒽醌/何首乌，香豆素何首乌，香豆素/祖师栗膏祖师栗膏-定量定量 ； 双波长法双波长法 靛蓝、靛玉红靛蓝、靛玉红/喉痛消炎丸喉痛消炎丸-定量定量 ； 三波长法三波长法 小檗碱小檗碱/三黄片三黄片-定量定量 ； 一阶导数光谱法一阶导数光谱法 绿原酸绿原酸/感冒咳嗽冲剂，麻黄碱感冒咳嗽冲剂，麻黄碱/哮喘丸哮喘丸-定量定量 二阶导数光谱法二阶导数光谱法 胆酸

8、胆酸/清宫冲剂，血竭清宫冲剂，血竭/七厘散七厘散-定量定量； 三阶导数光谱法三阶导数光谱法 氢溴酸东莨菪碱氢溴酸东莨菪碱/中麻中麻2号注射液号注射液-定量定量。等。等 C 荧光法荧光法 丹参素丹参素/丹参注射液丹参注射液 D 红外分光光度法红外分光光度法 -体、体、 -体体/山道年；番木鳖碱、马钱子碱山道年；番木鳖碱、马钱子碱/马钱子马钱子 E 质谱法质谱法 F 核磁共振光谱法核磁共振光谱法 2）色谱法的应用）色谱法的应用 A 纸色谱法纸色谱法 已较少应用；已较少应用； B 薄层色谱法薄层色谱法 应用广泛；应用广泛； C 棒状薄层色谱法棒状薄层色谱法 小檗碱小檗碱/复方黄柏制剂、人参皂甙复方黄

9、柏制剂、人参皂甙/人参、人参、胆酸和去氧胆酸胆酸和去氧胆酸/熊胆熊胆-定量；定量； D 气相色谱法气相色谱法 挥发性成分定量挥发性成分定量 冰片冰片/复方丹参片复方丹参片/牛黄解毒丸牛黄解毒丸/冠心苏合丸等；冠心苏合丸等； 厚朴酚、和厚朴酚厚朴酚、和厚朴酚/藿香正气水，麻黄碱藿香正气水，麻黄碱/葛根汤；葛根汤； E 高效液相色谱法高效液相色谱法 应用广泛，以反相应用广泛，以反相HPLC为主；为主； 黄连素黄连素/半夏泻心汤，红景天甙半夏泻心汤，红景天甙/红景天口服液，甘草酸红景天口服液，甘草酸/千金升千金升白冲剂等白冲剂等。 3）电化学分析法的应用）电化学分析法的应用 A 库仑法库仑法 B 电

10、位法电位法 药物电极测定法和电位溶出分析法药物电极测定法和电位溶出分析法 4）其他）其他 A 原子吸收光谱法和冷原子技术原子吸收光谱法和冷原子技术 B 原子发射光谱原子发射光谱 C X射线分析法射线分析法 目前，中药体系存在的突出问题具体表现在：目前，中药体系存在的突出问题具体表现在：(1)(1)定量分析指定量分析指标与其主要药效作用间缺乏相关性；标与其主要药效作用间缺乏相关性；(2)(2)与化学药物相比，中药是与化学药物相比，中药是一个由多成分、多因素构成的复杂体系，目前还没有建立起一套有一个由多成分、多因素构成的复杂体系，目前还没有建立起一套有效的中药复杂体系定量分析标准。效的中药复杂体系

11、定量分析标准。 2 2。国内中药制剂分析发展趋势。国内中药制剂分析发展趋势 (1)(1)中药有效成分的筛选与确定；应用仿生学、基因组学等学中药有效成分的筛选与确定；应用仿生学、基因组学等学科的理论和进展，发现新的药物靶标，从分子、基因、受体、组织科的理论和进展，发现新的药物靶标，从分子、基因、受体、组织和整体水平系统准确地确定中药复杂体系中的药效物质；和整体水平系统准确地确定中药复杂体系中的药效物质； (2)(2)中药有效成分的提取与分析；中药化学成分非常复杂，而中药有效成分的提取与分析；中药化学成分非常复杂，而且有效成分也具有相对性。为了高效率地提取中药有效成分，应用且有效成分也具有相对性。

12、为了高效率地提取中药有效成分，应用各种现代提取技术，如各种现代提取技术，如SFESFE、SWESWE、UAEUAE等，可用于中药复杂体系中等，可用于中药复杂体系中有效成分的提取，利用准确的仪器分析方法和计算机技术，通过因有效成分的提取，利用准确的仪器分析方法和计算机技术，通过因子分析方法对中药复杂体系进行定性定量评价；子分析方法对中药复杂体系进行定性定量评价； (3)(3)中药药效物质与中医药理论相关性研究；利用现代分析方中药药效物质与中医药理论相关性研究；利用现代分析方法研究中药复杂体系中药效物质与中医药理论的定量关系，并结合法研究中药复杂体系中药效物质与中医药理论的定量关系，并结合现代医学

13、理论，阐明其作用机制，在此基础上对中药及其复方进行现代医学理论，阐明其作用机制，在此基础上对中药及其复方进行全面质量控制。全面质量控制。 第二节第二节 中药制剂分析工作的基本程序中药制剂分析工作的基本程序 中药制剂分析程序一般可分取样、测试样品溶液的制备和测定中药制剂分析程序一般可分取样、测试样品溶液的制备和测定（包括定性鉴别、杂质检查、含量测定）等。（包括定性鉴别、杂质检查、含量测定）等。 一、一、 取样取样 1供试品要具有代表性：原则是均匀、合理。供试品要具有代表性：原则是均匀、合理。 2严格按照规定的取样方法进行取样：一般应从每个包装的严格按照规定的取样方法进行取样：一般应从每个包装的四

14、角和中央五处取样，深度可达四角和中央五处取样，深度可达1/3 2/3处。取得的样品装入清洁、处。取得的样品装入清洁、干燥、具磨口塞的容器或密封的塑料袋中，并注明品名、批号、数干燥、具磨口塞的容器或密封的塑料袋中，并注明品名、批号、数量、取样日期及取样人量、取样日期及取样人。 3抽取供试品的数量：各类中药制剂取样大致是至少够抽取供试品的数量：各类中药制剂取样大致是至少够3次检次检验的用量。贵重药品可酌情取样。验的用量。贵重药品可酌情取样。 粉状制剂（散剂、颗粒剂）一般取样粉状制剂（散剂、颗粒剂）一般取样100g，可从包装的上、中、，可从包装的上、中、下三层及周围间隔相等部位取样若干，将所得样品混

15、匀，按四分下三层及周围间隔相等部位取样若干，将所得样品混匀，按四分法从中取出所需供试量。法从中取出所需供试量。 液体制剂（口服液、药酒、糖浆、酊剂等）一般取样液体制剂（口服液、药酒、糖浆、酊剂等）一般取样200ml。同时须注意均匀取样。同时须注意均匀取样。 固体中成药（丸剂、片剂）成品取样一般为固体中成药（丸剂、片剂）成品取样一般为100g，压片后取样，压片后取样200片。丸剂一般取片。丸剂一般取10丸。丸。 胶囊剂胶囊剂 称取不少于称取不少于20个胶囊，倾出其中的药料，称定空胶囊个胶囊，倾出其中的药料，称定空胶囊的重量，由总重中减去，即为胶囊内药料的重量的重量，由总重中减去，即为胶囊内药料的

16、重量。依标示量及供试依标示量及供试量称取部分药料供分析。一般取样量为量称取部分药料供分析。一般取样量为100g。 注射液的取样，灌注、熔封，灭菌前后应经过两次分析。灌封注射液的取样，灌注、熔封，灭菌前后应经过两次分析。灌封前将注射液混合均匀，如前将注射液混合均匀，如 液体取样原则取样，再按标示量及供试量液体取样原则取样，再按标示量及供试量分别取部分进行检验；经灭菌后的注射液须按原来的方法进行分析分别取部分进行检验；经灭菌后的注射液须按原来的方法进行分析检验。已封好的安瓿，取样量一般为检验。已封好的安瓿，取样量一般为200支。支。 其它剂型的中成药，可根据具体情况随意抽取一定数量，作为其它剂型的

17、中成药，可根据具体情况随意抽取一定数量，作为随机抽样。随机抽样。 供试样品检验完毕，应保留一半数量作为留样观察。供试样品检验完毕，应保留一半数量作为留样观察。 二、二、 测试样品溶液的制备测试样品溶液的制备 中药制剂测试样品溶液的制备一般分为提取、分离、净化等过中药制剂测试样品溶液的制备一般分为提取、分离、净化等过程。程。 1.中药制剂样品的提取中药制剂样品的提取 冷浸法冷浸法，61020倍药重溶剂，称重，浸泡倍药重溶剂，称重，浸泡122448小时，称重小时，称重,，等分取样或取总样测定。适宜遇热不稳定的有效成分；等分取样或取总样测定。适宜遇热不稳定的有效成分； 连续回流法，样品置索氏提取器中

18、，利用溶剂反复提取，提取连续回流法，样品置索氏提取器中，利用溶剂反复提取，提取效率高，溶剂少，遇热不稳定的有效成分不宜用此法；效率高，溶剂少，遇热不稳定的有效成分不宜用此法； 超声波提取法超声波提取法，样品置容器中，溶剂提取，效率高，一般样品样品置容器中，溶剂提取，效率高，一般样品30min内即可完成。内即可完成。 2中药制剂样品的预处理中药制剂样品的预处理 液液-液萃取法液萃取法: 溶剂直接萃取、离子对萃取，操作繁，易乳化。溶剂直接萃取、离子对萃取，操作繁，易乳化。 沉淀法：沉淀法： 采用某些试剂沉淀杂质或沉淀待测成分。采用某些试剂沉淀杂质或沉淀待测成分。 蒸馏法：蒸馏法： 利用待测成分或其

19、分解产物具有挥发性的特点，采利用待测成分或其分解产物具有挥发性的特点，采用蒸馏法、收集馏液进行含量测定，必须明确测定成分的结构才可用蒸馏法、收集馏液进行含量测定，必须明确测定成分的结构才可用此法。用此法。 色谱法（液色谱法（液-固萃取法），固萃取法），常用净化剂有三氧化二铝、氧化镁、净化剂有三氧化二铝、氧化镁、硅胶、活性炭、大孔树脂、离子交换树脂、硅藻土、键合相硅胶硅胶、活性炭、大孔树脂、离子交换树脂、硅藻土、键合相硅胶C18、C8等等。 其中离子交换树脂、硅藻土、键合相硅胶其中离子交换树脂、硅藻土、键合相硅胶C18、C8等目前有较多等目前有较多商品预处理柱，使用方便，操作简单，净化效率高。商

20、品预处理柱，使用方便，操作简单，净化效率高。 三、定性鉴别、检查和含量测定三、定性鉴别、检查和含量测定 1定性鉴别定性鉴别 1）性状鉴别系指中成药的形状、颜色、气味等，凡药典收载品，）性状鉴别系指中成药的形状、颜色、气味等，凡药典收载品，在药典中均有规定，可按要求进行检查。在药典中均有规定，可按要求进行检查。 2）显微鉴别）显微鉴别 因为含有中药原粉的中成药均保留中药材的显因为含有中药原粉的中成药均保留中药材的显微特征。可以通过这些特征，对中成药进行定性鉴别。微特征。可以通过这些特征，对中成药进行定性鉴别。 3）理化鉴别）理化鉴别 药典中常用的方法有：荧光法、显色法、沉淀药典中常用的方法有：荧

21、光法、显色法、沉淀法、微量升华法；纸色谱法、薄层色谱、液相色谱、气相色谱等。法、微量升华法；纸色谱法、薄层色谱、液相色谱、气相色谱等。 中药定性鉴别应选择其中主药（君药）、辅药（臣药）作为主中药定性鉴别应选择其中主药（君药）、辅药（臣药）作为主要对象要对象，其次应鉴别毒剧药及贵重药材。其次应鉴别毒剧药及贵重药材。 2检查检查 按我国药典要求，中药制剂需要检查的项目大致可分为三类： 1）污染型）污染型 中成药一般杂质检查项目有：异物、灰分、酸不溶中成药一般杂质检查项目有：异物、灰分、酸不溶性灰分、重金属、砷盐等；卫生学检查：微生物细菌检查；以及有性灰分、重金属、砷盐等；卫生学检查：微生物细菌检查

22、；以及有的产品要求农药残留量的检测。的产品要求农药残留量的检测。 2）特殊杂质型）特殊杂质型 原料药材掺假、有毒成分的限量检查原料药材掺假、有毒成分的限量检查。 3）剂型的要求检查类型（制剂通则要求检查项目）剂型的要求检查类型（制剂通则要求检查项目） 中成药一般质量要求的检查有：挥发油测定、水分测定（固体制中成药一般质量要求的检查有：挥发油测定、水分测定（固体制剂）、乙醇含量测定、总固体、相对密度、剂）、乙醇含量测定、总固体、相对密度、pH值（酊剂、药酒）、值（酊剂、药酒）、装量差异（片重差异）、崩解度（片剂、胶囊剂）、熔点测定、旋装量差异（片重差异）、崩解度（片剂、胶囊剂）、熔点测定、旋光度

23、测定等。光度测定等。 3含量测定含量测定 中成药含量测定所采用的方法除经典的重量法、容量法中成药含量测定所采用的方法除经典的重量法、容量法(包括包括中和法、容量沉淀法、络合滴定法、氧化还原法及非水溶液滴定法中和法、容量沉淀法、络合滴定法、氧化还原法及非水溶液滴定法等等)外，还可采用电位法、库伦滴定法、比色法、可见外，还可采用电位法、库伦滴定法、比色法、可见-紫外分光光紫外分光光度法、红外分光光度法、液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、度法、红外分光光度法、液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、双波长薄层扫描法等。高效液相色谱法、双波长薄层扫描法等。 1）对有效成分明确的中药制剂要

24、进行有效成分的含量测定）对有效成分明确的中药制剂要进行有效成分的含量测定。 2）大致明确有效成分，要求测定这些成分的总量。）大致明确有效成分，要求测定这些成分的总量。 3）对有效成分已知但无理想的测定方法的中药制剂，可通过测）对有效成分已知但无理想的测定方法的中药制剂，可通过测定其中某些化学成分的含量间接控制有效成分的含量。定其中某些化学成分的含量间接控制有效成分的含量。 4）对有效成分不明确的中药制剂可采用以下方法：选择可能的）对有效成分不明确的中药制剂可采用以下方法：选择可能的有效成分或主要成分（指示性成分）进行含量测定；测定药物的总有效成分或主要成分（指示性成分）进行含量测定；测定药物的

25、总固体量；选择在原料加工炮制时或制备、贮存过程中易损失、破坏固体量；选择在原料加工炮制时或制备、贮存过程中易损失、破坏的成分进行含量或限量测定。的成分进行含量或限量测定。 5）中药制剂中含有剧毒性成分则要测定其含量。）中药制剂中含有剧毒性成分则要测定其含量。 6）贵重药材在制剂中投料量应加以测定。）贵重药材在制剂中投料量应加以测定。第二章第二章 中药制剂定量分析方法中药制剂定量分析方法 第一节第一节 可见可见-紫外光谱法紫外光谱法 一、单一物质的定量一、单一物质的定量 定量依据是定量依据是Beer-Lambert定律，定律，A= lC。测定单一物质时，先。测定单一物质时，先测定物质的吸收光谱，

26、然后选择最大吸收峰的波长测定物质的吸收光谱，然后选择最大吸收峰的波长 max进行定量分进行定量分析。析。 一个物质若有几个吸收峰时，可选择吸收峰较高，在此吸收峰一个物质若有几个吸收峰时，可选择吸收峰较高，在此吸收峰处吸光度随波长变化较小，并且其它物质无吸收的波长作为定量条处吸光度随波长变化较小，并且其它物质无吸收的波长作为定量条件。件。 一般不选择光谱最左边的末端吸收峰作定量测定的波长。一般不选择光谱最左边的末端吸收峰作定量测定的波长。常用定量方法：常用定量方法： 1.对照法对照法 C样样=C标标 A样样/A标标；C标标 A样样/（A标标 C 样样）=样品样品%，C样样和和C标标分别为样品浓度

27、和标准品浓度，分别为样品浓度和标准品浓度，C 样样为样品标示浓度。为样品标示浓度。 2.标准曲线法：从标准品吸光度标准曲线法：从标准品吸光度-浓度曲线求得样品浓度。浓度曲线求得样品浓度。 二、二、 混合物的含量测定混合物的含量测定 一）一） 混合物中有混合物中有a，b两种组分，若两者的最大吸收峰不重合，两种组分，若两者的最大吸收峰不重合，且在且在a的的 1max处，处，b无吸收；在无吸收；在b的的 2max处，处，a无吸收。可分别在无吸收。可分别在 1max、 2max处用单一物质的定量方法从混合物中测定处用单一物质的定量方法从混合物中测定a、b的浓度。的浓度。 二）二） 混合物中有混合物中有

28、a，b两种组分，吸收光谱部分重叠，在两种组分，吸收光谱部分重叠，在a的的 1处，处，b无吸收；在无吸收；在b的的 2处，处，a有吸收。先在有吸收。先在 2处测定总吸收处测定总吸收Aa+b，再，再在在 1处测定处测定Aa 1；先从；先从Aa 1直接求出直接求出a的浓度，根据的浓度，根据a的浓度求出的浓度求出Aa 2。再从再从Aa+b减去减去Aa 2后求得后求得Ab 2，就可求得，就可求得b的浓度。的浓度。 （三）双波长测定法三）双波长测定法 中药制剂分析中常用的方法为等吸收波长法和系数率法。中药制剂分析中常用的方法为等吸收波长法和系数率法。 1等吸收波长法等吸收波长法 1）基本原理）基本原理 根

29、据左图选出两个波长根据左图选出两个波长 1与与 2，其选择原则，其选择原则 是干扰组分是干扰组分a在在 1与与 2处吸收度相等，即处吸收度相等，即 Aa 1= Aa 2。而待测组分。而待测组分b在在 1与与 2处的差吸处的差吸 收度收度 A应比较大，再在应比较大，再在 1与与 2处测混合组分处测混合组分 溶液的差吸度溶液的差吸度 A。 设设 1为参比波长，为参比波长， 2为测量波长，则为测量波长，则 等吸收波长法原理示意图等吸收波长法原理示意图 A=Aa+b 2 - Aa+b 1 =（Aa 2 + Ab 2）-（Aa 1 + Ab 1） =Ab 2 - Ab 1 =（ b 2 - b 1）Cb

30、L 2）应用举例）应用举例 喉痛消炎丸中靛蓝、靛玉红的测定喉痛消炎丸中靛蓝、靛玉红的测定 ）选择等吸收波长：用）选择等吸收波长：用28 g/ml的靛蓝及靛的靛蓝及靛 玉红的氯仿溶液在分光光度计上扫描，并用同玉红的氯仿溶液在分光光度计上扫描，并用同 法扫描出空白样品溶液的吸收曲线。法扫描出空白样品溶液的吸收曲线。 从左图可知靛蓝在从左图可知靛蓝在540nm、634.4nm处有合适处有合适 的等吸收波长；靛玉红却是在的等吸收波长；靛玉红却是在5142nm和和 566nm处有等吸收波长，而空白样品液在上述处有等吸收波长，而空白样品液在上述 波长处的吸收曲线几乎成一条直线、不干扰测波长处的吸收曲线几乎

31、成一条直线、不干扰测 图图2-1-3 靛蓝、靛玉红的吸收曲线靛蓝、靛玉红的吸收曲线 (1)靛蓝靛蓝(2)靛玉红靛玉红(3)无青黛样品无青黛样品 定，选取靛蓝的测定波长定，选取靛蓝的测定波长 s1566 nm、参比、参比波长波长 R1=514.2 nm。可选靛玉红的测定波长。可选靛玉红的测定波长 s2=540nm、参比波长、参比波长 R2=634.4nm。 )标准曲线：精密吸取靛蓝对照品溶液标准曲线：精密吸取靛蓝对照品溶液0.25、0.50、2.0ml；靛玉红对照品溶液靛玉红对照品溶液0.20、0.40、1.40ml，分别放入，分别放入10ml量瓶中，量瓶中，用氯仿稀释至刻度，分别在上述等吸收波

32、长处测其差吸收度：用氯仿稀释至刻度，分别在上述等吸收波长处测其差吸收度： A1=A566nm - A514.2nm ； A2=A540nm - A634.4nm ； 然后用然后用 A对对C作标准曲线；并求出其一元回归方程：作标准曲线；并求出其一元回归方程： A10.02241C1 (r11.0000) A20.04060C2 + 0.0055 (r21.0000) )含量测定：精称喉痛消炎丸细粉约含量测定：精称喉痛消炎丸细粉约0.2g于索氏提取器中，用于索氏提取器中，用氯仿提取至无蓝色，用氯仿定容于氯仿提取至无蓝色，用氯仿定容于50ml量瓶中，再精密吸取量瓶中，再精密吸取5ml置置10ml量瓶

33、中，加氯仿至刻度即为样品溶液。将样品溶液在量瓶中，加氯仿至刻度即为样品溶液。将样品溶液在 s1与与 R1，处测出处测出 A样样1值，用以上值，用以上 A1式求出靛蓝的浓度及样品中靛蓝的含量。式求出靛蓝的浓度及样品中靛蓝的含量。同样，在同样，在 s2与与 R2处测出处测出 A样样2，用以上，用以上 A2式求出靛玉红的浓度及式求出靛玉红的浓度及样品中靛玉红的含量。样品中靛玉红的含量。 2 联立方程法联立方程法 A a+b 1=Aa 1+Ab 1= a 1 CaL+ b 1 CbL A a+b 2=Aa 2+Ab 2= a 2 CaL+ b 2 CbL （四）三波长测定法四）三波长测定法 此法要求在

34、任一吸收曲线上，能找出满足下述条件的三个波长：此法要求在任一吸收曲线上，能找出满足下述条件的三个波长：即在干扰组分的吸收曲线上，与三个波长相应的点，能在一条直线即在干扰组分的吸收曲线上，与三个波长相应的点，能在一条直线上。上。 1 1基本原理基本原理 左图中左图中 1 1、 2 2、 3 3为在任一吸收曲线上，任意为在任一吸收曲线上，任意 选择的三个波长。选择的三个波长。A A1 1、A A2 2、A A3 3为在三个波长处为在三个波长处 分别测出的吸收度。分别测出的吸收度。 根据相似三角形的等比性质，可推导出下式，根据相似三角形的等比性质，可推导出下式， A= AA= A2 2 - - （m

35、 Am A1 1+nA+nA3 3）/ /（m + nm + n） = 2 2 （m 1 1 + n 3 3）/（m + n）CL 三波长分光光度法的原理三波长分光光度法的原理 说明说明AA与待测组分浓度与待测组分浓度C C成正比。成正比。 2应用举例应用举例 二陈丸中陈皮甙的测定二陈丸中陈皮甙的测定 1 1）总干扰组分的制备及其吸收光谱）总干扰组分的制备及其吸收光谱 )除去陈皮甙后，陈皮其他组分提取液的制备：用溶剂除去陈皮甙后，陈皮其他组分提取液的制备：用溶剂( (含含0.10.1氢氧化钠的氢氧化钠的7575乙醇液乙醇液) )提取陈皮粉，提取液经薄层分离，刮取提取陈皮粉，提取液经薄层分离，刮

36、取除陈皮甙以外的所有斑点洗脱，得除陈皮甙以外陈皮其他组分提取除陈皮甙以外的所有斑点洗脱，得除陈皮甙以外陈皮其他组分提取液液( (I)I)。 )二陈丸空白粉提取液的制备：按处方比例二陈丸空白粉提取液的制备：按处方比例 配制除陈皮以外的二陈丸空白粉，用上述溶配制除陈皮以外的二陈丸空白粉，用上述溶 剂提取，得二陈丸空白粉提取液剂提取，得二陈丸空白粉提取液()()。 将将(I)(I)、()()按处方比例混合，得二陈丸总干按处方比例混合，得二陈丸总干 扰成分液扰成分液()()。分光光度计分别测定陈皮甙对。分光光度计分别测定陈皮甙对 照品和照品和()()的吸收光谱。见左图。其他成分对的吸收光谱。见左图。其

37、他成分对 陈皮甙的测定有干扰，用陈皮甙的测定有干扰，用6 6批不同来源的原料批不同来源的原料按上法制备按上法制备()()，并测其吸收光谱，结果谱形相似。可采用三波长，并测其吸收光谱，结果谱形相似。可采用三波长法消除干扰法消除干扰。 2 2）选择三个测定波长）选择三个测定波长 作图法粗选，再计算精选在作图法粗选，再计算精选在()()的的 A=0A=0处，即为精选的三个波处，即为精选的三个波长：长：1 1=318.0nm=318.0nm，2 2=286.0nm=286.0nm，3 3=275.0nm=275.0nm。 3 3）标准曲线）标准曲线 配制不同浓度的陈皮甙对照品溶液，在选出的配制不同浓度

38、的陈皮甙对照品溶液，在选出的三个波长处，分别测定吸收度，并算出三个波长处，分别测定吸收度，并算出AA值，对值，对AA值与浓度值与浓度C C进进行直线回归，回归方程为：行直线回归，回归方程为： A = 9.9059C 0.0024(r = 0.9990)A = 9.9059C 0.0024(r = 0.9990) 4 4）样品测定）样品测定 精密称取二陈丸细粉约精密称取二陈丸细粉约0.1g0.1g，加，加100.0ml100.0ml上述溶上述溶剂浸泡提取剂浸泡提取1515小时，过滤，取续滤液小时，过滤，取续滤液2.0ml2.0ml，用溶剂稀释至，用溶剂稀释至5.0ml5.0ml，在选出的三波长处

39、，分别测定吸收度，计算其在选出的三波长处，分别测定吸收度，计算其AA值，再按回归方值，再按回归方程算出陈皮甙含量。本法平均回收率：程算出陈皮甙含量。本法平均回收率：98.2898.28，RSDRSD：2.122.12。 （五）差示光谱法（五）差示光谱法 1 1基本原理基本原理 差示光谱法的关键有二，其一，提供一个近似理想的参比溶液。差示光谱法的关键有二，其一，提供一个近似理想的参比溶液。其二，使待测组分发生特征光谱变化，而赋形剂或其他共有组分却其二，使待测组分发生特征光谱变化，而赋形剂或其他共有组分却不引起光谱变化，因而可消除它们的干扰。不引起光谱变化，因而可消除它们的干扰。 设设A Ax x

40、、A Ay y分别代表两种不同介质中待测组分在测定波长处的吸收分别代表两种不同介质中待测组分在测定波长处的吸收度，度，A Az z代表背景和干扰组分的吸收度，其不受测定介质改变的影响。代表背景和干扰组分的吸收度，其不受测定介质改变的影响。根据吸收度加和性原理，则根据吸收度加和性原理，则 A=AA=A样样 - - A A参参=(=(A Ax x +A+Az z)-(A)-(Ay y + A+ Az z)= A)= Ax x - A- Ay y =( =(x x - - y y)CL )CL 差示光谱中的振幅，即最大吸收与最小吸收之差值，也可进行差示光谱中的振幅，即最大吸收与最小吸收之差值，也可进

41、行定量测定，这可提高本法的专属性。定量测定，这可提高本法的专属性。 2 2应用举例应用举例 差示光谱法测定含牛黄的中成药中胆红素的含量差示光谱法测定含牛黄的中成药中胆红素的含量 1 1）测定原理）测定原理 胆红素具有高度共轭体系结构，在波长胆红素具有高度共轭体系结构，在波长453nm453nm处处为最大吸收，在可见光照射下胆红素易氧化成蓝色产物，在为最大吸收，在可见光照射下胆红素易氧化成蓝色产物，在453nm453nm处吸收度显著降低。处吸收度显著降低。 2 2）选用日光下照射）选用日光下照射3030分钟或在红外灯下照射分钟或在红外灯下照射4 4小时测小时测AA值。值。 3 3）精密称取胆红素

42、）精密称取胆红素2mg2mg于于50ml50ml棕色量瓶中，棕色量瓶中， 加入适量冷加入适量冷(10(10以下以下) )的酸性氯仿的酸性氯仿(150ml(150ml氯氯 仿中含仿中含0.05ml0.05ml浓盐酸浓盐酸) )，于冰水浴中超声振，于冰水浴中超声振 荡荡2020分钟，稀释至刻度，制成储备液。准确分钟，稀释至刻度，制成储备液。准确 吸取吸取0 0，4 4、0 08 8、1 1，2 2、1.61.6、2.0ml2.0ml储备液储备液 于于10ml10ml量瓶中，加冷酸性氯仿至刻度，测其量瓶中，加冷酸性氯仿至刻度，测其 光照前后在光照前后在453nm453nm处的吸收度。回归方程处的吸收

43、度。回归方程 胆红素在酸性氯仿溶液中的吸收光谱胆红素在酸性氯仿溶液中的吸收光谱 为为A=0.0804C + 0.00570(r=0.9995)A=0.0804C + 0.00570(r=0.9995)。 a a光照前光照前 b b光照后光照后 除光照反应外，其余操作均需避光。除光照反应外，其余操作均需避光。 4 4）分别制得六应丸、六神丸、牛黄消炎丸的空白样品对照液，）分别制得六应丸、六神丸、牛黄消炎丸的空白样品对照液，在在453nm453nm处测得各自光照前后的处测得各自光照前后的A A值，计算值，计算AA。实验表明三种成药。实验表明三种成药AA值为零或几乎为零。说明其他干扰组分在以上光照条

44、件下不干值为零或几乎为零。说明其他干扰组分在以上光照条件下不干扰胆红素的测定。扰胆红素的测定。 5 5）精密称取六应丸、六神丸各）精密称取六应丸、六神丸各60mg60mg，牛黄消炎丸，牛黄消炎丸120mg120mg置置10ml10ml带塞的试管中，准确加入冷酸性氯仿带塞的试管中，准确加入冷酸性氯仿10ml10ml，冰水浴中振荡，冰水浴中振荡2020分钟，分钟，过滤，弃去初滤液，测续滤液光照前后的过滤，弃去初滤液，测续滤液光照前后的A A值，算出值，算出AA值。由回归值。由回归方程算得样品的含量。方程算得样品的含量。 本法加样回收率：六应丸为本法加样回收率：六应丸为98.898.8，RSD=1.

45、8RSD=1.8；六神丸为；六神丸为100.7100.7，RSD=2.2RSD=2.2；牛黄消炎丸为；牛黄消炎丸为93.093.0，RSDRSD1.11.1。 （六）导数光谱法（六）导数光谱法 1 1导数光谱及其特征导数光谱及其特征 通常的吸收光谱，其吸收度是波长的函数通常的吸收光谱，其吸收度是波长的函数 A=CA=CE=CE=C （）。对波长求导，将其微分系）。对波长求导，将其微分系 数（数（d dn nA A/d/dn n）对波长扫描可得导数光）对波长扫描可得导数光 谱图。谱图。 特征：特征： (1)(1)导数光谱的阶数愈高，峰形愈尖锐且数导数光谱的阶数愈高，峰形愈尖锐且数 量亦增多。量亦

46、增多。 (2)(2)在零阶光谱的极大处，其相应的奇阶光在零阶光谱的极大处，其相应的奇阶光 谱通过零点。在零阶光谱的两拐点处，奇阶谱通过零点。在零阶光谱的两拐点处，奇阶 导数光谱为极大或极小。导数光谱为极大或极小。 (3)(3)偶阶导数光谱的形状与零阶光谱类似，偶阶导数光谱的形状与零阶光谱类似， 零阶光谱的峰值对应于偶阶导数光谱的极值，零阶光谱的峰值对应于偶阶导数光谱的极值， 零阶光谱的拐点在偶阶导数光谱中通过零点。零阶光谱的拐点在偶阶导数光谱中通过零点。 (4)(4)导数光谱谱带的极值数等于导数阶数加导数光谱谱带的极值数等于导数阶数加1 1。 高斯曲线及其一至四阶导数曲线高斯曲线及其一至四阶导

47、数曲线 导数分光光度的优点：导数分光光度的优点：a a能检出两个或两个以上的重叠吸收带；能检出两个或两个以上的重叠吸收带； b b能分辨在强吸收曲线能分辨在强吸收曲线“肩部肩部”的弱吸收带；的弱吸收带； c c能精密确定单一吸收峰位置；能精密确定单一吸收峰位置； d d能消除基线（背景）的影响；能消除基线（背景）的影响； e e能进行定量测定。能进行定量测定。 2 2基本原理基本原理 吸收光谱服从吸收光谱服从BeerBeer定律：定律： A AC CL L 根据导数光谱的定义，对上式求导，则：根据导数光谱的定义，对上式求导，则： dAdA/d=/d=（d/dd/d）CLCL；d d2 2A/d

48、A/d2 2= =（d d2 2/d/d2 2）CLCL； d dn nA A/d/dn n= =（d dn n/d/dn n）CLCL； 式 中式 中 L L 为 定 值 ， 给 定 物 质 在 特 定 波 长 处 的为 定 值 ， 给 定 物 质 在 特 定 波 长 处 的 d / d d / d 、d d2 2/d/d2 2d dn n/d/dn n也是定值，因此，也是定值，因此，dAdA/dC/dC，d d2 2A/dA/d2 2CCd dn nA A/d/dn nCC。 常用的定量参数的选择方法有：常用的定量参数的选择方法有： 1 1）峰）峰- -谷法谷法 测量相邻峰、谷之间的距离。

49、测量相邻峰、谷之间的距离。 左图中的左图中的h h1 1h h2 2( (振幅，用振幅，用D D表示表示) )。 2 2）基线法）基线法 取相邻二同向峰取相邻二同向峰( (正或倒正或倒) )的的 公切线为基线，以中间的反向峰峰尖至基线公切线为基线，以中间的反向峰峰尖至基线 的距离为测量值。左图中的距离为测量值。左图中p p1 1。 3 3）峰）峰- -零法零法 测量峰值到零线间的垂直距测量峰值到零线间的垂直距 离，左图中离，左图中p p2 2。 4 4）面积法）面积法 根据一阶或二阶导数光谱面根据一阶或二阶导数光谱面 导数光谱的测量导数光谱的测量 积，积， 进行定量测定。进行定量测定。 3 3

50、共存组分干扰吸收的消除共存组分干扰吸收的消除 1 1）一阶导数光谱法消除线性干扰吸收）一阶导数光谱法消除线性干扰吸收 A=A= CL + a + bCL + a + b dA dA/d= /d= （d/ dd/ d）CL + aCL + a 说明线性干扰在一阶导数光谱中对定量参数说明线性干扰在一阶导数光谱中对定量参数D(D(振幅振幅) )没有影响，没有影响，D D只与待测组分浓度成正比。只与待测组分浓度成正比。 D=( dAD=( dA/d)/d)峰峰 -( -( dAdA/d)/d)谷谷 =( =( d/ d)d/ d) 峰峰- (- (d/ d)d/ d) 谷谷 CLCL 2 2）高阶导数

51、光谱法消除非线性干扰吸收及用于重叠）高阶导数光谱法消除非线性干扰吸收及用于重叠峰的分离，定量峰的分离，定量 若干扰组分吸收对波长呈非线性，为一近似的二次吸收曲线，若干扰组分吸收对波长呈非线性，为一近似的二次吸收曲线，则总吸收度为则总吸收度为 A=A= CL + eCL + e2 2 + f + g + f + g 对其求一阶、二阶导数得：对其求一阶、二阶导数得： dAdA/d=/d=（d/ dd/ d）CL +eCL +e + f + f d d2 2A/dA/d2 2= =（d d2 2/ d/ d2 2）CL +eCL +e 4.4.导数光谱法中的主要参数导数光谱法中的主要参数 1)1)微

52、分阶数微分阶数(n) n(n) n的选择主要由干扰组分吸收曲线的形状而的选择主要由干扰组分吸收曲线的形状而定。定。 n n越大，分辨力愈强，但信噪比将降低。越大，分辨力愈强，但信噪比将降低。 2)2)波长间隔波长间隔() () 愈大，测量灵敏度增大，但分辨率降愈大，测量灵敏度增大，但分辨率降低，通常低，通常选选1 12nm2nm为好。为好。 3)3)中间波长中间波长( (m m) ) 通常需选两个通常需选两个m m，即，即m1m1、m2m2 。其选择。其选择原则：待测组分的导数曲线在原则：待测组分的导数曲线在m1m1、m2m2处的形状易辨认，较特征；处的形状易辨认，较特征；而干扰组分在此处的导

53、数值相等或相近。而干扰组分在此处的导数值相等或相近。 5.5.应用举例应用举例 1)1)肺露中丹皮酚含量的测定肺露中丹皮酚含量的测定 ()()干扰丹皮酚测定情况的考察：干扰丹皮酚测定情况的考察： 按处方配比，分别取药材，加水适按处方配比，分别取药材，加水适量，蒸馏提制成量，蒸馏提制成2222味药材的模拟液，以味药材的模拟液，以水为空白，分别绘制紫外吸收光谱图。水为空白，分别绘制紫外吸收光谱图。 从图中看出，牡丹皮蒸提液紫外吸从图中看出，牡丹皮蒸提液紫外吸收很强，枇杷叶和芦根蒸提液紫外吸收收很强，枇杷叶和芦根蒸提液紫外吸收较弱，干扰丹皮酚的测定，实验表明：较弱，干扰丹皮酚的测定，实验表明：丹皮酚

54、在碱性溶液中的吸收光谱发生红丹皮酚在碱性溶液中的吸收光谱发生红移，移，= 35= 352nm2nm。 1 1牡丹皮牡丹皮 2 2枇杷叶枇杷叶 3 3芦根芦根 ()()选择测定波长选择测定波长 精取丹皮酚对照液精取丹皮酚对照液2ml2ml，枇杷叶和芦根，枇杷叶和芦根蒸提液各蒸提液各10ml10ml，分别于，分别于25ml25ml量瓶中，加量瓶中，加0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠溶液至刻氢氧化钠溶液至刻度，混匀。以度，混匀。以0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠溶液为空白，绘制吸收光谱（零阶）氢氧化钠溶液为空白，绘制吸收光谱（零阶）和一阶导数光谱，如下图。按中间波长选择原则，选和一阶

55、导数光谱，如下图。按中间波长选择原则，选330330和和370nm370nm为中间波长，则测定波长为为中间波长，则测定波长为328nm328nm和和332nm332nm，368nm368nm和和372nm372nm。蒸提液在蒸提液在0.1mol0.1molL L氢氧化钠溶液中的光谱图氢氧化钠溶液中的光谱图 一阶导数光谱图一阶导数光谱图1 1肺露肺露 2 2丹皮酚丹皮酚 3 3枇杷叶枇杷叶 4 4芦根芦根 1 1丹皮酚丹皮酚 2 2枇杷叶枇杷叶 3 3芦根芦根 ()()标准曲线标准曲线 精密量取丹皮酚对照液精密量取丹皮酚对照液(0.1(0.1mg/ml)0.5mg/ml)0.5、1.01.0、3

56、.0ml3.0ml，分别于，分别于25ml25ml量瓶中，加量瓶中，加0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠溶液至刻度，氢氧化钠溶液至刻度，混匀，以混匀，以0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠溶液为空白，在测定波长处测吸收度，氢氧化钠溶液为空白，在测定波长处测吸收度，计算一系列计算一系列AA值。值。A =(AA =(A328328 - A - A332332) - (A) - (A368368 - A - A372372) )。 标准曲线的回归方程为：标准曲线的回归方程为： A = -11.08C + 0.0009 A = -11.08C + 0.0009 （r = 0.9997r =

57、0.9997） ()()样品测定样品测定 取同一批号或不同批号样品，分别精密量取取同一批号或不同批号样品，分别精密量取10ml10ml于于25ml25ml量瓶中，加量瓶中，加0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠溶液至刻度，混匀，以氢氧化钠溶液至刻度，混匀，以0.1mol/L0.1mol/L氢氧化钠溶液为空白，在测定波长处测其吸收度，算出氢氧化钠溶液为空白，在测定波长处测其吸收度，算出AA，根据标准曲线的回归方程，计算样品中丹皮酚含量。，根据标准曲线的回归方程，计算样品中丹皮酚含量。 本法平均回收率本法平均回收率99.5799.57，RSD=0.82%RSD=0.82%。 2 2）清宫冲剂中

58、胆酸的二阶导数光谱测定法）清宫冲剂中胆酸的二阶导数光谱测定法 （）干扰情况的考察）干扰情况的考察 胆酸对照液与样品的二阶导数光谱胆酸对照液与样品的二阶导数光谱显示，在显示，在397nm397nm，386nm386nm波长处有相应的吸收峰和吸收谷。阴性样品波长处有相应的吸收峰和吸收谷。阴性样品二阶导数光谱呈近乎平直线条，见下左图。猪去氧胆酸的二阶导数二阶导数光谱呈近乎平直线条，见下左图。猪去氧胆酸的二阶导数光谱将光谱将360360420nm420nm区间的吸收消除为二次无关吸收，不干扰样品中区间的吸收消除为二次无关吸收，不干扰样品中胆酸的含量测定如下中图。下右图表明，胆酸二阶导数光谱，其峰胆酸的

59、含量测定如下中图。下右图表明，胆酸二阶导数光谱，其峰- -谷振幅值谷振幅值D D与浓度具有良好的线性关系，因此，可用与浓度具有良好的线性关系，因此，可用397nm397nm，386nm386nm两波长的振幅两波长的振幅D D为定量参数，用峰为定量参数，用峰- -谷法进行测定。谷法进行测定。 样品，胆酸对照品溶样品，胆酸对照品溶 胆酸、猪去氧胆酸二胆酸、猪去氧胆酸二 对照品溶液对照品溶液 液二阶导数光谱液二阶导数光谱 阶导数光谱阶导数光谱 二阶导数光谱二阶导数光谱A A样品样品 B. B. 胆酸对照品胆酸对照品 C.C.阴性样品阴性样品 1 1胆酸胆酸 2 2猪去氧胆酸猪去氧胆酸 ()()测定条

60、件测定条件 零阶光谱扫描波长：零阶光谱扫描波长：190190550nm550nm；二阶导数；二阶导数光谱扫描波长，光谱扫描波长，360360420420nmnm；=5nm=5nm。 ()()标准曲线标准曲线 精密称定胆酸对照品约精密称定胆酸对照品约30mg30mg，置，置100ml100ml量瓶中，量瓶中，加入加入6060醋酸稀释至刻度，分别精密吸取醋酸稀释至刻度，分别精密吸取0.10.1、0.20.21.0ml1.0ml于于15ml15ml具塞刻度试管中，加具塞刻度试管中，加6060醋酸至醋酸至1.0ml1.0ml，加入稀硫酸，加入稀硫酸14140ml0ml，摇匀，摇匀，7070水浴中放置水