细胞培养基本技术介绍

1、细胞培养基本技术介绍水水的制备：水的制备： 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。子和其他的杂质。 需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水 细胞培养基应用选择细胞培养基应用选择 选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考：选择培养基没有一定的标准，有几点建议可供参考： (1 (1 ）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。咨询。 (2) (2) 其它实验室惯用的培养基

2、不妨一试，许多培养基可其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。以适合多种细胞。 (3) (3) 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选小鼠细胞株多选 RPMI1640 RPMI1640 。 (4) (4) 用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 制备1000mlRPMI1640

3、培养基RPMI1640干粉培养基（1包）蒸馏水400ml磁力搅拌至完全溶解加三蒸馏水定容至1000ml在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有孔径滤膜的过滤器除菌，并分装成200ml/瓶，-20保存备用。用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。再加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。-细胞培养液 一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性无毒性 主要作用主要作用: :防止培养基防止培养基pHpH迅速变动。在开放式培养条件迅速变动。在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了下，观察细胞时培养基脱

4、离了5%CO25%CO2的环境，的环境，CO2CO2气体气体迅速逸出，迅速逸出，pHpH迅速升高，若加了迅速升高，若加了HEPESHEPES，此时可以维持，此时可以维持左右。一般在进行克隆化培养时要添加左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPESHEPESmmol/Lmmol/L使用时可向使用时可向100ml100ml培养液中加入培养液中加入2ml 2ml 浓缩液，终浓度为浓缩液，终浓度为20mmol/L 20mmol/L 谷氨酰胺补充液谷氨酰胺补充液 谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容基中都要添

5、加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解，易降解，44下放置下放置7 7天即可分解约天即可分解约50%50%，所以都是，所以都是在使用前添加在使用前添加 配制好的培养液（含谷氨酰胺）在配制好的培养液（含谷氨酰胺）在44放置放置2 2周以上周以上时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制时，要重新加入原来量的谷氨酰胺，故需单独配制谷氨酰胺，以便临时加入培养液内谷氨酰胺，以便临时加入培养液内 使用终浓度为使用终浓度为1-4mmol/L1-4mmol/L 一般配制为一般配制为100100倍浓缩液，即浓度为倍浓缩液，即浓度为200mmol/L200mmol/L（），（），配制方法为配制方法为 ： 谷

6、氨酰胺溶于三蒸水加至谷氨酰胺溶于三蒸水加至100ml100ml即配成即配成200mmol/L200mmol/L的的溶液，充分搅拌溶解后（应加温溶液，充分搅拌溶解后（应加温3030），过滤除菌，），过滤除菌，分装小瓶，分装小瓶，-20-20保存，使用时可向保存，使用时可向100ml100ml培养液中培养液中加入谷氨酰胺浓缩液，终浓度为加入谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mmol/L 1-4mmol/L 细胞计数及活力测定实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作： 1.盖好盖玻片：取血球计数板，将特制的盖玻片盖

7、在血球计数槽上。 2.制备计数用的细胞悬液：细胞悬液到一离心管中，加入台盼蓝染液（）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。 4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，分别数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中死细胞和活细胞数。 5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度： （细胞悬液的细胞数）/ml （ 四个大格子细胞数/4)

8、 2104 说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。 公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。 公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为： （长）（宽）（高）0.1mm3 而 1ml1000mm3 欲将一般动物细胞离心下来，其欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？离心速率应为多少转速？ 欲回收动物细胞，其离心速率一般为欲回收动物细胞，其离心速率一般为300 xg (300 xg (约约1,000rpm)1,000rpm)，5 - 10 5 - 10 分钟，分钟， 过高之转速，过高之转速， 将造成细胞死亡将造成细胞死亡 细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管细胞欲冷冻保存时，细

9、胞冷冻管内应有多少细胞浓度？内应有多少细胞浓度？ 冷冻管内细胞数目一般为冷冻管内细胞数目一般为1x101x106 6 cells/ml vialcells/ml vial，融合瘤细胞则以，融合瘤细胞则以5x105x106 6 cells/ml vial cells/ml vial 为宜为宜 冷冻管应如何解冻？冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后，须立即放入取出冷冻管后，须立即放入37 37 C C 水槽水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 1 分钟分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管盖沿，否则易发生污

10、染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂全，预防冷冻管之爆裂 细胞冷冻管解冻培养时，细胞冷冻管解冻培养时， 是否是否应马上去除应马上去除DMSODMSO？ 除少数特别注明对除少数特别注明对DMSO DMSO 敏感之细胞外，敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有在解冻之后，应直接放入含有10-15ml10-15ml新新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除新鲜培养基以去除DMSO DMSO 即可，如此可避即可，如此可避

11、免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题问题培养细胞时应使用培养细胞时应使用5 % 5 % 或或10% CO210% CO2？或根本没有影响？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用一般培养基中大都使用HCOHCO3 3- -/CO/CO3 32-2-/H/H+ + 作作为为pH pH 的缓冲系统，的缓冲系统， 而培养基中而培养基中NaHCONaHCO3 3 的含量将决定细胞培养时应使用的的含量将决定细胞培养时应使用的COCO2 2 浓度浓度 当培养基中当培养基中NaHCONaHCO3 3 含量为每公升含量为每公升3.7 g 3.7 g 时，细胞培养时应使用时，细

12、胞培养时应使用10 % CO10 % CO2 2；当培；当培养基中养基中NaHCONaHCO3 3 为每公升为每公升1.5 g 1.5 g 时，时， 则则应使用应使用5 % CO5 % CO2 2 培养细胞培养细胞 悬浮性细胞应如何继代处理？悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜