网织红细胞检测进展及其临床应用

1、概述 网织红细胞网织红细胞(reticulocyte，Ret)是介于晚是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡阶段细胞，略幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡阶段细胞，略大于成熟红细胞。网织红细胞是有核红细胞刚刚大于成熟红细胞。网织红细胞是有核红细胞刚刚失去核的阶段，仍属未完全成熟的红细胞，浆内失去核的阶段，仍属未完全成熟的红细胞，浆内尚残留有嗜碱性尚残留有嗜碱性RNA，经碱性染料（如天青，经碱性染料（如天青B、煌焦油蓝或新亚甲蓝）活体染色后，在包体内可煌焦油蓝或新亚甲蓝）活体染色后，在包体内可见蓝色点状或网状结构，故名网织红细胞。见蓝色点状或网状结构，故名网织红细胞。概述 红细胞在骨髓中生成，至发育

2、为成熟红细胞，经红细胞在骨髓中生成，至发育为成熟红细胞，经历了不同阶段：干细胞、原始红细胞、早幼红细胞、中历了不同阶段：干细胞、原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞，最后发育为成熟幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞，最后发育为成熟红细胞。随着细胞的成熟，红细胞。随着细胞的成熟，RNA含量逐渐减低，至细胞含量逐渐减低，至细胞完全成熟后消失或接近消失，即红细胞中网线状结构越完全成熟后消失或接近消失，即红细胞中网线状结构越多，表示细胞越幼稚。多，表示细胞越幼稚。ICSH（国际血液学标准委员会）（国际血液学标准委员会）将将Ret分为分为4型：型：型（丝球型）、型（丝球型）、型（花冠

3、型或网型（花冠型或网型）、型）、型（破网型）、型（破网型）、型（颗粒型）。正常生理状型（颗粒型）。正常生理状态下，态下，型只存在于骨髓，型只存在于骨髓，型在外周血也很难见到，型在外周血也很难见到，型仅有少量释放到外周血，因此外周血网织红细胞计型仅有少量释放到外周血，因此外周血网织红细胞计数时以数时以型为主。型为主。网织红细胞分型ICSHICSH将网织红细胞分类四型将网织红细胞分类四型：IRF（未成熟网织红细胞比例未成熟网织红细胞比例 ）= HFR + MFRI I型（丝球型）：红细胞几乎被网织物充满，此型亦仅见于正常骨髓中。型（丝球型）：红细胞几乎被网织物充满，此型亦仅见于正常骨髓中。IIII

4、型（网型）：位于红细胞中央线团样结构，开始松散、此型大量存在于骨髓中。型（网型）：位于红细胞中央线团样结构，开始松散、此型大量存在于骨髓中。型（破网型）：网织结构稀小，呈不规律枝点状排列，外周血中可见少量。型（破网型）：网织结构稀小，呈不规律枝点状排列，外周血中可见少量。IVIV型（颗粒型）：胞浆中嗜碱物质很少，呈分散的细颗粒、短丝状，正常外周血型（颗粒型）：胞浆中嗜碱物质很少，呈分散的细颗粒、短丝状，正常外周血中的网织细胞大多见于此型。中的网织细胞大多见于此型。nnnnnHFRnMFRnLFR网织红细胞检测进展1.手工法手工法2.血细胞分析仪法血细胞分析仪法3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分

5、析仪流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪1.手工法 手工法分玻片法和试管法。由于玻片法容易使混合血液中的水手工法分玻片法和试管法。由于玻片法容易使混合血液中的水分蒸发，染色时间偏短，因此结果偏低；试管法容易掌握，重复性分蒸发，染色时间偏短，因此结果偏低；试管法容易掌握，重复性较好，必要时还可以从混合血液中再取标本重新涂片复查。试管法较好，必要时还可以从混合血液中再取标本重新涂片复查。试管法被列为手工法被列为手工法Ret计数的参考方法。按卫生部计数的参考方法。按卫生部全国临床检验操作规全国临床检验操作规程程第第2版，采用试管法用煌焦油蓝染液对血液标本进行红细胞活体版，采用试管法用煌焦油蓝染液对血液

6、标本进行红细胞活体染色、制片，选择细胞分布较均匀、厚薄适中的体尾交界处，每份染色、制片，选择细胞分布较均匀、厚薄适中的体尾交界处，每份标本油镜下标本油镜下 ，Ret6 %，计数红细胞，计数红细胞1000个；个；3% 5 %计数红细计数红细胞胞2000个；个；1 %2% 应计数红细胞应计数红细胞4000个；小于个；小于1 %计数红细胞计数红细胞10000个。个。 网织细胞的活体染色: 染色时间:28min 比例:用2%的煌焦油兰染色以滴数计1:5时,网织细胞数开始减少,1:2为最佳. 涂片部位:中部为佳. 玻片干燥程度:立即干燥者最佳.普通光学显微镜法:计数1000个RBC中的Ret,以百分数表

7、示. 传统的显微镜计数方法操作较繁琐、影响结果的因素较传统的显微镜计数方法操作较繁琐、影响结果的因素较多。近年来，国内开始使用国际血液学标准化委员会多。近年来，国内开始使用国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐的推荐的Miller窥盘进行计数，规范了计算区域，减窥盘进行计数，规范了计算区域，减少了实验误差，使结果准确性有所提高少了实验误差，使结果准确性有所提高(卫生部临检中心卫生部临检中心建议，建议，CV控制在控制在15 %之内之内)。Miller窥盘法是将一种光学窥盘法是将一种光学圆片状圆片状Miller窥盘安放在显微镜目镜中，窥盘中有面积比窥盘安放在显微镜目镜中，窥盘中有面积比例为例为1：

8、9的的2个正方形计数方格，只需计数个正方形计数方格，只需计数19小方格内小方格内的红细胞即可准确估量出整个大方格内的红细胞数量的红细胞即可准确估量出整个大方格内的红细胞数量 计算方法 1.Miller窥盘法：网织红细胞（窥盘法：网织红细胞（Retic）百分率百分率(%)= （大方格（大方格内内Retic总数）总数）/（小方格内（小方格内RBC总数总数9）100% 2.直接计数法：网织红细胞（直接计数法：网织红细胞（Retic）百分率百分率(%)= 多个视野多个视野内内Retic总数总数/多个视野内多个视野内RBC总数总数100%卫生部临床检验中心控制Ret计数CV15%需镜检的RBC数目手工法

9、网织红细胞活体染色染料评价参考值成人：成人：0.005-0.015（0.5%-1.5%）新生儿：新生儿：0.02-0.06（2%-6%）儿童：儿童：0.005-0.075（0.5%-7.5%）成人绝对值成人绝对值（24-84） 109/L 2.血细胞分析仪法 虽然仪器法虽然仪器法Ret计数有诸多优点，而且精密度明显计数有诸多优点，而且精密度明显优于手工法，但也存在一些不足优于手工法，但也存在一些不足 ：第一，所有仪器分析：第一，所有仪器分析的基本原理都是检测的基本原理都是检测Ret内内RNA 的存在量来决定其百分的存在量来决定其百分率和绝对值，当某些患者血液中有核细胞或淋巴细胞异率和绝对值，当

10、某些患者血液中有核细胞或淋巴细胞异常增加时，可导致常增加时，可导致Ret计数结果的假性增加；第二，冷计数结果的假性增加；第二，冷凝集素存在、红细胞的聚集、某些病理因素或药物都能凝集素存在、红细胞的聚集、某些病理因素或药物都能使红细胞产生自身荧光；第三，自动化分析仪结果的准使红细胞产生自身荧光；第三，自动化分析仪结果的准确性除了依赖于仪器本身的良好性能外，还应有良好的确性除了依赖于仪器本身的良好性能外，还应有良好的质控物随时检测仪器的状态。另外，仪器成本高、价格质控物随时检测仪器的状态。另外，仪器成本高、价格贵，基层医疗单位投入较为困难。贵，基层医疗单位投入较为困难。 说明:虽然大多数仪器都利用

11、了流式细胞技术,但它们在应用的染料,检测技术方面还是有各自的特点.通常荧光的强度,光吸收量,和光散射量与网织细胞的RNA含量成正比.仪器型号仪器型号处理处理染色染色检测技术检测技术Bayer ADVIA 120活体Oxazine 750光吸收Bayer H*3活体Oxazine 750光吸收Abbott CellDyn CD3200活体新亚甲蓝光散射Abbott CellDyn CD3500活体新亚甲蓝光散射Abbott CellDyn CD3700活体新亚甲蓝光散射Abbott CellDyn CD4000荧光CD4K 530荧光法Becton Dickison ReticCount FAC

12、SCount 荧光噻唑橙荧光法Beckman Coulter STKS活体新亚甲蓝VCSBeckman Coulter GENS活体新亚甲蓝VCSSysmex XE2100荧光聚次甲基荧光染料光散射ABX Pentra 120 Retic荧光噻唑橙光散射3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪 流式细胞仪流式细胞仪(flowcytometry，FCM)是一种多用是一种多用途的精密分析仪器，应用派若宁、吖啶橙、噻唑橙等途的精密分析仪器，应用派若宁、吖啶橙、噻唑橙等这些特殊的荧光染料与这些特殊的荧光染料与Ret中的中的RNA结合，当结合，当FCM 发发出的激光照射于细胞上时，根据细胞能否发射出特定出

13、的激光照射于细胞上时，根据细胞能否发射出特定颜色的荧光，通过单参数定量测定颜色的荧光，通过单参数定量测定RNA，从而精确测，从而精确测定定Ret占成熟红细胞的比率。还可根据激光照射后发射占成熟红细胞的比率。还可根据激光照射后发射出的荧光强度，或光吸收量大小、光散射量多少等参出的荧光强度，或光吸收量大小、光散射量多少等参数的比例关系对数的比例关系对Ret成熟程度进行分群，将其划分为低成熟程度进行分群，将其划分为低荧光强度网织红细胞荧光强度网织红细胞(LFR)、中荧光强度网织红细胞、中荧光强度网织红细胞(MFR)、高荧光强度网织红细胞、高荧光强度网织红细胞(HFR)。3.流式细胞仪法和专用网织红细

14、胞分析仪 FCM 测定精密度明显高于手工法测定精密度明显高于手工法36倍，倍，可在数秒中检测可在数秒中检测20000个以上的红细胞，如个以上的红细胞，如Ret在在1.76.6 %，其平均，其平均CV值在值在4.3 %。不足之处，流式细胞仪计数不足之处，流式细胞仪计数Ret受受HOWELLJolly小体、疟原虫和血小板等干扰。小体、疟原虫和血小板等干扰。6 6项网织红系参数项网织红系参数网织红细胞百分比网织红细胞百分比RET%RET%网织红细胞数网织红细胞数RET#RET#未成熟网织红细胞比例未成熟网织红细胞比例IRFIRF低荧光强度网织红细胞比率低荧光强度网织红细胞比率LFRLFR中荧光强度网

15、织红细胞比率中荧光强度网织红细胞比率MFRMFR高荧光强度网织红细胞比率高荧光强度网织红细胞比率HFRHFRRBCLFRMFRWBCPLT-OHFRRET%=RET# / RET%=RET# / RBC-ORBC-ORET# =RET# =RBC-ORBC-O* *RET% RET% IRF=MFR+HFRIRF=MFR+HFRLFR=LFR#/ RET# -OLFR=LFR#/ RET# -OMFR=MFR#/ RET# -OMFR=MFR#/ RET# -OHFR=HFR#/ RET# -OHFR=HFR#/ RET# -Ol RET%-RET%-网织红细胞占全部红细胞的比率网织红细胞占全

16、部红细胞的比率l RET#-RET#-网织红细胞绝对数目网织红细胞绝对数目l IRF-IRF-未成熟网织红细胞比例未成熟网织红细胞比例=HFR+MFR=HFR+MFRl LFRIVLFRIV型网织红细胞型网织红细胞l MFRIIIMFRIII型网织红细胞型网织红细胞l HFRIHFRI型和型和IIII型网织红细胞型网织红细胞小结网织红细胞计数方法学评价临床意义临床意义 1）评价骨髓增生能力，判断贫血类型）评价骨髓增生能力，判断贫血类型 再障再障时，明显降低。绝对值低于时，明显降低。绝对值低于5109/L可做为急性再障可做为急性再障的辅助诊断指标。的辅助诊断指标。失血、多数失血、多数溶血性贫血溶

17、血性贫血患者网织红细胞可明显高于正常。患者网织红细胞可明显高于正常。营养不良性贫血营养不良性贫血在治疗前网织红细胞可保持正常、轻度升在治疗前网织红细胞可保持正常、轻度升高或降低。高或降低。（2 2）评价疗效）评价疗效网织红细胞反应：网织红细胞反应：IDA或巨幼细胞贫血分别给予铁剂、维或巨幼细胞贫血分别给予铁剂、维生素生素B12或叶酸治疗或叶酸治疗23d后，网织红细胞计数值开始上升，后，网织红细胞计数值开始上升，710d达到最高达到最高(10%左右左右)；两周以后逐渐降至正常水平，；两周以后逐渐降至正常水平，红细胞、血红蛋白开始升高。红细胞、血红蛋白开始升高。骨髓移植、骨髓移植、EPO治疗后：治

18、疗后：若骨髓开始恢复造血功能，若骨髓开始恢复造血功能，RMI升高，网织红细胞计数值上升。升高，网织红细胞计数值上升。（3 3）放、化疗监测）放、化疗监测 机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制，早期机体接受放、化疗后，如出现骨髓抑制，早期HFR和和MFR降低，然后才检测到网织红细胞的降低。而停止放、化疗，降低，然后才检测到网织红细胞的降低。而停止放、化疗，骨髓功能恢复后，又见上述指标依次上升。可指导临床医骨髓功能恢复后，又见上述指标依次上升。可指导临床医师适时调整治疗方案，避免造成严重的骨髓抑制。师适时调整治疗方案，避免造成严重的骨髓抑制。网织红生成指数网织红生成指数（Reticulocyte p

19、roduction index,RPI） RPI=RPI=病人网织红细胞（病人网织红细胞（% %）/ /2 2 * * 病人病人HCT/HCT/正常人正常人HCTHCT（男男0.450.45，女，女0.400.40） 临床应用：临床应用： 3 3提示溶血性贫血或急性失血性贫血；提示溶血性贫血或急性失血性贫血；网织红细胞检测的临床应用 Ret计数及其各种参数计数及其各种参数(IRF、RMI、MRV、RPI等等)在贫血的诊治、骨髓移植、在贫血的诊治、骨髓移植、肿瘤的放化疗和药物疗效检测等方面具肿瘤的放化疗和药物疗效检测等方面具有重要参考价值。有重要参考价值。1网织红细胞计数的应用 贫血的恢复是通过

20、骨髓释放红细胞生成素贫血的恢复是通过骨髓释放红细胞生成素(EPO)完成的，完成的，Ret增加可被看成是骨髓造血功能对贫血的增加可被看成是骨髓造血功能对贫血的正常反应。失血性贫血时患者正常反应。失血性贫血时患者Ret各项指标会显著增各项指标会显著增高，失血高，失血510 d内内Ret可达高峰，出血停止后可达高峰，出血停止后2周可周可恢复正常，临床上可应用此参数和特点来判别出血恢复正常，临床上可应用此参数和特点来判别出血是否停止；缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血时也可见是否停止；缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血时也可见患者患者Ret轻度增加。轻度增加。Ret降低主要和造血功能减低有降低主要和造血功能减低有关，

21、典型病例为原发性再生障碍性贫血、溶血性再关，典型病例为原发性再生障碍性贫血、溶血性再生障碍性危象；此外还有急性白血病、继发性再生生障碍性危象；此外还有急性白血病、继发性再生障碍性贫血、化疗和放疗引起的骨髓造血功能抑制障碍性贫血、化疗和放疗引起的骨髓造血功能抑制或减退等或减退等。2网织红细胞生成指数(RPI)的应用 RPI代表网织红细胞的生成相当于正常代表网织红细胞的生成相当于正常人的多少倍。不同生理、病理情况下，人的多少倍。不同生理、病理情况下，Ret从骨髓释放人外周血所需时间不同，故从骨髓释放人外周血所需时间不同，故Ret计数值不能确切反映骨髓红细胞系统造血计数值不能确切反映骨髓红细胞系统造

22、血功能，还应考虑功能，还应考虑Ret生存期限。通常生存期限。通常Ret生生存期限约为存期限约为2d，若未成熟网织红细胞提前，若未成熟网织红细胞提前释放入血，释放入血，Ret生存期限将延长，为了纠正生存期限将延长，为了纠正网织红细胞提前释放引起的偏差，用网织红细胞提前释放引起的偏差，用RPI来来反映反映Ret生成速率。生成速率。 2网织红细胞生成指数(RPI)的应用 RPI= RET% 被测被测HCT/ 正常人正常人HCT 1/ RET 成熟天数成熟天数。释放入外周血的网织红细释放入外周血的网织红细胞越趋于幼稚，其成熟时间越长。由于网织红胞越趋于幼稚，其成熟时间越长。由于网织红细胞体积大于成熟红

23、细胞，大量网织红细胞的细胞体积大于成熟红细胞，大量网织红细胞的提前释放在某种程度上影响血细胞比容的测定提前释放在某种程度上影响血细胞比容的测定结果。经观察，网织红细胞成熟时间与结果。经观察，网织红细胞成熟时间与Hct存存在下列关系在下列关系 2网织红细胞生成指数(RPI)的应用 RPI在估计红细胞生成有效性和贫血起在估计红细胞生成有效性和贫血起因的分类方法中起到重要作用。因的分类方法中起到重要作用。Kinetic等等应用应用RPI较为准确地表达出较为准确地表达出Ret的成熟状态，的成熟状态，从而对贫血的类型进行划分，如健康者平均从而对贫血的类型进行划分，如健康者平均RPI为为1，当，当RPI3

24、时表示红细胞生成增加，时表示红细胞生成增加，如溶血性贫血和治疗后的营养性贫血；而如溶血性贫血和治疗后的营养性贫血；而RPI2时为红细胞生成减少，如缺铁性贫血；时为红细胞生成减少，如缺铁性贫血；对于对于EPO缺乏、无效造血等情况时，缺乏、无效造血等情况时，RPI多多在在23之间，之间，Kinetic法则还无法确定。法则还无法确定。3网织红细胞成熟度(IRF)的应用 IRF为不成熟的为不成熟的Ret与总与总Ret的比值，健康者平均值为的比值，健康者平均值为0.22，参考范围参考范围0.10.38，IRF越大表示不成熟的越大表示不成熟的Ret的数量越多。这的数量越多。这种幼稚种幼稚Ret水平的改变一

25、般比患者水平的改变一般比患者HGB、血小板、白细胞和临床、血小板、白细胞和临床症状的变化出现更早。症状的变化出现更早。IRF和和HFR的增高在很多白血病患者化疗的增高在很多白血病患者化疗中是与粒细胞反应一致的指标和骨髓移植后恢复的第一信号中是与粒细胞反应一致的指标和骨髓移植后恢复的第一信号 。IRF与与Ret#和和RPI呈一弱的、显著的正相关：呈一弱的、显著的正相关：IRF增加增加(0.23)，一，一般伴有般伴有Ret#增加，提示患者对于贫血有足够的红系反应；若增加，提示患者对于贫血有足够的红系反应；若IRF0.23，且，且RPI2，则说明红系造血活性下降，则以慢性肾功能，则说明红系造血活性下

26、降，则以慢性肾功能不全居多；不全居多；Ret#正常或略低，正常或略低，RPI2，但，但IRF0.23，见于急性感，见于急性感染、镰状细胞性贫血危象、妊娠和染、镰状细胞性贫血危象、妊娠和MDS等状况。等状况。IRF是评价贫血是评价贫血红系增生活性的一项新的有用的指标，红系增生活性的一项新的有用的指标，IRF结合结合Ret#和和RPI可以可以为进一步阐明贫血分类提供有价值的信息。为进一步阐明贫血分类提供有价值的信息。用于促红细胞生成素贫血治疗 对溶贫患者重组人红细胞生成素对溶贫患者重组人红细胞生成素( (rHuEPOrHuEPO) ) 治疗过程中，给予适量铁剂补治疗过程中，给予适量铁剂补充时，充时

27、，HFRHFR 的变化的变化都要比传统的红细胞和铁代谢参数更为显著，可作为诊都要比传统的红细胞和铁代谢参数更为显著，可作为诊断缺铁性红细胞断缺铁性红细胞的可的可靠参数，也可以对溶血患者在利用靠参数，也可以对溶血患者在利用rHuEPOrHuEPO 治疗过程中治疗过程中的反应进的反应进行监测行监测 观察贫血疗效观察贫血疗效 缺铁性贫血或者巨幼细胞性贫血有效治疗后缺铁性贫血或者巨幼细胞性贫血有效治疗后2 23 3天后天后IRFIRF达到高峰达到高峰2 23 3天后天后RetRet开始上升开始上升贫血的分型诊断及治疗监测骨髓移植后造血功能恢复的监测 IRFIRF是最早出现的骨髓造血功能恢复的敏感指标（

28、外周血粒细胞计数和是最早出现的骨髓造血功能恢复的敏感指标（外周血粒细胞计数和血小板用于移植监测均不理想）血小板用于移植监测均不理想） 网织红细胞计数是一个独立监测骨髓造血恢复的附加参网织红细胞计数是一个独立监测骨髓造血恢复的附加参数：如第数：如第21 d 21 d RET# 15RET# 1510109 9/L /L ，常表示无移植并发症，常表示无移植并发症, ,而感染和输血都不会影响网而感染和输血都不会影响网织红细胞计数。但若织红细胞计数。但若 15 1510109 9/L /L 并伴有中性粒细胞和血小板的上并伴有中性粒细胞和血小板的上升，升，可可能提示骨髓移植失败能提示骨髓移植失败。放、化疗对造血功能影响的监测 在癌症化疗过程中，在癌症化疗过程中，IRFIRF是反映骨髓抑制和恢复的一项非常敏感的指是反映骨髓抑制和恢复的一项非常敏感的指标标 在骨髓完全受抑制阶段，在骨髓完全受抑制阶段，IRFIRF可降为零；可降为零； 化疗后骨髓受到抑制，早期恢复时，化疗后骨髓受到抑制，早期恢复时，IRFIRF首先升高，并明显高于正常，首先升高，并明显高于正常，而网织红细胞计数升高得较晚。而网织红细胞计数升高得较晚。用于促红细胞生成素贫血治疗 对溶贫患者重组人红细胞生成素对溶贫患者重组人红细胞生成素( (r