生物分离蛋白纯化手册最终版

1、Reporter：Yanping Yuan Shuangshuang Zhang Ruru Huo Chunyan Hu Lili Jiang Protein Purification Handbook 蛋白纯化蛋白纯化ContentuIntroduction 介介绍绍uBefore Purification 纯纯化前的准化前的准备备uStrategies 纯纯化策略化策略uPurification of recombinant and native Protein 纯化纯化实例实例蛋白分子生物学特性蛋白分离液相色谱原理ContentuIntroduction 介介绍绍uBefore Puri

2、fication 纯纯化前的准化前的准备备uStrategies 纯纯化策略化策略uPurification of recombinant and native Protein 纯化纯化实例实例开始开始纯化之前纯化之前 -有效的分离工艺有效的分离工艺明确纯化目标l纯度纯度：根据产品的用途来确定l产量产量：l活性活性：能够使蛋白降解或失活或干扰分析结果的杂质应尽 可能早的去除；友好温和的环境l经济性经济性：下游的生产过程在限定的经济框架里完成l安全问题安全问题：生物制药方面，例如去除病原体、热原、免疫原等污染物和致癌的危害物质。开始纯化之前开始纯化之前建立检测分析方法建立检测分析方法 评价纯化效

3、果；优化纯化方法l目标蛋白特异性检测快速可靠的活性检测活性检测方法纯度测定纯度测定方法： SDS-PAGE、毛细管电泳法、反相色谱法、质谱法总蛋白量测定总蛋白量测定： Lowry或Bradford（脂类含量高的样品）分析方法l主要杂质的分析和检测将蛋白纯化到某种水平，存放一段时间后用SDS-PAGE分析，检查蛋白酶的切割作用。对实验进行适当地质控，包括对蛋白质生物活性的分析，将会指示杂质是否会干扰研究结果样品预处理样品提取和样品提取和澄清澄清清液-胞外产物碎片分离（离心、微滤、膨胀床吸附） 细胞分离（离心、微滤）细胞-胞内产物细胞破碎（高压匀浆、珠磨）样品原料包涵体溶解（加变性剂、表面活性剂）

4、复性（稀释、透析、色谱）CIPP样品提取和澄清样品提取和澄清样品澄清样品澄清：澄清方法澄清方法适用范围适用范围离心去除脂类和颗粒状物质超滤去除盐类；浓缩样品过滤去除颗粒物质；适于小体积样品凝胶过滤小体积或大体积样品的快速处理；分子量5000的样品的除盐分段沉淀实验室规模分离和澄清；部分纯化样品，具有浓缩效果； 膨胀床吸附适用于大规模的重组蛋白和单克隆抗体纯化蛋白纯化的原则u使处理使处理样品的样品的最小化，最小化，避免避免过多的过多的步骤；步骤；u尽可能少地使用添加剂，干扰蛋白活性；尽可能少地使用添加剂，干扰蛋白活性；u尽早的去除对样品活性有影响尽早的去除对样品活性有影响的杂质的杂质；u每每一操

5、作单元采用不同的纯化技术，充分利用一操作单元采用不同的纯化技术，充分利用样品的特性；样品的特性；u保持简单化！保持简单化！步骤越少，收率越高步骤越少，收率越高第一：各个参数达到一个平衡：第一：各个参数达到一个平衡：第二：纯化每一步对各个参数要求不一样；第二：纯化每一步对各个参数要求不一样；第三：单独追求一个指标最大化，会导致整个纯化步骤受到影响；第三：单独追求一个指标最大化，会导致整个纯化步骤受到影响；三三步纯化步纯化( (CIPP)CIPP)Three Phase Strategy粗纯粗纯中度纯化中度纯化精纯精纯粗纯中度纯化精细纯化粗纯(capture) 目标：浓缩、提取、稳定化；目标：浓缩

6、、提取、稳定化； 要求：快速地将目标蛋白转移和要求：快速地将目标蛋白转移和 浓缩到保持它活性的环境中；浓缩到保持它活性的环境中； 技术的选择技术的选择: 高高的选择性、对目标蛋白高的容量的选择性、对目标蛋白高的容量 离子交换离子交换(IEC)、亲和色谱、亲和色谱(AC) 对目标蛋白很强的结合作用和尽可能少的结对目标蛋白很强的结合作用和尽可能少的结合各种污染物合各种污染物（At best, significant removal of other critical contaminants（关键杂质关键杂质） can also be achieved.） 中度纯化中度纯化(capture(cap

7、ture) ) 目标：目标：进一步进一步纯化纯化、浓缩、去除大浓缩、去除大体积体积的污染物的污染物（ other proteins, nucleic acids, endotoxins and viruses（病毒）（病毒）)洗脱条件优化洗脱条件优化Use a technique with a complementary selectivity to that which was used for the capture step.精细精细纯化纯化( (Polishing) )目标：去除痕量杂质，调整目标：去除痕量杂质，调整PH、盐浓度以及、盐浓度以及添加剂的浓度以便于储存添加剂的浓度以便于储

8、存。得到较高的纯度。得到较高的纯度。The technique chosen must discriminate between the target protein and any remaining contaminants.efficiency medium with small, uniform bead sizes.设计合理的纯化路线设计合理的纯化路线同一技术的不同阶段-离子交换DAOCS-去乙酰氧化头孢菌素合成酶了解目标蛋白特性注注：pHpIpHpI粒径选择粒径选择高盐高盐二硫苏糖醇以可溶性形式在大肠杆菌的细胞质上表达的重组蛋白！以可溶性形式在大肠杆菌的细胞质上表达的重组蛋白！DA

9、OCS-处理注意事项 在所有缓冲液中加入在所有缓冲液中加入DTT使半胱氨酸残基保持还使半胱氨酸残基保持还原状态，防止氧化；原状态，防止氧化； 加入加入PMSF,EDTA等以防止蛋白酶解；等以防止蛋白酶解； 样品预处理时尽量保持低温；样品预处理时尽量保持低温； 用用SDS-PAGE检查每一组分中的检查每一组分中的DAOCS； 总总产品通过酶活来确认生物活性产品通过酶活来确认生物活性样品预处理样品预处理 细菌菌体悬浮在裂解缓冲液中细菌菌体悬浮在裂解缓冲液中 50mM Tris-HCl,1mM EDTA,2mM DTT 0.2M苯甲脒苯甲脒-HCl，0.2mM PMSF, pH=7.51%链霉素硫酸盐和链霉素硫酸盐和0