第二章1 柱色谱

1、 第二章第二章 色谱分析色谱分析p柱色谱柱色谱p纸色谱、薄层色谱纸色谱、薄层色谱p气相色谱气相色谱p高效液相色谱高效液相色谱1 色谱法概论色谱法概论1.1 色谱分析法的发展概况色谱分析法的发展概况(1)色谱法（色谱法（chromatography）：是一种利用物质）：是一种利用物质的物理化学性质建立起来的分离、分析方法。广的物理化学性质建立起来的分离、分析方法。广泛用于复杂化合物的分离分析。泛用于复杂化合物的分离分析。 当流动相流过含有样品的固定相时，各组分当流动相流过含有样品的固定相时，各组分以不同的速度移动，从而达到分离。固定相可以以不同的速度移动，从而达到分离。固定相可以是固体，也可以是

2、以被固体或凝胶所支持的液体是固体，也可以是以被固体或凝胶所支持的液体，可以装入柱中，也可以展成薄层或涂成薄膜。，可以装入柱中，也可以展成薄层或涂成薄膜。流动相可以是液体，也可以是气体。流动相可以是液体，也可以是气体。色谱法的特点：选择性高；灵敏度高，样品色谱法的特点：选择性高；灵敏度高，样品用量少；分离效率高，分离速度快；应用用量少；分离效率高，分离速度快；应用范围广。范围广。 实质：分离实质：分离目的：目的：定性分析：出峰时间定性分析：出峰时间定量分析：峰面积定量分析：峰面积纯度鉴定：出峰数量纯度鉴定：出峰数量 （2）色谱法的由来：1906年由俄国植物学家Tsweet创立。首先用于植物色素分

3、离。(3)色谱法的发展色谱法的发展1931年德国的年德国的Kuhn和和Lederer重复了重复了Tswett的某些实验，用氧化铝和碳酸钙的某些实验，用氧化铝和碳酸钙分离了分离了-，-，和，和-胡萝卜素，此后用这胡萝卜素，此后用这种方法分离了种方法分离了60多种这类色素。多种这类色素。1938年年Kuhn因研究类胡萝卜素和维生素获诺贝因研究类胡萝卜素和维生素获诺贝尔化学奖。尔化学奖。30、40年代相继有了薄层色谱法和纸色年代相继有了薄层色谱法和纸色谱法。谱法。Martin和和Synge在在1940年提出液液分配色谱法年提出液液分配色谱法，即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某种有即固定相是吸附在

4、硅胶上的水，流动相是某种有机溶剂。机溶剂。1941年年Martin和和Synge提出用气体代替提出用气体代替液体作流动相的可能性，液体作流动相的可能性，11年之后年之后James和和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法，因而获得了方法，因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。50年代后期出现了气相色谱年代后期出现了气相色谱-质谱联用技术。质谱联用技术。60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，发展了高效液相色谱法。谱，发展了高效液相色谱法。1.2 色谱法基本原理色谱法基本原理 色谱分

5、析的目的：将样品中各组分彼此色谱分析的目的：将样品中各组分彼此分离。分离。 两峰间的距离必须足够远，两峰间的距两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相中的分配系数决定的，离是由组分在两相中的分配系数决定的，与色谱过程的热力学性质有关。与色谱过程的热力学性质有关。 两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，仍然不能分离。峰的宽，以致彼此重叠，仍然不能分离。峰的宽窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为宽窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。 1.3 色谱法分类色谱法分类a 按两相

6、分子的聚集状态分按两相分子的聚集状态分 流动相流动相 固定相固定相 类型类型 液体液体 固体固体 液液-固色谱固色谱 液体液体 液体液体 液液-液色谱液色谱 气体气体 固体固体 气气-固色谱固色谱 气体气体 液体液体 气气-液色谱液色谱 b 按固定相的使用形式分按固定相的使用形式分柱色谱：柱色谱： 填充柱色谱、毛细管柱色谱填充柱色谱、毛细管柱色谱 平面色谱：平面色谱： 纸色谱、薄层色谱、高分子薄纸色谱、薄层色谱、高分子薄膜色谱膜色谱c 按分离机制分按分离机制分：v分配色谱分配色谱(partition chromatography)：固定相是固定液，利用固定液对各组分分配系数的大小不同而实现分离

7、。v吸附色谱吸附色谱（adsorption chromatography）：利用吸附剂对各组分的吸附力大小不同而实现分离。v离子交换色谱离子交换色谱(ion exchange chromatography，IEC)：利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而实现分离。v空间排阻色谱空间排阻色谱（steric exclusion chromatography，SEC）：以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同实现物质分离。v亲和色谱亲和色谱：利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力实现生物分子的分离纯化。 2 柱色谱柱色谱2.1 吸附柱色谱吸附柱色谱

8、是利用吸附剂对不同物质的吸附力不是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。同而使混合物中各组分分离的方法。 特点：吸附剂来源丰富，价格低廉，特点：吸附剂来源丰富，价格低廉，易再生，装置简单，具较高分辨率，应用易再生，装置简单，具较高分辨率，应用广泛。广泛。a 原理原理 吸附作用：固体表面的分子与固体内吸附作用：固体表面的分子与固体内部分子所受的吸引力不相等。部分子所受的吸引力不相等。 吸附、解吸、吸附、解吸、 再吸附、再解吸的过程再吸附、再解吸的过程b 洗脱方法与洗脱曲线洗脱方法与洗脱曲线溶剂洗脱法：采用一种或几种混合溶剂作为洗脱剂。溶剂洗脱法：采用一种或几种混合溶剂作为

9、洗脱剂。置换法：所用洗脱剂是一种溶液，该溶液中含有吸附置换法：所用洗脱剂是一种溶液，该溶液中含有吸附力比被吸附物更强的物质。力比被吸附物更强的物质。前缘洗脱法：连续向吸附柱内加入样品溶液，即洗脱前缘洗脱法：连续向吸附柱内加入样品溶液，即洗脱剂为样品溶液本身。剂为样品溶液本身。溶剂洗脱法的洗脱曲线溶剂洗脱法的洗脱曲线置换法的洗脱曲线置换法的洗脱曲线前缘洗脱法的洗脱曲线前缘洗脱法的洗脱曲线c 吸附剂和洗脱剂的选择吸附剂和洗脱剂的选择 吸附剂的选择：是吸附层析的关键。吸附剂的选择：是吸附层析的关键。 分为无机分为无机(氧化铝、活性炭、硅胶、碳氧化铝、活性炭、硅胶、碳酸盐、白土等酸盐、白土等)和有机吸

10、附剂和有机吸附剂(蔗糖、乳糖蔗糖、乳糖、淀粉、纤维素等、淀粉、纤维素等)。 一般来说，非极性物质易被非极性表面一般来说，非极性物质易被非极性表面吸附，极性物质易被极性表面吸附，溶液吸附，极性物质易被极性表面吸附，溶液中溶解度越大的溶质越难被吸附。中溶解度越大的溶质越难被吸附。选择吸附剂时，注意选择吸附剂时，注意:r吸附剂应有适当的吸附力，表面积大；吸附剂应有适当的吸附力，表面积大；r颗粒均匀，在操作时稳定，不会破裂；颗粒均匀，在操作时稳定，不会破裂；r对被吸附物的吸附应是可逆的，即在一定条件下对被吸附物的吸附应是可逆的，即在一定条件下可以解吸，以便洗脱；可以解吸，以便洗脱；r对被分离物有足够的

11、分辨力，即对不同物质的吸对被分离物有足够的分辨力，即对不同物质的吸附力有所不同；附力有所不同；r吸附剂不应含有杂质，否则需经预处理后使用。吸附剂不应含有杂质，否则需经预处理后使用。如：如：氧化铝于氧化铝于400高温下加热高温下加热6h，除去吸附的水分。，除去吸附的水分。 活性炭于活性炭于150 加热干燥加热干燥45h，除去被吸附的气体。，除去被吸附的气体。洗脱剂选择洗脱剂选择:考虑样品在溶剂中的溶解度；考虑样品在溶剂中的溶解度；溶剂一般需无水溶剂，而且不与水互溶；溶剂一般需无水溶剂，而且不与水互溶；溶剂的沸点要适宜，一般以溶剂的沸点要适宜，一般以4080为宜；为宜；不与吸附剂起化学反应，不会使

12、吸附剂溶解；不与吸附剂起化学反应，不会使吸附剂溶解；洗脱剂的纯度要高，免受杂质影响；洗脱剂的纯度要高，免受杂质影响；当一种溶剂对某一物质吸附作用过强时，洗脱困当一种溶剂对某一物质吸附作用过强时，洗脱困难，过弱时不能产生满意的色谱图，可采用多元难，过弱时不能产生满意的色谱图，可采用多元混合溶剂系统，调整洗脱能力。混合溶剂系统，调整洗脱能力。3 分配色谱分配色谱 是利用各组分的分配系数不同而实现是利用各组分的分配系数不同而实现分离的方法。分离的方法。v分配系数：一种溶质在两种互不相溶的分配系数：一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度

13、比值。在层析条件确定后溶剂中的浓度比值。在层析条件确定后分配系数是一常数。分配系数是一常数。 组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度Kv固定相：多孔性固体支持物（如滤纸、硅固定相：多孔性固体支持物（如滤纸、硅胶、纤维素粉、硅藻土等）吸着一种溶剂胶、纤维素粉、硅藻土等）吸着一种溶剂，此溶剂在层析过程中始终固定在多孔支，此溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。持物上。v流动相：与固定相溶剂互不相溶的溶剂，流动相：与固定相溶剂互不相溶的溶剂，可沿固定相流动。可沿固定相流动。 当混合物在流动性携带下通过固定相当混合物在流动性携带下通过固定相时，由于各组分的分配系数不同，经过多时，由于各组分的分配系

14、数不同，经过多次分配、再分配，分配系数小的组分先流次分配、再分配，分配系数小的组分先流出，分配系数大的组分后流出。出，分配系数大的组分后流出。4 离子交换柱层析离子交换柱层析 是利用离子交换剂上的可解离基团（是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。到分离目的的一种层析分离方法。4.1 离子交换剂离子交换剂 是含有若干活性基团的不溶性高分子是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制上引入若干可解离基团（活性

15、基团）而制成。成。t按活性基团的性质不同，离子交换剂分为按活性基团的性质不同，离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。阳离子交换剂和阴离子交换剂。 引入酸性基团的交换剂可离解出引入酸性基团的交换剂可离解出H+，与其它阳离子交换，属于阳离子交换剂。与其它阳离子交换，属于阳离子交换剂。 引入含氨基碱性基团的交换剂，可与引入含氨基碱性基团的交换剂，可与OH-结合后，与其他阴离子交换，属于阴结合后，与其他阴离子交换，属于阴离子交换剂。离子交换剂。 4.2 离子交换柱层析操作离子交换柱层析操作选择树脂选择树脂预处理预处理装柱定型装柱定型上柱上柱洗脱收集洗脱收集再生再生n选择树脂：阳离子只能被阳离子交换

16、剂吸附，反之选择树脂：阳离子只能被阳离子交换剂吸附，反之；亲和力大的易于吸附，难于洗脱，亲和力小的难；亲和力大的易于吸附，难于洗脱，亲和力小的难于吸附，易于洗脱；相对分子质量小的物质用交联于吸附，易于洗脱；相对分子质量小的物质用交联度高的树脂进行交换，分子较大的宜用交联度低的度高的树脂进行交换，分子较大的宜用交联度低的交换树脂，高分子胶体物质宜用纤维素类交换剂。交换树脂，高分子胶体物质宜用纤维素类交换剂。n预处理：使用前用水浸泡预处理：使用前用水浸泡2h以上使之充分吸水膨胀以上使之充分吸水膨胀。如使用几次后，杂质增加，一般用酸碱处理。如使用几次后，杂质增加，一般用酸碱处理。n装柱：交换剂必须在

17、柱内分布均匀，严防有气泡或装柱：交换剂必须在柱内分布均匀，严防有气泡或裂缝产生。干法和湿法。裂缝产生。干法和湿法。上柱：离子交换剂经转型成所需离子，用上柱：离子交换剂经转型成所需离子，用溶剂或缓冲液进行平衡。然后将样品液加溶剂或缓冲液进行平衡。然后将样品液加进交换柱。上柱时要注意样品的进交换柱。上柱时要注意样品的pH值、温值、温度、离子浓度和流速等。度、离子浓度和流速等。洗脱和收集：原则上洗脱液应含有与交换洗脱和收集：原则上洗脱液应含有与交换剂的亲和力较大的离子，以便把吸附在交剂的亲和力较大的离子，以便把吸附在交换剂上的样品离子交换下来。换剂上的样品离子交换下来。梯度洗脱法：按一定规律变化的洗

18、脱液进梯度洗脱法：按一定规律变化的洗脱液进行洗脱。浓度梯度，行洗脱。浓度梯度，pH梯度。梯度。再生：先经酸碱处理，然后再进行转型处再生：先经酸碱处理，然后再进行转型处理。理。5 凝胶色谱凝胶色谱 又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。质分离的一种层析技术。5.1 原理原理 运动：垂直向下地移动和无定向地分子扩散运动：垂直向下地移动和无定向地分子扩散运动运动(布朗运动布朗

19、运动)分子筛效应分子筛效应:小分子物质自由进入网孔，线路长，移动慢，最小分子物质自由进入网孔，线路长，移动慢，最后流出。后流出。大分子物质不进入网孔，线路短，移动快，最先大分子物质不进入网孔，线路短，移动快，最先流出。流出。大小适中的物质，选择性地进入网孔，按分子大大小适中的物质，选择性地进入网孔，按分子大小有序流出。小有序流出。 为了定量的衡量样品中各组分的流出顺序，为了定量的衡量样品中各组分的流出顺序，常用分配系数常用分配系数Ka来度量：来度量：Ka=（VeVo)/ViVe 为洗脱体积，为洗脱体积，Vo为外体积，为外体积，Vi为内体积为内体积Ka=0时，该组分子完全不进入凝胶颗粒微孔，洗时

20、，该组分子完全不进入凝胶颗粒微孔，洗脱时最先流出；脱时最先流出； Ka=1时，小分子物质自由进入网孔，洗脱时最后时，小分子物质自由进入网孔，洗脱时最后流出；流出；Ka在在0和和1之间，分子介乎大分子和小分子之间，之间，分子介乎大分子和小分子之间，洗脱时洗脱时Ka值小的先流出，值小的先流出，Ka值大的后流出。值大的后流出。5.2 凝胶地选择与处理凝胶地选择与处理 干胶溶涨干胶溶涨(悬浮于悬浮于510倍量的洗脱液中，常倍量的洗脱液中，常温，热法温，热法/还可达到消毒灭菌和排除凝胶内气还可达到消毒灭菌和排除凝胶内气泡的目的泡的目的)，抽真空去气泡，配样品的溶液与，抽真空去气泡，配样品的溶液与洗脱液要

21、使用同一溶剂同一缓冲液。装柱，加洗脱液要使用同一溶剂同一缓冲液。装柱，加样与洗脱。样与洗脱。常用的凝胶：常用的凝胶：p葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶p琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶p聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶p在有机溶剂中使用的凝胶在有机溶剂中使用的凝胶5.3 应用应用a 蛋白质，酶，激素等大分子的分离纯化；蛋白质，酶，激素等大分子的分离纯化；b 蛋白质溶液脱盐，脱糖，脱脂；蛋白质溶液脱盐，脱糖，脱脂；c 蛋白质，酶，激素等大分子的分子量测定蛋白质，酶，激素等大分子的分子量测定。5 亲和色谱亲和色谱5.1 原理原理 利用分子与配基之间所具有的专一而又利用分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使分子分离纯

22、化的技术。可逆的亲和力，而使分子分离纯化的技术。 酶与底物，酶与竞争性抑制剂，酶与辅酶与底物，酶与竞争性抑制剂，酶与辅助因子，抗原与抗体，助因子，抗原与抗体，RNA与互补的与互补的RNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。因此，亲和层析在酶亲和力的生物分子对。因此，亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用。的分离纯化中有重要应用。吸附色谱吸附色谱离子交换色谱离子交换色谱空间排阻色谱空间排阻色谱分配色谱分配色谱定义定义 利用吸附剂对利用吸附剂对各组分的吸附各组分的吸附力不同而实现力不同而实现分离分离 利用离子交换剂上利用离子交换剂上的可解离基团（活的可解离基团（活性基团）对各种离性基团）对各种离子的亲和力不同而子的亲和力不同而实现分离实现分离 以各种凝胶为固定相，利以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而实现相对分子质量不同而实现物质分离物质分离 利用各组分的分配