紫外分光光度法测定核苷酸含量ppt课件

1、实验二：实验二：核酸的紫外扫描及含量测定核酸的紫外扫描及含量测定实验目的实验目的1.了解紫外分光光度计的根本原理并掌握其运用方法。 2.掌握运用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和方法。实验原理实验原理 核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键，具有紫外吸收。RNA和DNA的紫外吸收峰为260nm。普通在260 nm波长下，每毫升含1mg DNA溶液的光吸收值约为0.020，每毫升含1mgRNA溶液的光吸收值为0.022。故测定待测浓度RNA或DNA溶液260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。假设样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，那么测定误差较大，故应设

2、法事先除去。纯真的RNA溶液，其A260/A2802；纯真的DNA溶液，其A260/A2801.8。 实验原理实验原理v假设知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多假设知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液(2050mg/mL)，在紫外分光光度计上直接测定。在紫外分光光度计上直接测定。 v 蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收顶峰在蛋白质的吸收顶峰在280nm处，在处，在260nm处的吸收值仅为处的吸收值仅为核酸的非常之一或更

3、低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的非常之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。核酸的紫外测定影响不大。 v RNA在在260nm与与280nm处的吸收比值在处的吸收比值在2.0以上，以上，DNA的的比值那么在比值那么在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即左右。当样品中蛋白质含量较高时，比值即下降。下降。 实验器材实验器材v1.UV-1000型紫外可见分光光度计型紫外可见分光光度计 v操作指南：操作指南：v1. 翻开仪器电源，系统自检，并预热翻开仪器电源，系统自检，并预热20min。v2. 选择选择“光度丈量，按光度丈量，按“enter进入吸光度丈量。进入

4、吸光度丈量。v3. 关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中，关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中，按按“enter进入后，系统自动调整投射比为进入后，系统自动调整投射比为100%和和0%。v4. 关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中，关上暗盒盖，将装参比液的比色皿，推入光路中，按按“zero键调使吸光度键调使吸光度A为为0.000。v5. 丈量样品。将被测溶液推入光路中，待读数稳定丈量样品。将被测溶液推入光路中，待读数稳定后，读取吸光度。后，读取吸光度。v6. 仪器运用终了，取出比色皿，洗净、晾干。仪器运用终了，取出比色皿，洗净、晾干。v7. 封锁电源开关，拔下电源插头，复原仪

5、器。封锁电源开关，拔下电源插头，复原仪器。v8. 登记登记v关于比色皿：比色皿的前后有关于比色皿：比色皿的前后有2个光滑面，是用来对准光路的，个光滑面，是用来对准光路的，左右有左右有2个粗糙面，手只能拿比个粗糙面，手只能拿比色皿的粗糙面，不能接触光滑色皿的粗糙面，不能接触光滑面。比色皿的内部的清洗只能面。比色皿的内部的清洗只能用蒸馏水润洗用洗瓶，不用蒸馏水润洗用洗瓶，不可用卫生纸或其他物品捅进去可用卫生纸或其他物品捅进去擦洗，比色皿的擦洗，比色皿的2个光滑面一定个光滑面一定要坚持清洁，如发现有指纹或要坚持清洁，如发现有指纹或残液，须用卫生纸悄然擦拭干残液，须用卫生纸悄然擦拭干净。比色皿是成套发

6、放的，严净。比色皿是成套发放的，严禁混用，本实验运用的是石英禁混用，本实验运用的是石英比色皿。运用终了后先用自来比色皿。运用终了后先用自来水内外冲洗干净比色皿，再用水内外冲洗干净比色皿，再用洗瓶冲洗比色皿的内外外表洗瓶冲洗比色皿的内外外表1次，次，将其粗糙面朝下斜靠在培育皿将其粗糙面朝下斜靠在培育皿中。中。2.取样器：参见实验一，取样器：参见实验一，10uL、200uL各各1支支/组。组。 v运用指南：接好套头不漏气运用指南：接好套头不漏气经过旋钮调理容量如经过旋钮调理容量如500表示表示5mL用活塞第一挡吸液用活塞第一挡吸液用活塞第一挡和第二挡放液用活塞第一挡和第二挡放液换套头换套头继续运用。继续运用。留意，平常取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中留意，平常取样器应挂在架子上，绝不可倒置，以免溶液倒流入枪体中而损坏仪器。而损坏仪器。 v3.其他器材：试管，试管架、烧杯、卫生纸。其他器材：试管，试管架、烧杯、卫生纸。 v实验试剂实验试剂v1. 蒸馏水蒸馏水 v2. 待测的待测的DNA溶液溶液 样品测定：样品测定：1. 取两个比色皿，一个加蒸馏水做空取两个比色皿，一个加蒸馏水做空白对照。一个用来加白对照。一个用来加DNA样品。样品。2. 取取10uL的的DNA样品样品, 参与参与1990u